全 文 ：加标香肠及水样品中相思子毒素-a
高效液相色谱检测
李小兵1 , 谢光洪1 , 张加力2 , 杨连玉2 , 王 　哲1
(1.吉林大学畜牧兽医学院 , 长春 130062;2.吉林农业大学动物科技学院 , 长春 130118)
摘　要:应用高效液相色谱法(HPLC)定性和定量检测加标香肠和水样品中相思子毒素-a(abrin-a)。在固定
相为Shodex Protein KW-802.5色谱柱 , 流动相为0.5 mol/ L的磷酸盐缓冲液(PB , pH 7.3),流速为 1 mL/min , 柱温
为25℃,检测波长为 280 nm等条件下 , 测定结果:abrin-a 保留时间(9.80±0.02)min (n =25);浓度与峰面积呈
良好的线性关系 ,线性范围 11.765～ 941.200 μg/mL;最低检测限 44 ng;加标香肠和水样品中 abrin-a 回收率分
别为 104.6%和 97.9%。测定结果表明 ,该方法简便 、快速 、灵敏度较高 、重现性好。
关键词:相思子毒素-a;HPLC;香肠;水
中图分类号:S852.44　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2008)06-0842-04
Analysis of Abrin-a from Artificially Contaminated Sausage and
Water Samples by High-Performance Liquid Chromatography(HPLC)
LI Xiao-bing1 , XIE Guang-hong1 , ZHANG Jia-li2 , YANG Lian-yu2 , WANG Zhe1
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine , Jilin University , Changchun 130062 , China ;
2.College of Animal Science and Technology , Jilin Agricultural University , Changchun 130118 , China)
Abstract:A new high-performance liquid chromatography (HPLC)method emplyed to examine abrin-a
from artificially contaminated sausage and water samples was described.Stationary phase applied was
Shodex Protein KW-802.5 column , Abrin-a was separated from dopants with the mobile phase 0.5 mol/L
phosphate buffered solution(PB , pH 7.3)with a flow rate of 1 mL/min.The retention time of abrin-a
was(9.80 ±0.02)min (n =25).The calibration graph was linear in the range of 11.765—
941.200 μg/mL abrin-a.The detection limit was 44 ng.The average recoveries of abrin-a in artificially
contaminated sausage and water samples with standard abrin-a were 104.6% and 97.9% respectively.
We concluded that this is a simple , sensitive and accurate method.
Key words:abrin-a;HPLC;sausage;water
　　相思子毒素(abrin)是存在于豆科植物相思子
(Abrus Precatorius L.)种子中的一种大分子植物毒
蛋白 ,与蓖麻毒素(ricin)同为 Ⅱ型核糖体失活蛋
白(RIP)家族成员 ,但毒性却是 ricin的75倍 ,是迄
今为止所发现的毒性最强的植物毒素之一[ 1] 。自
然界中主要有 abrin-a、abirn-b 、abrin-c 和 abrin-d 4
种异构体 ,其中以 abrin-a 毒性最强[ 2] 。人和动物
摄入后中毒较慢 ,中毒后无特异症状 ,出现症状时
已经造成机体严重的器质损害 ,给中毒的治疗及
预防带来极大的难度 ,且至今尚无特效治疗药
物[ 3] 。由于相思豆较广泛地分布于热带 、亚热地
