全 文 ：粉防己碱 、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱增强长春新碱
诱导人乳腺癌MCF-7多药耐药细胞凋亡
叶祖光＊ , 王金华 , 孙爱续 , 梁爱华 , 薛宝云 , 李春英 , 王　岚
(中国中医研究院中药研究所 ,北京 100700)
摘要:目的　观察粉防己碱 、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱与长春新碱合用对多药耐药肿瘤细胞诱导凋亡的作用。 方
法　采用荧光染料 Hoechst 33342 和碘化丙锭联染技术 、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳技术 ,检测长春新碱及其与上
述单体合用诱导耐药株瘤细胞 MCF-7/ Dox 的凋亡程度。结果　单用长春新碱可引起约 10%细胞凋亡 , 而长春新碱
与粉防己碱 、甲基莲心碱或蝙蝠葛碱合用明显地增加细胞凋亡的百分率 , 其中粉防己碱的作用最强。联合用药的细
胞凋亡数显著地大于单用长春新碱的作用。结论　粉防己碱 、甲基莲心碱和蝙蝠葛碱均有明显的增强长春新碱诱
导人乳腺癌 MCF-7 多药耐药细胞的凋亡作用。
关键词:粉防己碱;甲基莲心碱;蝙蝠葛碱;长春新碱;细胞凋亡;多药耐药性
中图分类号:R329.26　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2001)02-0096-04
　　抗肿瘤药物杀死肿瘤细胞的分子机制 ,基本上
通过诱导肿瘤细胞凋亡而起作用[ 1] ,但肿瘤细胞的
多药耐药性使抗肿瘤药物难以奏效 ,其耐药机制除
涉及 P-糖蛋白等多种分子外 ,还与抗细胞凋亡有
关[ 2 ,3] 。换言之 ,肿瘤细胞对化疗药物的耐药性 ,既
可能表现为多药耐药性 ,又可能同时表现为抗细胞
凋亡作用 。因此 ,寻找既有逆转多药耐药性 ,同时又
逆转抗细胞凋亡作用的药物 ,是克服肿瘤耐药性的
一个重要途径。我们以前的研究证明粉防己碱能有
效地逆转人乳腺癌 MCF-7耐药细胞对阿霉素的耐
药性[ 4] ,同时 ,有实验证明甲基莲心碱和蝙蝠葛碱
也有逆转肿瘤多药耐药性的作用[ 5] 。这3种有逆转
活性的化合物是否也有逆转肿瘤细胞抗细胞凋亡的
作用值得进一步研究 。本文旨在实验观察上述 3种
中药单体能否增强长春新碱诱导多药耐药的肿瘤细
胞凋亡作用 ,以期发现既有调节多药耐药性 、又有逆
转抗凋亡活性的“双赢”药物。
材 料 和 方 法
　　药物　粉防己碱(tet randrine , Tet)购自浙江金
收稿日期:2000-5-15
基金项目:国家自然科学基金资助项目(99770915)
作者简介:叶祖光 ,男 ,研究员.
＊Tel:(010)67059643 , Fax:(010)67012861 ,
E-mail:yezuguang@sohu.com
华制药厂;甲基莲心碱(neferine , Nef)和蝙蝠葛碱
(dauricine ,Dau)为同济医科大学馈赠。3种化合物
均用少量 1.0 mol·L-1 HCl溶解后 ,加生理盐水配
成 1 mmol·L-1 贮存液 。长春新碱(vincristine ,
VCR)购自北京医科大学实验药厂 ,用生理盐水配
成的 1 mmol·L-1母液 ,以上药物使用时均用培养液
配成一系列的稀释液。
　　细胞培养　人乳腺癌 MCF-7细胞及耐 Dox 的
MCF-7细胞(MCF-7/Dox)由美国国立癌症研究所
(NCI)Dr Kenneth H Cow an馈赠 ,用含 10%胎牛血
清(hyclone)的 RPM I1640 培液(GIBCO)在 37℃,
5%CO2 培养约 2个月 ,用 5 μmol·L-1 Dox 处理耐
药细胞 1周 。脱药后 2周 ,耐药细胞可用于实验 。
　　荧光显示法观察染色质凝集 　用特异结合
DNA 的荧光染料 Hoechst 33342 和碘化丙锭
(propidium iodide ,PI)进行联染 ,其原理是凋亡细胞
的染色质发生凝集 ,但细胞膜仍保持完整 , PI 仅能
透过坏死的细胞膜 ,紫外光激发下发红色的荧光;
Hoechst 33342为脂溶性的染料 ,能透过完整的细胞
膜 ,紫外光激发下发蓝白色的荧光。将对数生长期
的细胞接种于 12孔板中 ,每孔 1×105 个细胞 , 24 h
后加药 ,加药后 24和 36 h ,用 0.25%胰酶+0.02%
EDTA(1∶1)分离细胞 , 用无血清培液洗 1 次 , 加
Hoechst 33342 5 μg·mL-1及 PI 40 μg·mL-1 , 37℃
染色 10 min后 ,紫外光激发 ,荧光显微镜下统计 PI
阳性细胞(坏死细胞)、PI 阴性且染色质发生凝集的
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细胞(凋亡细胞)和 PI 阴性且染色质未发生凝集的
细胞(活细胞)的数量 ,每种样品至少统计 100 个细
胞以上 ,同时拍摄药物处理后的凋亡细胞图像 。实
验至少重复 2次 ,结果以凝集的细胞数(凋亡细胞)
占总细胞数的百分比表示 。
　　流式细胞术　细胞经胰酶消化后 ,用冷磷酸盐
缓冲液(PBS)洗 2次 ,70%乙醇固定细胞24 h以上 。
测定前离心去 乙醇 , 用 PBS 洗 3 次 , 加 100
μg·mL-1 RNase 37℃消化 30 min , PI 50 μg·mL-1
染色 30 min以上 ,经尼龙网过滤后 ,用流式细胞仪
FACS420测定 ,结果经计算机软件处理 ,计算出凋
亡细胞的百分比 。
　　琼脂糖凝胶电泳　按常规方法提取肿瘤细胞
DNA
[ 6] ,提取的 DNA 以每孔 5.0 μg 上样 ,在 1.5%
琼脂糖凝胶中电泳 3 -4 h , 然后在紫外灯下观察
DNA泳带并拍摄照片 。
结 果
1　荧光显示法观察 Tet , Dau , Nef 与 VCR合用对
