全 文 ：　　收稿日期:2007-03-15
　　基金项目:吉林大学农学部博士科研启动基金项目(2006)
　　作者简介:李小兵(1971-),男 ,博士。
＊通讯作者
相思子毒素-a双抗体夹心 ELISA法的建立和初步应用
李小兵1 ,谢光洪1 ,周昌芳1 ,张志刚1 ,周晓翠1 ,宋文学1 ,张乃生1 ,王兴龙2 ,高宏伟2 ,王　哲1＊　(1.吉
林大学 畜牧兽医学院 ,吉林 长春 130062;2.军事医学科学院 军事兽医研究所 , 吉林 长春 130062)
摘要:以已制备的抗相思子毒素-a(abrin-a)的单克隆抗体(McAb)4G1 和兔源多抗建立了 abrin-a 双抗体夹心
ELISA 法。 abrin-a质量浓度在 15.62 ～ 250.00 μg/ L 的范围内 ,质量浓度的对数值与其 D450值呈直线相关 ,回归方
程为 y=1.046 7x+0.527 7(R2 =0.999 2 , n=5), 检测灵敏度为 7.81 ng/m L。该法与相思子凝集素 、蓖麻毒素(ri-
cin)和蓖麻凝集素无交叉反应。经初步用于人工污染 abrin-a香肠样品和自来水样品检测 ,回收率分别为 92.0%和
85.0%, 变异系数(CV)<6%。表明该检测方法具有快速 、特异 、灵敏等特点 , 可望用于食品 、饲料和饮用水中
abrin-a检验。
关键词:相思子毒素-a;McAb;ELISA;检测
中图分类号:S859.8　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-4545(2008)08-0962-03
Establishment and initial application of double antibody sandwich ELISA for
abrin-a
LI Xiao-bing 1 , XIE Guang-hong1 , ZHOU Chang-fang1 , ZHANG Zhi-gang1 , ZHOU Xiao-cui1 , SONG
Wen-xue1 ,ZHANG Nai-sheng1 , WANG Xing-long2 , GAO Hong-wei2 ,WANG Zhe1＊　(1.College
o f Animal Science and Veterinary Medicine , J i lin Universi ty , Changchun 130062 , China;2.The
Mili tary Veterinary Inst i tute , Academy o f Mili tary Med ical Sciences ,Changchun 130062 ,China)
　　Abstract:Based on the prepared 4G1 monoclonal antibody(McAb)and rabbit serum anti-abrin-a , a double anti-
body sandw ich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method for abrin-a w as developed.There w as line co r-
relation betw een the log arithm value s of C and D450 values , w hen the concentrations(C)of abrin-a varied from 15.62
to 250 mg/ L.The detection equa tion was y=1.046 7x+0.527 7(R2 =0.999 2 , n=5), w ith a detection limit of 7.81
μg/ L.No cro ss-reac tion was found in abrus agglutinin , ricin and ricus agg lutinin.It has been demonstra ted initially
tha t the recoveries of the abrin-a in ar tificially contaminated sausage and water samples w ere(92.0±2.71)% and
(85.0±4.33)%(CV<6%).The assay for abrin is rapid , sensitive and specific and may be used in the determina tion
for abrin-a in food fo rage and w ater.
