全 文 ：蝙蝠葛碱对实验小鼠脑缺血的保护作用
李艳红　龚培力
(华中科技大学同济医学院药理系 ,武汉　430030)
中国图书分类号 　R-332;R 282.71;R 284.1;R 329.24;
R 743.31;R 845.22
文献标识码　A　文章编号　1001-1978(2004)05-0564-04
摘要　目的　研究蝙蝠葛碱(dauricine , Dau)对小鼠缺氧及
急性脑缺血再灌注所致氧化损伤及能量代谢障碍的保护作
用。方法　通过常压密闭缺氧实验观察 Dau 对小鼠缺氧情
况下存活时间的影响;采用酶标仪及分光光度法测定小鼠急
性脑缺血再灌注后脑皮层组织和线粒体氧化损伤指标及能
量代谢指标活性或含量变化。结果　①Dau 延长小鼠缺氧
后存活时间 。②Dau 改善脑缺血再灌注损伤所致脑皮层组
织及线粒体 SOD 活性下降 、MDA 含量升高及线粒体 GSH-
2003 09 29收稿 , 2003 11 04修回
作者简介:李艳红 ,女 , 26岁 ,硕士生。研究方向:神经药理;
龚培力 , 女, 57岁 ,教授。 Tel:027-83657702 , E-mail:yanzi
1225@sohu.com
Px 活性下降;改善脑皮层组织 LDH 及线粒体 ATPase活性
下降。结论　①Dau对小鼠急性缺氧具有保护作用。 ②Dau
对脑缺血再灌注所致脑皮层组织及神经细胞线粒体氧化损
伤及能量代谢障碍具保护作用。
关键词　蝙蝠葛碱;脑缺血;线粒体;超氧化物歧化酶;谷胱
甘肽过氧化物酶;丙二醛;乳酸脱氢酶;ATP 酶
　　蝙蝠葛碱(dauricine , Dau)系从防己科植物蝙
蝠葛(Menispermum dauricum , DC)根茎中提取的双
苄基异喹啉类生物碱(bisbenzy l isoquinoline alka-
loid , BBISQA)。前期的研究表明 Dau具有抗血小
板聚集 , 抗氧化损伤及钙离子拮抗等药理作
用[ 1～ 3] ,同类化合物蝙蝠葛苏林碱已证实具抗脑缺
血作用[ 4 , 5] 。但 Dau对脑缺血的影响目前尚无文献
报道 ,本研究通过小鼠缺氧及反复脑缺血再灌注模
　　and hippocam pal system af ter cholinergic synapse loss and mus-
carinic receptor act ivation.Proc Nat l Acad S ci USA , 1999;96
(21):12108～ 13
14　Pavia J , Alberch J , Alvarez I et al. Repeated in tracere-
broven tricular administ ration of beta-amyloid(25～ 35)t o rats de-
creases muscarinic receptors in cereb ral cortex.Neurosci Lett ,
2000;278(1～ 2):69～ 72
Effects of sapogenin from zhimu(ZMS)and its isomer on learning and
memory ability and muscarinic subtype M1 receptor density in aged rats
CHEN Qin ,CAO Yan-Gui , LIN Yi-Ming1 , XIA Zong-Qin1 , HU Ya-Er1
(Insti tute of Natural Drug , School of L ife Science , Anhui University , Hefei　230039)
ABSTRACT　AIM　To observe the ef fects of ZMS
and ZMR(isomer of ZMS), tw o act ive components of
Zhimu on learning and memory ability and muscarinic
subtype M1 receptor density in aged rats.METHODS
　24 month-old SD rats were random ly divided into
aged control g roup , ZMS and ZMR treatment group.
Young rats w ere used as normal control g roup.The
learning and memo ry ability was detected by Y-maze
method.The muscarinic subtype M 1 receptor density
in the brain w as detected by 3H-QNB binding tests.