MCF-7/Dox耐药细胞凋亡的影响
VCR 5μmol·L-1处理耐药细胞 ,细胞的凋亡率
为10%,凋亡细胞的染色质形态以浓缩成球形居
多 ,这与许多凋亡细胞出现点状凝集的染色质有所
不同 。单用 Tet , Dau或Nef处理 MCF-7/Dox 细胞 ,
其细胞凋亡率均<5%。而VCR分别与 Tet ,Dau或
Nef合用处理细胞 24 h ,36 h后 ,细胞凋亡率则明显
增加(表 1)。所有药物处理组的 PI 阳性率均在
10%以下 。在 5 μmol·L -1的低浓度时 , 3种受试化
合物便表现有逆转细胞抗凋亡活性 ,而在较高浓度
(20 μmol·L-1)时 ,其逆转抗凋亡活性更为明显。比
较 3种受试化合物不同浓度和不同作用时间的逆转
抗细胞凋亡的活性 ,其逆转作用随浓度加大或作用
时间的延长而增强 。此外 ,比较 3种化合物的逆转
作用强度依次为:Tet>Nef>Dau。另外 ,也观察到
Tet与 VCR 合用处理敏感 MCF-7 细胞 ,可明显增
强 VCR诱导的凋亡活性(结果未显示)。
2　流式细胞术检测凋亡细胞
使用流式细胞术 ,从组方图“G1亚峰”的出现情
况可检测凋亡细胞 。但 VCR单独作用于敏感和耐
药的 MCF-7细胞时 ,甚至在高浓度(50 μmol·L -1)
下 ,也未检测到“G1 亚峰”(结果未显示)。但从散点
图上通过判别体积减少的细胞(象限 4), 也能检测
Tab 1　The percentages of apoptotic MCF-7/Dox
cells effected by the combinations of vincristine
(VCR)with tetrandrine(Tet), neferine (Nef)or
daurine(Dau).n =6 , x ±s , ＊＊ P <0.01 vs
VCR alone group
C oncentration/
μmol·L -1
Percentages of apoptot ic cells / %
24 h 36 h
Control 1.0±0.6 1.3±1.7
VCR(5) 6.4±1.9 10.7±2.8　
Tet(5) 1.8±1.2 2.9±1.0
(20) 3.2±0.7 3.4±0.9
Tet(5)+VCR(5) 23±4＊＊ 32±5＊＊
Tet(20)+VCR(5) 34±6＊＊ 41±6＊＊
Control 0.9±0.8 1.1±1.2
VCR(5) 7.0±2.4 12±4　
Nef(5) 1.7±1.1 2.3±1.2
(20) 2.2±0.6 1.1±1.2
Nef(5)+VCR(5) 14±4＊＊ 25±6＊＊
Nef(20)+VCR(5) 28±6＊＊ 39±8＊＊
Control 2.8±0.7 1.0±0.7
VCR(5) 10.1±2.1　 10.0±2.7　
Dau(5) 0.9±1.0 0.9±1.2
(20) 2.0±3.0 0.6±1.1
Dau(5)+VCR(5) 11.9±1.3　 13.9±1.8　
Dau(20)+VCR(5) 19.2±1.8＊＊ 26±5＊＊
凋亡细胞(图 1)。3 种药物(20 μmol·L-1)与 VCR
(5 μmol·L-1)合用 ,处理耐药细胞 36 h 后 ,凋亡率
分别为 23.0%, 19.4%和 17.5%,该值比荧光显示
法低。
3　琼脂糖凝胶电泳检测凋亡细胞
VCR单独或与 3种药物(均为20μmol·L-1)合
用处理耐药细胞 36 h后 ,均未出现 DNA梯带 ,仅为
弥散 的 DNA 泳 带 。我 们 曾 用 VCR (5 , 50
μmol·L-1)处理敏感和耐药的 MCF-7细胞 24 h ,也
仅观察到弥散的 DNA 泳带(结果未显示)。本结果
说明VCR引起MCF-7细胞凋亡时 ,不出现DNA梯
带 ,因此无法根据电泳的结果确定凋亡细胞的变化。
讨 论
本文通过细胞形态观察和流式细胞术两种检测
细胞凋亡的实验方法 ,证明了 Tet , Nef 和 Dau 这 3
种化合物具有明显的增强长春新碱诱导 MCF-7/
Dox 细胞凋亡作用 。比较这 3种化合物的增强作用
强度 ,其中以 Tet 的逆转活性最为明显 。本结果与
Tet ,Nef和 Dau 3种化合物对肿瘤细胞多药耐药性
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Fig 1　The do t-profiles by flow cytometry in the MCF-7/Dox cells
A.Control;B.Vincristine alone fo r 36 h;C.Vincristine plus tet randrine for 36 h;
D.Vincristine plus neferine for 36 h;E.Vincristine plus dauricine for 36 h
的逆转强度相吻合[ 5] 。关于这些药物增强诱导细
胞凋亡作用的分子机制 ,我们正从细胞内游离钙的
分布 、蛋白激酶 C 的活性以及 mdr-1基因表达等方
面进行深入的研究。
本实验中采用流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳法
检测 VCR所诱导的细胞凋亡作用 ,并未观察到“G1
亚峰”(凋亡峰)和 DNA 梯带 ,这与其他抗肿瘤药物
所诱导的细胞凋亡表现迥然不同 ,这可能与 VCR
的作用特点 ,尤其是和 MCF-7细胞的生物学特性有
关。
REFERENCES:
[ 1] Hickman JA.Apoptosis induced by anticancer drug [ J] .
Cancer Metastasis Rev , 1992 , 11(1):121-139.
[ 2] Smy th MJ , Krasovskis E , Sutton VR , et al.The drug
