全 文 ：·研究原著 · 文章编号:1000-2790(2008)23-2141-03
毛脉酸模中二苯乙烯类成分对 HepG2细胞肿瘤相关基因表达的影响
王振月 1 ,唐先明 1, 2 ,赵海鹏 1, 3 ,王宗权 1, 4 ,陈智岩1　
(1黑龙江中医药大学药学院 ,黑龙江 哈尔滨 150040, 2哈尔滨市食品药品检验检测中心 ,黑龙江 哈尔滨 150525, 3鲁南制药集团
股份有限公司 , 山东 临沂 276005, 4以领医药集团医药研究院 ,河北 石家庄 050035)
收稿日期:2008-05-08;　接受日期:2008-06-26
基金项目:黑龙江省自然科学基金重点项目(ZJY005006-02);黑龙江省
研究生创新科研基金项目
作者简介:王振月.学士 ,教授 , 硕士生导师.Tel:(0451)82196254　
Email:wangzhen yue@ 163.com
Effectsofchrysopheninefrom Rumex
gmeliniTurcz on tumor-associated
geneexpressioninHepG2 cels
WANG Zhen-Yue1 , TANG Xian-Ming1, 2 , ZHAO Hai-Peng1 , 3 ,
WANGZong-Quan1, 4 , CHENZhi-Yan1
1CollegeofPharmacy, HeilongjiangUniversityofTraditional
ChineseMedicine, Harbin150040, China, 2HarbinFoodandDrug
InspectionCenter, Harbin150525, China, 3LunanPharmaceutical
GroupCorporation, Linyi276005, China, 4MedicineInstitute,
HebeiYilingPharmaceuticalGroup, Shijiazhuang050035, China
【Abstract】AIM:Toinvestigatetheefectsofchrysopheninefrom
RumexgmeliniTurczonthecancer-relatedgeneexpressionsof
HepG2celsbygeneexpresionprofilechipandtostudyitsrela-
tionshipwiththedevelopmentofhepaticcancerandtherelative
mechanisms.METHODS:ThetotalRNAswereextractedfrom
chrysophenineuntreatedortreatedHepG2 cellstosynthesizedoub-
le-strandedcDNAsbyreversetranscription.ThencDNA labeled
withtheincorporationofCy3andCy5-dUTwereamplifiedlinearly.
Probeswerehybridizedwitholigonucleotidemicroarray.Thechips
werescanned andthen analyzed byLuxScan 3.0 software.
RESULTS:Afterchrysophenineinduction, expressionsof9 outof
2474 cancerrelatedgenes, includingPRL-1, PAI-1, etc, were
down-regulatednotably.Meanwhile, expressionsof5 outof2474-
cancergenes, includingGADD153, HPRG, etc, wereup-regulated
markedly.CONCLUSION:Thealterationsinspecificgenesin-
volvedinmodulatingthecelcycleprogress, celproliferation, cel
apoptosis, andantiangiogenesismayberesponsibleforanticancer
molecularmechanismofchrysophenine.
【Keywords】 geneexpression;RumexgmeliniTurcz;HepG2
cells;stilbenes
【摘　要】目的:探讨毛脉酸模提取物二苯乙烯类成分与肝癌
发生 、发展的关系及其作用机制.方法:用二苯乙烯类成分处
理人肝癌细胞株 HepG2 48 h后 ,提取药物处理组和对照组细
胞的总 RNA,将两组 RNA纯化为 mRNA, 逆转录成 cDNA, 用
Cy3和 Cy5两种不同的荧光染料进行线性扩增标记 , 然后与
人肿瘤相关基因表达谱芯片杂交 , 扫描后对获得的数据用
LuxScan3.0 软件分析.结果:经二苯乙烯类成分诱导后
HepG2细胞的 2474个肿瘤相关基因中 , 有 GADD153, HPRG
等 5个基因表达明显上调 , PRL-1, PAI-1等 9个基因明显下
调.结论:二苯乙烯类成分能改变细胞周期进程 、细胞增殖 、
细胞凋亡 、血管生成等相关基因的表达 ,此可能是其抗肿瘤作
用的机制.
【关键词】基因表达;毛脉酸模;HepG2细胞株;二苯乙烯类
【中图号】R735.7　　　【文献标识码】A
0　引言
二苯乙烯类化合物是毛脉酸模 、大黄和虎杖等常
用中药的主要活性成分 [ 1] ,具有抗菌 、消炎 、抗肿瘤 、
降血脂等多种药理活性 [ 2 -3] .特别是近年来发现二
苯乙烯类化合物可诱导细胞凋亡 ,具抗肿瘤活性 , 受
到广泛关注 [ 4] .我们利用人肿瘤相关基因组表达谱
芯片对二苯乙烯类成分作用前后人肝癌细胞株
HepG2细胞的基因表达差异进行检测 ,对差异基因
进行功能分类 ,从分子水平上研究二苯乙烯类成分的
抗肿瘤作用及其机制 ,为毛脉酸模后续的抗肿瘤作用
研究提供理论依据.