RESULTS　It w as found that daily oral administ ra-
tion of ZM S and ZMR for 40 d significantly enhanced
the learning and memory ability and the muscarinic
subtype M1 receptor density in the brain of the aged
rats.CONCLUSION 　These results suggested that
ZMS and ZMR probably have potential preventive
and curative act ion for the prog ressive deterioration of
the cholinergic system in Alzheimers disease (AD).
KEY WORDS　ZM S;ZMR;aged rat;learning and
memory ability ;muscarinic subtype M 1 recepto r den-
sity
1Research Laboratory of Cell Regulation , Shanghai Second M edical Uni-
versi ty , Shanghai　200025
·564· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 May;20(5):564 ～ 7
型观察 Dau对脑缺血损伤的保护作用 ,并从组织及
线粒体水平探讨了 Dau抗脑缺血损伤的机制 。
1　材料和方法
1.1　动物　昆明种小鼠 , ♂,体重 20 ～ 22 g ,由华中
科技大学同济医学院实验动物中心提供 。
1.2　药品与试剂　蝙蝠葛碱:本系化学室提供。为
白色粉末 ,分子量 624.7 ,纯度大于 98%。临用前以
1 mol·L -1 HCl溶解 , 1 mol·L-1 NaOH 调其 pH 值
至 6.4 ～ 6.7 ,用生理盐水(NS)稀释至实验所需浓
度。尼莫地平(nimodipine , Nim)针剂:山东新华制
药股份有限公司生产。超氧化物歧化酶(SOD)、谷
胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、乳酸
脱氢酶(LDH)、超微量 ATP 酶及考马斯亮蓝蛋白测
定试剂盒:购自南京建成生物工程研究所。其它试
剂均为市售分析纯。
1.3　仪器　低温高速离心机(德国 Heraeus公司),
酶标仪(美国 Bio Tech公司),可见-紫外分光光度
计(上海分析仪器厂),超声波细胞破碎仪(北京东方
仪器厂)。
1.4　小鼠常压密闭缺氧试验[ 5] 　小鼠 50 只 ,随机
分为 5组 ,即阴性对照组(NS),阳性对照组(Nim 1
mg·kg-1 ip), Dau 30 , 60及 120 mg·kg-1组 。NS 组
及Dau各组 ig 给药 ,2 次·d-1 ,连续 3 d , Nim 组于
实验前 20 min ip给药。各组末次给药后20 min ,立
即放入容积为 125 ml的密闭广口瓶中 ,瓶内放有 10
g 钠石灰 ,观察并记录小鼠存活时间。
1.5　小鼠脑缺血再灌注模型[ 6] 　小鼠 60 只 ,随机
分为 6组 ,即阴性对照组 ,阳性对照组 ,药物组(剂量
及分组同上)及假手术组 。末次给药后 20 min水合
氯醛 350 mg·kg-1 ip麻醉小鼠 ,参照文献方法稍作
改进制备小鼠急性脑缺血模型。具体操作如下:小
鼠仰卧位固定 ,颈正中切口 ,分离双侧颈总动脉并用
无损伤微动脉夹夹闭 ,阻断血流 20 min ,观察眼球
变白及脑电波低平方成功 ,然后恢复血流 10 min ,
如此反复 2次。伪手术组除不结扎颈总动脉 ,其余
处理同对照组。
1.6　大脑皮层组织匀浆及线粒体制备[ 7] 　末次缺
血再灌注 30 min后迅速断头取脑组织 ,用潮湿滤纸
除去血液 ,在冰盘中取双侧脑皮层组织 ,称重 。在冰
浴上按 1∶9(W/V)加入 4℃匀浆介质 ,转入玻璃匀
浆器中 ,用手动匀浆器上下转动研磨 20 次 ,待组织
充分匀浆化即制成 10%匀浆液 , 3 500 r·min-1 ,离
心 10 min。取上清液以考马斯亮蓝法测定蛋白含
量 ,分装于-70℃冰箱保存备用。线粒体制备整个
过程均在 4℃环境中进行。取 10%组织匀浆 ,600×