　　Key words:abrin-a;McAb;ELIS A;detection
＊ Corresponding author
　　相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子
(Abrus precatorius L.)种子中的一种毒蛋白 ,是迄
今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一 ,在已报
道的 abrin-a、abrin-b 、abrin-c和 abrin-d 4种异毒素
中 ,以 abrin-a 毒性最强 ,小鼠毒性约为 ricin 的 70
倍[ 1] 。此外 , abrin还是一种有效的蛋白质合成抑制
剂 ,对多种肿瘤细胞及癌移植物有很强的抑制作用 ,
可能成为一种极有前途的抗癌药物[ 2-3] 。因此 ,建立
特异 、灵敏 、快速的检测方法对于免疫毒素(IT)药
代动力学研究及现场检测意义重大 。ELISA 法具
有特异 、灵敏 、快速 、简便等优势 ,是检测生物毒素的
最常规方法之一。Godal 等[ 4] 、李丽琴等[ 5] 利用
abrin抗血清 ,建立了 abrin放射免疫分析法(RIA),
灵敏度可达 50 ～ 100 pg ,但特异性较差 ,且存在放
射性污染 。穆惠等[ 6] 将多克隆抗体与单克隆抗体相
结合 ,建立了 abrin 的双抗体夹心 ELISA 法 ,特异
性明显提高 。鉴于 abrin-a 毒性最强 ,应用前景较
广 ,本研究在制备特异性抗 abrin-a A 链 McAb 的
基础上 ,与高亲和力多克隆抗体配合建立了双抗体
夹心 ELISA 法 ,为 abrin-a的快速定量提供了新的
962 　中 国 兽 医 学 报　2008 年 8 月　第 28 卷　第 8 期　Chin J Vet S ci 　Aug.2008　Vo l.28 　No .8 　
DOI :10.16303/j.cnki.1005-4545.2008.08.002
方法 。
1　材料与方法
1.1　材料　abrin-a标准品 、相思子凝集素和 abrin-
a 单克隆抗体杂交瘤细胞株 4G1 均为本实验室制
备;ricin 、蓖麻凝集素为本室保存;1 号封闭剂(1∶
40),江苏维特洁公司;N-四甲基联苯胺(TMB),上
海精睿生物科技公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗
鼠 IgG 、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG , Sigma
公司;牛血清白蛋白(BSA),Genview 公司;其他试
剂为进口分装或国产分析纯化学试剂。
1.2 　仪器　酶联免疫检测仪 ,美国 Bio-Rad 5 50
型;双条可拆 96孔酶标板 ,NUNC公司。
1.3　抗血清的制备和鉴定　按照文献方法[ 7-8] ,以
abrin-a类毒素为免疫抗原 ,按常规方法免疫家兔 ,
制备 abrin-a抗血清 ,间接 ELISA 法测定效价 ,选择
相思子凝集素 、蓖麻毒素和蓖麻凝集素 3种类似物 ,
采用琼脂糖双向免疫扩散试验分析抗血清的特异
性[ 9] 。硫酸铵((NH 4)2SO 4)分步沉淀法纯化后 ,
SDS-PAGE 电泳法分析纯度 ,BCA标准试管法测定
多抗浓度 。
1.4　McAb 制备 、鉴定　取冻存4G1 M cA b杂交瘤
细胞株 ,按常规方法复苏 、扩大培养 ,采用 BA LB/c
小鼠体内诱生法制备腹水 ,间接 ELISA 法测定效价
及抗体特异性 ,Western-blo t法分析抗原结合位点 。
重组蛋白 A亲和层析柱纯化腹水 ,BCA 标准试管法
测定 McAb 浓度 。
1.5　夹心 ELISA检测 abrin-a方法的建立　取4G1