efflux protein , additionally pro tects drug-resistant tumor
cells from multiple fo rms o f caspase-dependent apoptosis
[ J] .Proc Natl Acad Sci USA , 1998 , 95(12):7024 -
7029.
[ 3] Robinson LJ , Roberts WK , Lamming D , et al .Human
MDR1 protein overexpression delay s the apoptotic cascade
in Chinese hamster ovary fibroblasts [ J] .Biochemistry ,
1997 , 36(37):11169-11178.
[ 4] Ye ZG , Sun AX , Li LF , et al .Reversal of drug
resistance by tetrandrine in doxo rubicin-resistant o r
vincristine-resistant human cancer cells [ J] .Chin J Mat
Med (in Chinese), 1996 , 21(6):369-371.
[ 5] Pan QC , Tian H.Reversal of tumor multidrug resistance
by multiple Chinese medicine entities [ J] .Chin Sci Bull
(in Chinese), 1995 , 40(20):1901-1904.
[ 6] Fang M , Zhang HQ , Xue SB , et al. Apoptosis
resistance and its reversal in harringtonine resistant cell
line [ J] .Acta Pharm Sin (in Chinese), 1994 , 29(12):
891-898.
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POTEINTATION OF VINCRISTINE-INDUCED APOPTOSIS
BY TETRANDRINE , NEFERINE AND DAURICINE IN THE
HUMAN MAMMARY MCF-7 MULTIDRUG-RESISTANT CELLS
YE Zu-guang , WANG Jin-hua , SUN Ai-xu , LIANG Ai-hua , XUE Bao-yun , LI Chun-ying , WANG Lan
(Insti tute of Chinese Materia Medica , China Academy of Traditional
Chinese Medicine , Beijing 100700 , China)
ABSTRACT:AIM 　To investigate the poteintation of vincristine-induecd apoptosis by tetrandrine ,
neferine and dauricine isolated f rom Chinese medicinal plants in the human mammary MCF-7 multidrug resistant
cells.METHODS　The apoptotic cells w ere detected by fluorescent staining of a combination of Hoechst 33342
and propidium iodide(PI), flow cy tometry and agarose elect rophoresis.RESULTS　The apoptotic cells induced
by vincristine alone accounted for about 10% of all the cancer cells , while the percentage of apopto tic cells
induced by a combination of vincristine wi th tet randrine , neferine , or dauricine w as found to be significantly
higher than that by vincristine alone , and their reversal ef fects w ere positively correlated w ith the drug
concentration and the exposure t ime.In addition , tet randrine w as show n to be the most potent in the reversal
eff icacy among the three compounds to be tested for apoptosis in vit ro.CONCLUSION　Tetrandrine , neferine
and dauricine show ed obvious potenitiation of vincristine-induced apoptosis in the human mammary MCF-7
multidrug-resistant cells.
KEYWORDS:tetrandrine;neferine;dauricine;vincristine;apoptosis;multidrug resistance
声　　明
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