1　材料和方法
1.1　材料　HepG2细胞(哈尔滨医科大学肿瘤防治
研究所);RPMI-1640培养基(Gibco公司);胎牛血清
(FCS,杭州四季青生物有限公司);总 RNA提取试剂
(Invitrogen公司);NucleoSpin RNAclean-up试剂
盒 , T7-Oligo(dT)15(上海博亚生物技术有限公司);
Cy5-dCTP, Cy3-dCTP, dNTP(上海英骏生物技术有限
公司).所用人肿瘤相关基因寡核苷酸微阵列芯片为
北京博奥生物有限公司研制 ,芯片编号为 220210,所
含基因数为 2474个.LuxScan3.0图像分析软件
(CapitalBio公司);激光扫描仪(CapitalBio公司).
1.2　方法
1.2.1　细胞培养和药物处理[ 5] 　将 HepG2细胞培
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养于含 100 mL/LFCS的 RPMI1640培养基中 ,置于
37℃,饱和湿度为 50 mL/LCO2孵箱内培养 ,将生长
状态良好细胞经计数后分为实验组及对照组(起始
细胞数为 1 ×105个 /瓶),实验组用 500 g/L二苯乙
烯类成分溶液处理 48 h,对照组细胞不做任何处理.
1.2.2　细胞总 RNA的提取　按照 Trizol法提取正
常培养组细胞和药物处理组细胞的总 RNA,并采用
紫外分光光度计定量 ,甲醛变性胶电泳进行 RNA样
品的质量检定.
1.2.3 　RNA样品的线性扩增荧光标记 　取上述检
定合格的总 RNA样品 ,采用荧光线性标记试剂盒将
处理组和对照组的样品进行双色荧光标记 , Cy3标记
对照样品 , Cy5标记处理样品 ,具体步骤按试剂盒说
明书进行.
1.2.4　杂交与清洗　标记的 DNA溶于 30 L杂交液
中(3 ×SSC, 2 g/LSDS, 5×Denhart′s, 250 g/L甲酰
胺),于 42℃杂交过夜.杂交结束后 ,先在 42℃左右
含 2 g/LSDS, 2 ×SSC的液体中洗 5 min,而后在 0.2
×SSC中室温洗 5 min.玻片甩干后即可用于扫描.
1.2.5　芯片扫描　芯片用 LuxScan10KA双通道激
光扫描仪进行扫描.
1.2.6　芯片图像的采集与数据分析　基因芯片结果
采用 LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析 ,
把图像信号转化为数字信号;然后对芯片上的数据用
Lowes方法进行归一化;以 T检验的方法结合 2倍差
异的标准来确定差异表达基因 ,最后比值为 Cy5/Cy3,
即加药组(1)/空白对照.差异基因筛选标准为比值在
2倍以上 ,在 95%水平上为显著性 ,差异样本数≥3.
2　结果
2.1　RNA质检报告　电泳结果表明 RNA样品电泳
条带清晰 , 28S比 18S条带亮度接近 2∶1,质量符合实
验要求 ,可以进行芯片实验(图 1).
1:空白对照组;2:加药组(1);3:加药组(2).
图 1　甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
2.2　基因芯片检测　在检测的总数为 2474个基因
中 ,与正常组比较 ,给药组的上调基因 2倍以上的为
5个 ,基因下调 2倍以上的为 9个(表 1).
表 1　二苯乙烯类成分对 HepG2细胞肿瘤相关基因表达的影响
分类 　基因库 ID 　比率 　　中文名称 　　　英文名称
细胞增殖 ENSG00000115758 2.0878 鸟氨酸脱羧酶 ORNITHINEDECARBOXYLASE(EC4.1.1.17)(ODC)
ENSG00000145050 2.0260 富精氨酸蛋白 ARMETPROTEINPRECURSOR(ARGININE-RICHPROTEIN)
ENSG00000078401 0.4569 内皮素 1肿瘤生长因子 ENDOTHELIN-1 PRECURSOR(ET-1)
ENSG00000021826 0.4535 氨甲酰磷酸合成酶 CARBAMOYL-PHOSPHATESYNTHETASEI)(CPSASEI)
ENSG00000102554 0.4369 肿瘤生长基因 INTESTINAL-ENRICHEDKRUEPPEL-LIKEFACTOR
ENSG00000006652 0.4163 神经生长因子诱导蛋白 PC4 iINTERFERON-RELATEDDEVELOPMENTALREGULATOR1
ENSG00000107159 0.1994 碳酸脱水酶 9 HOMOSAPIRNSCARBONICANHYDRASEIXPRECURSOR
细胞凋亡 ENSG00000175197 2.1243 DNA损伤蛋白 GROWTHARRESTANDDNA-DAMAGE-INDUCIBLEPROTEINGADD153
ENSG00000124567 2.3670 热休克蛋白 70基因 HOMOSAPIRNSFOR70-kDAHEATSHOCKPROTEIN
细胞周期 ENSG00000112245 0.4088 酪氨酸磷酸酶 4A1 PROTEINTYROSINEPHOSPHATASEIVA1
血管生成 ENSG00000113905 2.1300 血管生成相关基因 HISTIDINE-RICHGLYCOPROTEINPRECURSOR(HPRG)
癌症的易感性 ENSG00000130203 0.3775 脱辅基脂蛋白 E APOLIPOPROTEINEPRECURSOR(APO-E)
癌症的转移 ENSG00000104419 0.2911 肿瘤分化基因 N-MYCDOWNSTREAMREGULATEDGENE1 PROTEIN
ENSG00000106366 0.2878 纤溶酶原活化抑制基因 PLASMINOGENACTIVATORINHIBITOR-1 PRECURSOR(PAI-1)
与空白对照组相比 ,比值 <0.5为下调表达 ,比值 >0.5为上调表达.
