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紫花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种F_1代的离体繁殖



全 文 :植物生理学通讯 第42卷 第3期,2006年 月 461
紫花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种F1代的离体繁殖
傅旭阳1,2 孙卫邦1,*
1中国科学院昆明植物研究所,昆明650204;2中国科学院研究生院,北京100039
提要 当年8月份至次年3月份采集紫花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种F1代优良单株的顶芽和侧芽,置于H+0.25 mg·L-1
6-BA+0.125 mg·L-1 NAA+0.10 mg·L-1 KT+0.05 mg·L-1 IAA上培养,不定芽诱导率可达115% ;诱导的不定芽在H+0.3 mg·L-1
6-BA+0.3 mg·L-1 KT培养基中增殖及生长较好。经过壮苗后的芽条在H+2.8 mg·L-1 NAA上的生根率可达100%,且单株
根数多,芽条生长健壮。间苯三酚(phloroglucinol)明显促进根的发生,但对根的后期生长有一定的抑制效应。组培苗移栽
至红土:腐殖土:珍珠岩=1:1:1的混合基质中,60 d时成活率可达90%左右。
关键词 紫花含笑(♀)×钙土含笑(♂) ;杂种F1代 ;离体培养
In vitro Culture of Hybrid F1 of Michelia crassipes Law (♀) ×Michelia calcicola
C. Y. Wu ex Law et Y. F. Wu (♂)
FU Xu-Yang1,2, SUN Wei-Bang1,*
1Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China; 2Graduate School of Chinese Academy of
Sciences, Beijing 100039, China
Abstract The top buds and axillary buds of the hybrid F1 saplings of Michelia crassipes Law (♀) ×Michelia
calcicola C. Y. Wu ex Law et Y. F. Wu (♂) were collected from August to next March and cultured on the
medium H+0.25 mg·L-1 6-BA+0.125 mg·L-1 NAA+0.10 mg·L-1 KT+0.05 mg·L-1 IAA, and the rate of adventi-
tious buds reached about 115%. The adventitious buds were cultured on the medium H+0.3 mg·L-1 6-BA+0.3
mg·L-1 KT, the proliferation and growth were better. When the shoots were cultured on medium H+2.8 mg·L-1
NAA, the rooting percentage was 100%. Phloroglucinol could greatly promote the shoot rooting, but it might
restrain the root elongation. The well-rooted shoots were transplanted into composts (red soil, humus and
perlite mixed with same volume) and the survival rate reached 90% after 60 days.
Key words Michelia crassipes Law (♀) ×Michelia calcicola C. Y. Wu ex Law et Y. F. Wu (♂); hybrid F1; in
vitro culture
收稿 2005-11-15修定  2006-04-20
资助  中国科学院知识创新工程西南基地创新基金(I-29)。
*通讯作者(E-mail: wbsun@mail.kib.ac.cn, Tel: 0871-
5223622)。
木兰科植物在我国自然分布的有11属,130
种,占世界总属的73%,总种的37% (黎明和马
焕成2003)。紫花含笑(Michelia crassipes L w)和
钙土含笑(Michelia calcicola C. Y. Wu ex Law et Y.
F. Wu)均为观赏价值较高的常绿木兰科含笑属植
物,两者在形态上差异很大。前者的株型紧凑,
多呈灌木状,叶片较小,花紫色、小而芳香,
已被广泛栽培应用;后者为小乔木,叶片大,花
黄色、大而芳香。为了深入利用木兰科植物资
源,培养更具观赏价值的新品种,我们于2001年
以紫花含笑为母本与钙土含笑进行人工杂交,获
得了几粒杂交种子,常规播种后获得杂种F1代幼
苗并进行露地栽培,植株生长发育良好。木兰科
植物的营养繁殖多以嫁接和压条为主,扦插和组
培生根甚为困难。目前,有关木兰科植物的离体
培养仅有含笑属(紫花含笑和钙土含笑均未见报
道)、木兰属、鹅掌楸属以及拟单性木兰属的一
些种类有过报道(曾宋君等2000;柳蔓琼和梁士观
1985; 黎京度和佘诗群1988;张林1992;刘贤
旺等1997;陈金慧等2002;苏梦云和姜景民
2004;陈芳等2005)。为了尽快实现紫花含笑(♀)
×钙土含笑(♂)杂种F1代的开发,为其大量繁殖作
技术准备,并为其它木兰科植物的组织培养和快
速繁殖提供参考,两年多来我们选择紫花含笑
(♀)×钙土含笑(♂)杂种F1代生长健壮的单株,开
展了其离体繁殖技术研究,着重解决生根难的问
DOI:10.13592/j.cnki.ppj.2006.03.016
植物生理学通讯 第42卷 第3期,2006年 月462
题,建立了完整的离体繁殖体系,现报道如下。
材料与方法
以紫花含笑(Michelia crassipes Law) (♀ ×钙
土含笑(Michelia calcicola C. Y. Wu ex Law et Y. F.