g 离心 10 min ,取上清液10 000×g 离心 10 min ,沉
淀物即为线粒体。将分离的线粒体用 4℃匀浆介质
制备成混悬液 ,用超声波发生仪破碎线粒体待测酶
活力(注意降温)。以考马斯亮蓝法测定蛋白含量
后 ,分装于-70℃冰箱保存备用 。
1.7　氧化损伤指标及能量代谢指标测定　按试剂
盒操作说明测定脑皮层组织及线粒体 SOD 、GSH-
Px活性及 MDA 含量 ,测定脑皮层组织 LDH 及线
粒体ATP 酶活性。
1.8　统计学处理　采用 SPSS 10.0 统计软件在计
算机上进行。实验数据以 x ±s表示。组间比较用
单因素方差分析。
2　结果
2.1　对小鼠缺氧耐受力的影响　常压密闭缺氧可
致小鼠数分钟内死亡 ,用小鼠在密闭容器中的存活
时间来反映小鼠对常压密闭缺氧的耐受力 。与 NS
组比 ,Dau 30 ,60及 120 mg·kg-1组小鼠存活时间均
延长 ,其中 Dau 60 mg·kg -1及 120 mg·kg-1差异具
显著性(P <0.05)。结果见 Tab 1。
Tab 1　Effects of Dau on the survival time of
mice by close normobaric hypoxia( x ±s , n=10)
Group Dose/mg·kg -1 Survival time/min
NS - 13.2±2.86
Nim 1 16.5±2.42＊
Dau 30 14.9±2.92
60 16.8±2.70＊
120 16.0±2.40＊
　　＊P<0.05 vs NS group
2.2　对脑皮层组织及线粒体 SOD , GSH-Px活性及
MDA含量的影响　反复脑缺血再灌注后 , NS 组与
假手术组比小鼠脑皮层组织和线粒体总 SOD活性
下降 ,MDA 含量上升及线粒体 GSH-Px 活性下降 ,
其差异具统计学意义(P<0.05)。Dau各剂量均升
高脑皮层 、线粒体总 SOD 及线粒体 GSH-Px 活性 ,
降低脑皮层及线粒体 MDA含量 ,各组与 NS组比差
异均有显著性(P<0.05)。脑皮层组织 GSH-Px 活
性各组与伪手术组比均无变化(P >0.05)。结果见
Tab 2 。
2.3　对脑皮层组织 LDH及线粒体 ATP酶活力的
影响　反复脑缺血再灌注后 , NS 组与假手术组比
小鼠脑皮层组织胞浆 LDH 及线粒体 ATPase 活性
下降 , 其差异有显著性(P <0.01 和 P <0.05)。
Dau各剂量均升高 LDH 及 ATPase 活性 ,与 NS 组
比差异有显著性(P <0.01 和 P <0.05)。结果见
Tab 3 。
·565·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 May;20(5)
Tab 2　Effects of Dau on the total SOD , GSH-Px activities and MDA content of
cerebral cortex and mitochondria in brain ischemia reperfusion mice( x ±s , n=10)
Group
Dose
/mg·kg -1
T-SOD/NU·mg -1 Pro
Cortex Mitochondria
GSH-Px/ unit
C ortex Mitochondria
MDA/μmol·g -1 Pro
Cortex Mitochondria
Sham - 60.0±9.35 40.2±9.02 56.4±17.0 60.9±24.9 2.36±0.85 1.72±1.00
Model+NS - 69.6±7.88# 29.8±4.33# 66.3±19.5 35.8±16.6# 3.39±1.13# 3.10±1.20#
Model+Nim 1 70.1±7.33＊ 36.7±6.54＊ 62.4±23.9 52.0±16.3＊ 2.14±1.04＊ 1.80±0.93＊
Model+Dau 30 69.2±10.94＊ 32.3±6.14＊ 67.8±19.2 53.7±24.9＊ 2.49±0.58＊ 1.78±1.10＊
60 69.3±4.69＊ 39.5±5.87＊ 69.3±17.3 61.8±19.7＊ 2.13±0.67＊ 1.68±1.17＊
120 72.2±7.68＊ 37.8±7.68＊ 73.2±25.8 53.4±18.9＊ 2.21±0.64＊ 1.93±1.29＊