McAb作为包被抗体 , abrin-a 多抗作为第二抗体 ,
以羊抗兔 IgG 作为酶标抗体 , TMB 为底物 。按常
规方法用包被缓冲液将 4G1 稀释后 ,每孔 100 μL
加至 ELISA 酶标板中 ,4℃包被过夜 ,用洗涤液(含
1 mL/L Tw een20 的 PBS)洗涤 3 次 ,每次 4 min 。
每孔加封闭剂 200 μL 以封闭板上的空白位点 ,洗涤
3次。加同浓度的 abrin-a 标准品 , 37℃孵育 45
min ,洗涤 3次;加工作浓度的 abrin-a多克隆抗体每
孔 100 μL ,37℃孵育 45 min ,洗涤 3 次。加工作浓
度的 H RP-羊抗兔 IgG ,每孔 100 μL , 37℃保温 45
min ,洗涤 3次 。加 TMB底物液 37℃显色10 min ,
加 2 mol/L H 2SO 4 终止液。以空白对照调零 , 测
D 450值。
1.6　检测限 、线性范围与特异性检测　按上述方
法 ,将4G1(8 g/L)作 1∶250 、1∶500 、1∶1 000 、1∶
2 000 、1∶4 000 、1∶8 000和 1∶16 000倍稀释包被
酶标板 ,加入 62.5 μg/ L abrin-a 标准品以及 1 ∶
10 000稀释的抗血清(21.5 mg/L),同等条件下进
行检测 ,确定 4G1 最适包被浓度;以最适浓度的
4G1包被 ,将抗血清(21.5 g/ L)作 1 ∶1 250 、1∶
2 500 、1∶5 000 、1∶10 000 、1∶20 000 、1∶80 000 、
1∶160 000倍稀释 ,固定其他条件进行 ELISA 检
测 ,分析抗血清的最适工作浓度 。在此基础上 ,将
abrin-a标准液(1 000 μg/L)倍比稀释后进行双抗
体夹心 ELISA 法检测 ,绘制标准工作曲线 ,用 SPSS
软件分析并拟合回归方程 ,分析线性范围及最低检
测限。用 ricin 、蓖麻凝集素 、相思子凝集素等 3种
abrin-a类似物分析该方法的特异性 。
1.7　人工污染 abrin-a样品的检测　取香肠5 g ,经
高速匀浆后 ,加一定量的 abrin-a 标准品 ,搅拌均匀 ,
2 000 r/min离心 15 m in ,取上清作为人工污染的香
肠样品 。将一定量的 abrin-a 标准品加入自来水作
为人工污染水样品 。以上述建立的双抗体夹心
ELISA 法检测 , 根据 D 450值 ,计算 abrin-a 的回收
率 。
2　结果
2.1　抗血清及 4G1 McAb 的制备和鉴定 　间接
ELISA 法测定兔抗血清及4G1 McAb 效价分别为
1.6×105 和 3.2×105 ;纯化后多抗及 4G1 M cAb的
质量浓度分别为 21.5 、8 g/L ;琼脂糖双向免疫扩散
试验表明 ,抗血清与 ricin 和蓖麻凝集素无交叉反
应 ,但与相思子凝集素存在一定程度的交叉反应[ 8] ;
4G1 McAb与相思子凝集素 、ricin 、蓖麻凝集素等均
无交叉反应 , Weste rn-blo t 鉴定进一步表明 4G1
M cAb为特异性结合 abrin-a A链 McAb[ 9] 。
2.2　封闭条件的选择　分别以3%明胶-PBS T 、1%
BSA-PBST 、3%BSA-PBST 和 1∶40倍 1号封闭剂
封闭酶标板 ,其中 1号封闭剂封闭时间设 5 、10 、,30
min 3组 ,其他 3种封闭剂封闭时间均为 1 h。1号
封闭剂封闭 10 min与 3%BSA-PBST 封闭 1 h 效果
相近 ,但所需时间更短 ,故选择 1 号封闭剂 37℃封
闭 10 min作为最佳封闭条件(表 1)。
2.3　最适抗体包被质量浓度　4G1在 1∶2 000倍
时 ,D450值接近最大值 ,更高的包被质量浓度 D 450值