Wu) (♂)杂种F1代生长健壮的三年生单株为材料。
于不同生长季节采集当年新生的顶芽或带腋芽的茎
段为外植体,切成约2 cm长茎段,用自来水冲
洗2~3 h后,先用75%酒精浸泡30 s, 再用0.1%
升汞灭菌2~5 min,无菌水冲洗5~6次,然后在
无菌操作台上,去除芽的外层苞片并接种到不同
培养基上进行诱导培养,比较不同培养基对外植
体诱导的影响及不同采集季节外植体的污染情况。
将诱导产生的不定芽转移到添加不同种类及浓度生
长调节物质的H培养基(Bourgin和N tsch 1967)上
进行增殖培养,比较不同培养基组成对芽增殖的
影响,以筛选适宜的增殖培养基。选取高3 cm
左右的增殖培养芽条,在MS+6-BA 0.10 mg·L-1
(单位下同) +NAA 0.05培养基中壮苗培养30 d后,
转移到以1/2MS、1/4MS和H为基本培养基添加
不同生长调节物质及浓度的培养基中诱导生根。
根长出2 cm左右,株高约3 cm时,生根苗连
瓶置于阴凉处适应1 d,然后取出小苗用自来水洗
净基部的培养基后,移栽至红土:腐质土:珍珠岩
=1:1:1的混合基质中,浇透水后覆膜保湿并遮
光,观察统计移栽成活情况。
不定芽诱导的每个处理20个芽条,继代培养
和生根培养的每个处理10个芽条,所有处理均重
复3次,取其平均值进行分析比较。培养基均用
0.7%琼脂固化,pH 5.8,以蔗糖为碳源,含糖
量为2%。培养条件为:温度(25±2)℃,光照12
h·d-1,光强30~40 mmol·m2·s-1。
实验结果
1 不定芽的诱导
图1和表1显示:
(1) 2、6、9、12月份选取当年新抽出的嫩
枝,每次采集60个顶芽或带腋芽的茎段作为外植
体,灭菌后接种于H+6-BA 0.25+NAA 0.125+KT
0.10+IAA 0.05上进行诱导培养,40 d后统计其
污染率、死亡率、不定芽诱导率的结果表明,9
月份和12月份采集的外植体的污染率低,不定芽
的诱导率在75%以上,6月份的死亡率和污染率
都比较高,而2月份采集的外植体未见死亡,但
其污染率在50%以上(图1)。在昆明地区温度和湿
度较高的4月份至8月份,植物生长发育旺盛,
小芽裸露在外,其表面附着有较多的病原体,消
毒困难;9月份至次年3月份气候干燥凉爽,是
休眠芽形成期,芽外包裹着数层苞片,病菌不易
侵入到芽内,外植体容易灭菌。因此,我们认
为在昆明地区以当年9月份至次年3月份采集外植
体为宜,这样有利于不定芽的诱导。
(2)外植体接种到以H为基本培养基添加不同
浓度6-BA、NAA、KT和IAA的培养基中培养约
14 d,外植体基部开始出现愈伤组织,40 d后不
定芽开始萌发生长,60 d时统计的结果(表1)表
明,其不定芽诱导率比不加生长调节物质高出
40%以上,愈伤组织诱导率达到55%,不加生长
调节物质的未见愈伤组织的发生。据此认为,基
本培养基H能诱导紫花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂
种F1代不定芽的产生,添加一定浓度的生长调节
物质后可提高其不定芽诱导率。
2 不定芽的继代培养
将初代培养得到的不定芽切割成单节后接种
图1 采集季节对不定芽诱导的影响
Fig.1 Shoot inducement of the explants
collected from different seasons
表1 附加生长调节物质对不定芽诱导的影响(H培养基)
Table 1 Effects of different growth regulator combinations on
adventitious bud induction
生长调节物质浓度/ mg·L-1 不定芽 愈伤组织
6-BAN A A KT IAA 诱导率/% 诱导率/%
0 0 0 0 60 0
0.250.1250.10 0.05 115 55