　　#P<0.05 vs sham group;＊P<0.05 vs NS group
Tab 3　Effects of Dau on the activities of
cerebral cortex LDH and mitochondria total
ATPase in brain ischemia reperfusion mice( x±s , n=10)
Group
Dose
/mg·kg -1
Cortex LDH
/U·g -1 Pro
Mitochondria ATPase
/U·mg -1 Pro
S ham - 7408.5±1135.4 36.9±15.9
Model+NS - 5566.7±1042.5## 20.4±8.57#
Model+Nim 1 6757.1±942.9＊＊ 32.5±14.2＊
Model+Dau 30 6820.6±1005.9＊＊ 26.4±11.9
60 6948.7±1283.9＊＊ 30.7±9.93＊
120 7314.4±1030.3＊＊ 31.7±7.28＊
　　#P<0.05 , ##P<0.01 vs sham group;＊P<0.05 , ＊＊P<
0.01 vs NS group
3　讨论
自由基蓄积引起细胞严重的功能障碍和死亡 ,
脑组织神经细胞对自由基损伤尤为敏感 ,这可能与
脑组织高度耗氧 、透 Ca2+通道的存在及过氧化氢酶
水平较低等因素有关[ 8] 。线粒体与自由基关系密
切 ,它通过电子传递体及氧化磷酸化过程产生 ATP
的同时不断产生活性氧[ 9] 。活性氧攻击细胞及亚
细胞成分脂膜 ,引起生物膜不饱和脂肪酸的脂质过
氧化反应 ,造成膜完整性及通透性破坏 ,继而引发细
胞死亡[ 10] 。线粒体膜遭到活性氧攻击 ,继发膜功能
损害 ,导致线粒体 Ca2+回收障碍 ,线粒体膜电位下
降及细胞色素 C 释放入胞质 ,从而诱导细胞凋亡发
生[ 11] 。故线粒体既是产生活性氧的主要场所又是
自由基攻击的目标。线粒体功能障碍及继发的活性
氧升高可引起神经细胞死亡及凋亡[ 12] 。
SOD和 GSH-Px 是脑组织内两种主要的抗氧
化酶 , MDA 为脂质过氧化反应的主要终产物 ,测定
其含量可间接反应机体中自由基水平及脂质过氧化
反应程度[ 13] 。LDH 与 ATP 酶是能量代谢的重要
指标 。LDH 在脑组织含量较高且分布均匀 ,当神经
细胞受到破坏时 ,胞质中的 LDH 大量溢出 ,胞内含
量将随之减少 。同时 ,脑细胞内 ATP 逐渐耗竭 ,线
粒体膜 ATPase 活性下降 ,引起线粒体膜两侧钙离
子转运严重失调 ,使线粒体钙库内钙大量释放入胞
质 。已有实验证明细胞内钙释放是脑缺血时钙超载
的重要来源。因而作为胞内主要产能场所的线粒
体 ,对脑缺血损伤极为敏感[ 14] 。
　　本室对 Dau的药代动力学研究表明:灌胃给药
后 0.5 h ,Dau在大鼠脑中的药物浓度已高于血浆药
物浓度[ 15] ,表明 Dau可透过血脑屏障。本研究通过
灌胃给药观察 Dau对脑缺血缺氧损伤的影响 ,发现
Dau明显延长缺氧小鼠存活时间 ,从整体上说明
Dau对小鼠脑缺血缺氧具保护作用。并首次研究了
Dau对神经细胞线粒体的影响 ,发现 Dau能升高神
经细胞线粒体总 SOD及 GSH-Px 活性 ,减少脑缺血
再灌注后神经细胞线粒体 MDA 生成 ,说明 Dau可
能通过升高线粒体清除氧自由基的能力及减少线粒
体脂质过氧化物生成而防止和逆转线粒体损伤介导
的神经细胞死亡和凋亡。文献[ 2] 报道 Dau 对双侧
颈总结扎 30 min再灌注 60 min所致大鼠脑海马组
织氧化损伤具保护作用 ,本研究则从脑皮质及及线
粒体水平探讨 Dau 的抗氧化作用 ,其结果具一致
性 。另外 ,Dau对脑缺血再灌注损伤所致小鼠脑细
胞能量代谢障碍也具改善作用 ,它提高脑皮层组织
LDH 及线粒体总 A TPase活性 ,保证线粒体的正常
氧化和产能功能 ,起到延迟和防止脑缺血损伤的作
用 。
本室既有的研究表明 Dau对豚鼠心室肌细胞 L
型钙电流具阻断作用 ,抑制电压依赖性钙通道介导
的胞内钙超载[ 3] 。曾国钱等的研究也表明 Dau 对
细胞 Ca2+内流具明显抑制作用 , 其抑制率可达
31.4%[ 16] 。由此推测 Dau抗氧化损伤的机制可能
与其 Ca2+拮抗作用有关 。有文献报道在脑缺血再
灌注损伤中 ,自由基变化与细胞内 Ca2+超载具高度
正相关 。胞内Ca2+增加可介导自由基产生 ,自由基
导致的脂质过氧化反应亦可引起胞内 Ca2+超载 ,二