增加不明显 ,所以选择 4G1包被质量浓度为 4 mg/
L。
2.4　最适抗血清工作质量浓度 　抗血清为1∶
10 000倍稀释时 ,D450值接近最大 ,更高质量浓度的
抗血清其D 450值增加趋缓 ,故选择 2.15 mg/L 作为
其工作质量浓度。
963　中 国 兽 医 学 报　2008 年 8 月　第 28卷　第 8期　Chin J Vet Sci　Aug.2008 　Vol.28 　No.8 　
表 1　不同封闭条件检测结果
项目 3%明胶-PBST(1 h) 1%BSA-PBST(1 h) 3%BSA-PBST(1 h) 1号封闭剂(5 min) 1号封闭剂(10 min) 1号封闭剂(30 min)
P 1.062 1.062 1.057 1.102 1.063 1.048
N 0.639 0.547 0.235 0.351 0.241 0.230
P/N 1.662 1.941 4.498 3.140 4.411 4.557
2.5　线性范围　不同质量浓度的 abrin-a 标准品
ELISA 检测结果见表 2 , 以 D450值为横坐标 , 以
abrin-a 质量浓度的对数值为纵坐标 ,SPSS 软件进
行线性回归分析 ,在 15.62 ～ 250.00 μg/ L 范围内
abrin-a 质量浓度对数值与平均 D450nm值呈直线相
关 ,回归方程为 y =1.046 7x +0.527 7(R2 =
0.999 2 ,n=5)。
表 2　双抗体夹心 ELISA 测定不同质量浓度 abrin-a的结果
序号 c/(μg· L-1) c的对数值 平均D 450值
1 250.00 2.40 1.780 0
2 125.00 2.10 1.510 0
3 62.50 1.80 1.200 0
4 31.25 1.49 0.940 0
5 15.62 1.19 0.628 0
6 7.81 0.89 0.522 0
2.6　最低检测限　将 abrin-a 标准品稀释为31.25 、
15.62 、7.81和 3.9μg/ L 4个质量浓度 ,经 4次重复
性测定 , abrin-a质量浓度为 7.81 μg/L(1∶512 000)
时 ,P/N 值分别为 3.1 、2.2 、2.3和2.4 ,均大于 2.1 ,
判断为阳性;当 abrin-a 质量浓度为3.9μg/L 时 , P/
N小于 2.1 ,判断为阴性 ,由此可见 ,该法最低检测
限为 7.81 μg/ L。
2.7　特异性检测　用双抗体夹心 ELISA 法检测不
同浓度的 ricin 、蓖麻凝集素 、相思子凝集素等 3 种
abrin-a类似物 ,其 D450值接近阴性对照 , P/N 值均
小于 2.1 ,为阴性 ,表明该法有较好的特异性。
2.8　人工污染 abrin-a样品的检测　结果见表3。
人工污染香肠样品中 abrin-a 平均回收率约为
92.00%(CV=2.95%, n=3)。人工污染的生理盐
水样品检测结果表明 ,生理盐水中 abrin-a平均回收
率约为 85%(CV=5.09%,n=3)。
表 3　人工污染 abrin-a 样品检测结果
样品 理论值/(μg· L -1)
检出值/
(μg· L-1)
回收率/
%
平均回收率/
% CV/ %
香肠 200 183.0 91.70 92.00±2.71 2.95
200 178.0 89.45
200 189.0 94.85
生理 200 176.6 88.30 85.02±4.33 5.09
盐水 200 160.2 80.10
200 173.3 86.65
3　讨论
影响 ELISA 法特异性的因素很多 ,就本方法而
言 ,主要有抗体本身的特异性和系统各组分的非特
异性吸附。由于 abrin-a 与 ricin结构相似 ,同源性
较高 ,早期利用多克隆抗体建立的 RIA法特异性较