植物生理学通讯 第42卷 第3期,2006年 月 463
到含有不同种类及浓度生长调节物质配比的H培
养基中,共14个处理,约40 d芽的增殖达到最
高峰。统计(表2)显示,细胞分裂素类似物/生长
素类似物的比例对不定芽增殖的影响最大,比例
大的会有较高的增殖率,但易出现脆化的不定
芽;丛芽随着6-BA 浓度的增加而增多,但当6-
BA浓度>0.30 mg·L-1时,节间缩短明显,腋芽减
少,实际增殖倍数减少;添加KT能促进不定芽
的增殖效果,但当6-BA≥0.50 mg·L-1时,这种
作用变得不明显;KT与GA均可促进不定芽增
殖,但有IBA时KT的效果更显著。由表2可知,
H+6-BA 0.30+KT 0.30是紫花含笑(♀)×钙土含笑
(♂)杂种F1代较适宜的增殖培养基。
3 生根诱导培养
增殖的丛芽切割成单芽后接种到壮苗培养基
MS+6-BA 0.10+NAA 0.05中培养30 d后,选择生
长健壮,高约2.5 cm芽条转入以1/4MS、1/2MS
或H为基本培养基并添加不同生长调节物质和间
苯三酚(phloroglucinol, PG)的培养基中进行生根诱
导培养,共24个处理。约18 d芽条开始生根,
40 d时统计生根的结果(表3、4)表明,IAA对根
的诱导作用不显著,而NAA、IBA及PG的作用
则非常明显。较高浓度NAA中的生根率高,且
单株生根多,但浓度过高的NAA对根生长不利;
在培养基中添加PG后能显著提高各种生长调节物
质水平下的生根率,且单株生根更多,根径粗壮
(表3、4) ;NAA和IBA对生根诱导培养的作用基
本相当,二者可相互取代(表3)。比较3种培养
基(H、1/2 MS和1/4MS)对根诱导的结果显示,H
培养基的生根诱导效果优于1/2MS和1/4MS培养
基(表4)。根据以上结果可以认为,适宜紫花含
笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种F1代生根的培养基是
H+NAA 2.80。
表2 不同种类及浓度生长调节物质对不定芽继代培养的影响(H培养基)
Table 2 Effects of different growth regulators and their concentrations on subculture of adventitious buds
生长调节物质浓度/mg·L-1
增殖倍数 生长状况
6-BA K T G A IBA
0.30 0.30 0 0.20 5.60 叶黄绿色,微卷
0.30 0 0.30 0.20 3.40 叶嫩绿色, 微卷
0.30 0.30 0 0 4.50 叶嫩绿色,大而伸展
0.30 0 0.30 0 4.80 叶嫩绿色,微卷
0.30 0 0 0.10 3.60 叶嫩绿色,大而伸展
0.60 0 0 0.20 3.40 叶嫩绿色,大而伸展
0.20 0 0 0.05 6.20 叶绿色,茎叶脆化
0.20 0.20 0 0.10 3.00 叶黄绿色,茎叶脆化
0.20 0.50 0 0.20 4.50 叶绿色 微卷
0.20 1.00 0 0.50 2.00 叶绿色 微卷
0.50 0 0 0.10 2.90 叶绿色,微卷
0.50 0.20 0 0.05 2.50 叶绿色,微卷
0.50 0.50 0 0.50 2.80 叶绿色,微卷
0.50 1.00 0 0.20 2.40 叶绿色,微卷
表3 不同种类和浓度生长调节物质配比对杂种
F1代生根诱导的影响(H培养基)
Table 3 Effects of different growth regulators and their
concentrations on rooting of the hybridF1
生长调节物质浓度/ mg·L-1
生根率/% 平均根数/条
NAA IBA IAA
1.00 0 0 30 0.50
1.00 1.00 0 100 2.30