者互为因果 ,共同加重脑损伤[ 17] 。但 Dau对神经细
胞内钙超载的作用目前尚无相关文献报道 ,因此以
·566· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 May;20(5)
上推测有待下一步实验观察证实。
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The protective effect of dauricine on cerebral ischemia in mice
LI Yan-Hong , GONG Pei-Li
(Dept of Pharmacology , Tongji Medical Col lege of Huazhong
University of Science and Technology , Wuhan 　430030)
ABSTRACT　AIM　To investigate the protect ive ef-
fects of dauricine on anoxia and acute cerebral is-
chemia-reperfusion in mice.METHODS 　 In this
study , anoxia w as induced by close normobaric hy-
pox ia to search the effects of dauricine on the survival
time of mice.The activities of SOD , GSH-Px and
levels of MDA in cortex or mitochondria , the activi-
ties of cortex LDH and mitochondria ATPase were all
measured by ELISA-Reader and spect rophotography.
RESULTS　①Dauricine prolonged the survival time
of mice in the close normobaric hypoxia , among all
doses , Dauricine 60 mg·kg-1 and 120 mg·kg-1 had
signif icant most effects (P <0.05).② The de-
creased activities of total SOD were both enhanced in
cortex and mitochondria by dauricine(in 30 , 60 , 120
mg·kg -1), the same effect on GSH-Px only appeared
in mitochondria.The increased levels of MDA in cor-
tex and mitochondria were all decreased by dauricine.
③Dauricine(in 30 , 60 , 120 mg·kg-1)enhanced the
decreased activities of cortex LDH and mitochondria
ATPase.CONCLUSION　① Dauricine had pro tec-
tive effect on mice acute anoxia.② Dauricine pre-
vented and reversed the oxidative damage on co rtex
and mitochondria of brain induced by repeatedly cere-
bral ischemia reperfusion.③ Dauricine ameliorated
energy metabolism disturbance of cortex and mito-
chondria caused by repeatedly cerebral ischemia reper-
fusion.
KEY WORDS　dauricine;cerebral ischemia;mito-
chondria;SOD;GSH-Px ;MDA;LDH;ATPase
·567·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　2004 May;20(5)