3　讨论
本研究结果显示 ,与正常组比较 ,在给药组中上
调 2倍以上的基因为 5个 ,下调 2倍以上的基因为 9
个.这些基因表达的差异揭示了二苯乙烯类成分在
基因水平的部分作用靶点 ,包括影响肝癌细胞的增
殖 、分化 、侵袭和演进等.体现了二苯乙烯类成分的
多靶点作用的特点.
GADD153(CHOP)是 DNA损伤蛋白 ,具有亮氨
酸锌指结构 ,能引起细胞 G1-S期生长抑制 [ 6] .药物
和 UV诱导后 ,表达量增高 ,能和 CAAT/enhanerbind-
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ingprotein结合 ,并抑制它们的活性.活化 IEC家族 ,
间接使 Ca2+依赖性核酸内切酶活性增高 ,拓扑异构
酶抑制剂诱导后者与 DNA形成断裂复合物和微管毒
性剂 ,并能下调凋亡相关基因 ,使细胞生长抑制 ,进入
凋亡状态 [ 7-8] .本试验中二苯乙烯类成分影响
GADD153凋亡相关基因的表达 ,从而在发挥其体内
外抗肿瘤活性 ,对凋亡机制的影响可能是其部分分子
机制之一.
酪氨酸磷酸酶 PRL-1可以诱发上皮细胞的恶性
化转化 ,有资料研究表明 PRL通过增加细胞的增殖
而起到致癌的作用.目前的研究表明 PRLs还参与细
胞周期的调控.Wang等 [ 9]研究表明 PRL-1在促进细
胞分裂有丝分裂中起着重要的作用 , Sean等把 PRL-1
或 PRL-2转染到仓鼠胰腺导管上皮 D27细胞上 ,进
行细胞周期的检测 ,发现 DNA合成率和 S期细胞数
比对照组多 2.7 ～ 3.3倍 ,并且细胞由 G1期进入 S期
的速度加快 ,他们研究认为这种转染了 PRL后细胞
增殖加快的现象是由于下调了细胞周期蛋白抑制剂
p21(Cip1/Waf1)的结果 [ 10] .本实验中二苯乙烯类成
分可以使 PRL-1的表达明显下调 ,从而影响肿瘤细
胞周期的调控 ,发挥抗肿瘤活性.
人肝癌细胞可以产生 PAI, PAI-1高表达与肿瘤
的侵袭和转移密切相关 [ 11] .二苯乙烯类成分作用于
人肝癌 HepG-2细胞后 , PAI-1的表达明显下调 ,可能
是二苯乙烯类成分能抑制肝癌的侵袭和转移.
HPRG是一种新型的有活力的抗血管生成和抗
肿瘤分子 ,可以抑制血管内皮细胞的增殖 ,诱导其凋
亡从而抑制血管的生成 ,或使己生成的新生血管萎
缩 ,进而导致肿瘤的萎缩.它这种活性集中体现在
H/P区 ,无论是在含氧量正常的情况下还是含氧量
低的情况下都可以抑制血管的发生 ,这样就可以克服
在含氧量低的情况下肿瘤细胞自身诱导产生抗药性
的问题 [ 12] .本实验中二苯乙烯类成分可以明显提高
HPRG基因的表达 ,从而发挥其体外抗肿瘤作用 ,对
血管生成相关基因表达的影响可能是其抗肿瘤的分
子机制之一.
此外 ,我们的实验还显示 ,二苯乙烯类成分也能
显著影响肿瘤启动发生 、转移 、分化 、增殖相关的基因
的表达.在基因芯片的分析中 , 我们意外发现
HSP70.1和 ODC基因的升高 ,检索文献发现 , HSP
70.1基因在多种环境下均能抑制抗癌药物发挥其治
疗作用 ,使肿瘤细胞对药物产生耐药性.ODC基因也
可以促进细胞的增殖.我们发现在药物作用下该基
因在旰癌细胞内高表达.因为没有深入的实验 ,所以
很难解释真正的原因.
总之 ,二苯乙烯类成分可以对信号转导不同通路
中的许多基因表达产生显著影响 ,从而影响肿瘤细胞
的生物学特性.二苯乙烯类成分的这种多靶点作用
机制不仅能部分阐明二苯乙烯类成分抗瘤活性的分
子生物学机制 ,也为今后对毛脉酸模的进一步优化提
供了理论依据.
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编辑　王　睿
2143第四军医大学学报(JFourthMilMedUniv)2008, 29(23)　http://journal.fmmu.edu.cn