差[ 4-5] 。由于 abrin-a 与相思子凝集素同源性高达
70%,基于多克隆抗体的 ELISA 方法也很难排除相
思子凝集素的干扰[ 10] 。经Western-blo t鉴定 ,本方
法包被用的 4G1 M cA b 仅特异性结合 abrin-a A
链 ,与 abrin-a B链 、相思子凝集素 、ricin 、蓖麻凝集
素等结构类似物均无交叉反应;因此 ,将 4G1作为
包被抗体 ,能提高检测方法的特异性 。二抗采用兔
抗 abrin-a IgG为 PcA b ,亲和力高 ,可有效提高检测
方法的灵敏度。结果表明 ,本研究所建立的双抗体
夹心 ELISA 法稳定 、特异性高 、灵敏度较高 。
本方法本底相对较高 ,一定程度上降低了本方
法检测灵敏度。研究后发现 ,这主要与酶标二抗(酶
标羊抗兔 IgG)与鼠源 McA b之间存在一定的交叉
反应有关。进一步分析表明 ,采用兔源多抗包被酶
标板 ,以鼠源 McAb 作为二抗时 ,酶标抗体(酶标羊
抗小鼠 IgG)与兔源多克隆抗体之间也存在一定程
度的交叉反应 ,提示酶标二抗(酶标羊抗兔 IgG 或
酶标羊抗小鼠 IgG)的异质性对该系统本底值影响
不可忽视 ,而以特异性 McAb 为包被抗体 ,酶标多
克隆抗体或不同抗原结合点的酶标 McAb 作为二
抗体建立的双抗体夹心 ELISA 法可望具有更高的
特异性及灵敏度。
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(下转 967页)
964 　中 国 兽 医 学 报　2008 年 8 月　第 28 卷　第 8 期　Chin J Vet S ci 　Aug.2008　Vo l.28 　No .8 　
量铜的 2 、3组鸡分别在 10 日龄和 8日龄出现精神
亢奋 、采食量减少 、粪便变绿 、发育不良等症状 ,并在
第 2周出现死亡 ,第 3周为死亡高峰 ,而各加硼组在
15日龄以后才开始有雏鸡表现中毒症状和出现死
亡。各组雏鸡死亡情况见表 3。
表 3　各组雏鸡死亡情况 只
组别 第 1周 第 2周 第 3周 第 4周 第 5周 合计 总死亡率%
1组 0 0 1 0 1 2 2.5
2组 0 3 11 5 1 20 25
3组 0 9 19 7 2 37 46.25
4组 0 1 8 2 0 11 13.75
5组 0 0 10 4 1 14 17.5
6组 0 0 5 1 0 6 7.5
7组 0 2 11 3 0 16 20
由表 3可见 ,随日粮硼剂量的升高 ,高铜所造成
的雏鸡死亡率下降 ,说明硼可缓解铜中毒症状 。
2.3　各组雏鸡病理学变化　剖检病死鸡发现 ,加硼
组雏鸡病变主要在肌胃和腺胃 ,而不加硼组雏鸡自
腺胃以下的消化道都能观察到不同程度的病变。表
现为腺胃糜烂 ,腺胃乳头基本消失 ,基上被覆一层灰
白色黏液;肌胃角质增厚 ,呈灰绿色 ,龟裂 ,出现大的
坏死灶 ,第 2 、3组死亡雏鸡肌胃的坏死灶明显较加
硼组大;小肠肠壁变薄 ,充血 ,盲肠膨大;胸腺 、脾脏 、
法氏囊萎缩;肝脏呈深褐色 ,质脆易碎 ,胆囊充盈 。
组织学变化表现为肝细胞脂肪变性 ,观察不到
明显的肝细胞索 ,肝细胞肿大 ,胞浆内出现大小不等
的空泡 。腺胃 、肌胃 、小肠上皮结构紊乱 ,细胞变性 、
坏死 、脱落。
由此可以初步看出 ,硼可缓解铜中毒症状 ,在一
定程度上保护消化道免受高铜的刺激和腐蚀。
本试验结果表明 ,在含铜 600 、800 mg/kg 的日
粮中添加 60 、120 mg/kg 硼 ,可促进明显降低雏鸡
死亡率 ,缓解铜中毒的临床症状和病理损伤 ,提高增
重率和饲料报酬。说明 60 mg/kg 和 120 mg/kg 硼
均可表现对铜中毒的缓解作用 ,但量效关系不明显。
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