1.00 0 1.00 00
0.50 0.50 0.50 20 0.20
2.00 0 0 40 0.70
2.40 0 0 100 3.60
2.80 0 0 100 4.30
3.20 0 0 100 3.90
3.60 0 0 100 4.40
4.00 0 0 100 4.30
植物生理学通讯 第42卷 第3期,2006年 月464
表4 培养基种类和间苯三酚对杂种F1代生根的影响
Table 4 Effects of different media and phloroglucinol on
rooting of the hybrid F1
生长调节物质浓度/mg·L-1
培养基 生根率/% 根数/条
NAA IBA间苯三酚
H 0.40 0.60 1.00 60 1.80
0.60 0.40 1.00 100 3.30
0.50 1.50 1.00 100 3.60
1.50 0.50 1.00 100 3.40
1/4MS0.40 0.60 1.00 70 2.10
0.60 0.40 1.00 65 1.80
0.50 1.50 1.00 100 3.20
1.50 0.50 1.00 85 1.90
1/2MS0.40 0.60 1.00 85 1.80
0.60 0.40 1.00 60 1.90
0.50 1.50 1.00 100 3.00
1.50 0.50 1.00 65 2.10
0.50 1.00 0 55 1.80
1.00 0.50 0 85 2.50
4 试管苗移栽
将植株高度在4 cm左右、生根良好的瓶苗
置于阴凉处适应1 d后,轻轻取出小苗,用自来
水洗净基部的培养基,移栽至红土:腐质土:珍珠
岩=1:1:1的混合基质中,浇透水后以塑料薄膜覆
盖,遮光约50%。14 d左右新叶开始萌发生长,
此时移去塑料薄膜和遮光材料后,幼苗即逐渐生
长。移栽60 d时的成活率可达90%左右,株高
达30 cm左右时即可盆栽(图未列出)。
讨  论
一般说来,木本植物的组织培养生根都比较
困难,原始的木兰科植物的组织培养也存在褐
化、玻璃化以及生根难等问题(刘玉壶2004)。近
年来有关木兰科植物组织培养的研究报道逐渐增
多,其中有落叶木兰属植物(张林1992;刘贤旺
等1997;黎明和马焕成2003)和鹅掌楸属植物(陈
金慧等2002),也有常绿类群(柳蔓琼和梁士观
1985;Luo和Sun 1996;曾宋君等2000;苏梦
云和姜景民2004;陈芳等2005),但迄今适宜木
兰科植物规模化生产的组培快繁技术尚未见报道。
我们在紫花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种F1代离体
培养研究中,采用低盐的1/2MS、1/4MS和H培
养进行培养时发现,当培养温度超过30℃时其褐
化现象呈明显上升趋势,而在20~25℃培养时其
褐化现象较弱,并不影响芽条的正常生长。在紫
花含笑(♀)×钙土含笑(♂)杂种F1代的生根诱导培
养中还发现,其生根需要较高浓度的NAA (2.40~
4.00 mg·L-1),在低浓度的NAA培养基中附加一定
浓度的IBA也能较好的诱导生根。据报道辅助物
间苯三酚可促进木本植物生根(李浚明2002),本
文结果显示,间苯三酚对紫花含笑(♀)×钙土含笑
(♂)杂种F1代不定根的诱导亦有明显的促进作用,
生根整齐,根径粗壮,但对根的后期生长有一定
的抑制作用,同时还会诱导愈伤组织的发生。一
些研究还显示,低盐环境有利于木兰属杂种的离
体培养(Biedermann 1987),本文结果表明,低盐
的H培养基比MS培养基更适合紫花含笑(♀)×钙
土含笑(♂)杂种F1代离体培养,基本解决了这组
杂种F1代离体培养中褐化和生根问题,从而为其
批量繁殖和开发利用建立了前提。
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