区 ,且 abrin的纯化制备方法相对简单 ,因此 abrin

通讯作者
基金项目:国家自然科学基金专项基金项目(30640049),吉林大学农学部博士科研启动基金项目(2006)
作者简介:李小兵 ,男 ,博士 ,研究方向:动物营养代谢与中毒病学。
收稿日期:2008-01-14　　修回日期:2008-03-14
吉林农业大学学报　2008 ,30(6):842 ～ 845 http:// xuebao.jlau.edu.cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail:jlndxb@vip.sina.com
被认为是一种潜在的生物毒素武器[ 1] 。因此 ,
abrin检测技术研究不仅可作为反恐的一个技术
贮备 ,还可望为 abrin中毒早期诊断以及法医鉴定
等提供一种实验室确证和精确定量手段 。
免疫技术是较早检测 abrin的方法 ,也是现今
较成熟的方法 。Godal[ 4] 、李丽琴[ 5]利用多克隆抗
体 ,先后建立了 abrin的放射免疫检测法(RIA),血
浆中 abrin最低检测限分别为 0.05 ～ 0.1 ng/mL和
0.2 ng/mL。穆日希惠[ 6-7] 、罗胜军[ 8] 等人利用抗
abrin-a特异性单克隆抗体和抗血清 ,先后建立了
双抗体夹心 ELISA和双抗体夹心生物素 —亲和素
ELISA 法来检测微量 abrin , 最低检测限可达
0.125 ng/mL。Zhou[ 9] 采用噬菌体展示技术首次
筛选出 2 株抗 abrin人源单克隆抗体 ,用于 abrin
快速免疫学检测。RIA灵敏度高 ,鉴于其放射性
物质对环境的污染 ,近年来 RIA已经逐渐为其他
非放射线方法所取代。ELISA法操作方便 ,通常
作为定性和半定量分析手段 ,用于现场或大量样
品的初筛。Tang[ 10]采用离体筛选法获得可高亲
和力 、高度特异结合 abrin的脱氧核糖核酸(DNA)
aptamer ,用于替代抗体建立了一种新型的 abrin检
测方法 ,最低检测限为1 mmol/L ,但该方法的推广
应用尚有待进一步完善。
凝胶色谱技术是 20世纪 60年代初发展起来
的一种快速而又简单的分离技术 ,它的分离并不
依赖于流动相和固定相间的相互作用力 ,常用的
色谱柱主要有硅胶或多聚体为基质两大类 ,由于
硅胶的内水体积更大 ,且孔径更均一 ,硅胶色谱柱
比聚合物凝胶可以有更好的分辨力 ,常被用于分
子量范围在数千至近百万的蛋白质的分离[ 11-12] 。
本试验根据 abrin-a与半乳糖残基特异性结合特
性 ,利用亲和层析方法快速富集目标毒素 ,通过选
用适当的色谱柱和优化色谱分离条件 ,使得 abrin-
a在色谱柱有很好的保留 , abrin-a 和杂质充分分
离。本方法的建立旨在探讨一种快速可靠的检测
香肠及水样品中 abrin-a的方法 。
1　材料与方法
1.1　仪器和试剂
日本岛津产 HPLC 仪(LC -10A 型),配置
SPD-10A VP 紫外可见检测器 ,CLASS-VP 工作
站柱温箱及 CLASS-VP 工作站;UV2501 紫外可
见分光光度计为日本岛津产品 。 abrin-a 标准品
(自制 , 经急性毒性试验 、N末端序列测定及肽质
量指纹谱鉴定确定 ,质量浓度为 1 882.4 μg/mL ,
纯度为 97.7%)。流动相为 0.5 mol/L ,的磷酸盐
缓冲液(PB ,pH 7.3)。
1.2　Abrin-a标准溶液的配制及标准曲线制备
取 abrin-a 标准 品 500 μL , 加入等 体积
1.0 mol/L PB(pH 7.3)混匀 ,再将此溶液分别用
流动相作 1∶2 ,1∶10 ,1∶20 ,1∶40 ,1∶80 ,1∶160 ,1∶320
倍稀释 , 配成 941.200 , 188.240 , 94.120 , 47.060 ,
23.530 , 11.765 , 5.883 μg/mL 的系列标准溶液。
分别取 10 μL ,重复进样 5次进行 HPLC分析 。以
abrin-a含量为横坐标 、峰面积平均值为纵坐标制
作标准曲线 ,数据采用SPSS 软件分析 。
1.3　样品制备与测定
称取香肠粉碎样品 8 g(准确至 0.01 g)于三
角瓶中 ,加入 40 mL 流动相溶液 ,添加一定量的
abrin-a 标准品溶液后充分匀浆 5 min ,高速离心
(4℃,10 000 g , 20 min),取上清 。再以 20 mL ×2
次流动相溶液匀浆 ,离心。合并 3 次上清液 ,过
0.45 nm滤膜 ,滤液中 abrin-a 采用 Sepharose 6B亲
和层析法富集。将Sepharose 6B 亲和层析柱用 10
倍柱床体积的流动相溶液平衡 ,将上述滤液以
0.5 mL/min的速度上样 ,上样完毕继续用流动相
洗脱至吸光度值低于 0.05 ,换用含 0.1 mol/L D-
半乳糖的流动相溶液洗脱。收集蛋白峰 ,精确定
容至 10 mL ,过 0.45 nm 滤膜 ,滤液供 HPLC 分析
用。同时将未添加 abrin-a 的香肠样品以同样方
法处理后作为空白对照。
取一定量的 abrin-a 标准品加水(室温)定容
至 25 mL并充分混匀 ,作为水加标样品 。将此水
样用等体积1.0mol/L PB(pH 7.3)混匀 ,按上述方
法用 Sepharose 6B 亲和层析柱富集 abrin-a , 过
0.45 nm滤膜 ,滤液供 HPLC分析用。同时取未添
加 abrin-a 的水样以同样方法处理后作空白对照。
1.4　精密度试验
吸取同一浓度的 abrin-a 标准溶液 10 μL ,按
所建立的色谱条件 ,重复进样 6次进行分析。
1.5　回收率试验
在空白香肠及水样品中分别加入一定量的
abrin-a标准品 ,按本文“1.3”方法处理并制备出高
(546.720 μg/mL)、 中 (145.729 μg/mL)、 低
(12.757μg/mL)的 3个 abrin-a浓度的加标香肠和
水样品 。分别吸取 10 μL上述溶液进样测定 ,重
843李小兵等:加标香肠及水样品中相思子毒素-a高效液相色谱检测
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
复3次 。
2　结果与分析
2.1　HPLC条件的确立
经235.0 ～ 360.0 nm 波长范围内连续扫描 ,获
得 abrin-a 紫外光谱图 , 其最大吸收波长为
280 nm ,故选择 280 nm 作为 abrin-a 色谱分析的检
测波长 。色谱柱:Shodex Protein KW-802.5 , 以
0.5 mol/L PB(pH 7.3)为流动相 ,上样量 10 μL ,流
速为 1 mL/min ,柱温 25℃时 , abrin-a 的保留时间
为(9.800 ±0.025)min(n =25 , 变异系数 =
0.20%)。
2.2　Abrin-a标准曲线的建立
由表 1计算出 abrin-a 含量与峰面积的标准
曲线方程:Y =701.827X -3 260.425 , (r2)=
1.000。在 11.765 ～ 941.200μg/mL 范围内 , abrin-a
质量浓度与峰面积呈良好的直线相关。
表 1　Abrin-a的含量和峰面积
Table 1.Content and peak area of abrin-a
ρ(abrin-a)/
(μg·mL-1)
测定次数
Number of
times
峰面积平均值
Mean value of
peak area
abrin-a推测值/
(μg·mL -1)
Reference value
5.883 5 1 486 6.763
11.765 5 5 170 12.012
23.530 5 12 601 22.600
47.060 5 29 275 46.358
94.120 5 60 971 91.520
188.240 5 131 303 191.733
941.200 5 657 026 940.811
　　由表 1可以得出 ,较低质量浓度时 , abrin-a实
际含量与估计含量的误差较大(相对误差约为
15%);但在 abrin-a 浓度较高时 ,误差很小(相对
误差约为 2%)。因此 , 采用该标准曲线测定
abrin-a时 ,样品中 abrin-a含量应该大于10 μg/mL。
2.3　精密度及回收率
由表 2可见 ,同一浓度标准品 6次重复测定
结果变异系数小于 2%,表明该方法有很高的精
密度 。
表 2　Abrin-a测定的精密度
Table 2.Detection precision of abrin-a
序号
Serial
number
保留时间/min
Retention time
峰面积
Peak area
测定值/
(μg·mL -1)
Measure value
1 9.82 28 131 44.728
2 9.79 29 350 46.465
3 9.80 29 139 46.164
4 9.78 29 542 46.739
5 9.83 29 212 46.268
6 9.82 29 375 46.501
平均±标准差 X+SD 46.144±0.722
变异系数/ %
CV 1.56
由表 3和表 4 可以看出 ,线性范围内高 、中 、
低含量的加标香肠及水样品 abrin-a 回收值变异
系数为0.65 ～ 7.93%,平均回收率分别为 104.6%
和 97.9%,表明该方法的回收率比较高 。
表 3　香肠加标测定
Table 3.Detection of sausage samples contaminated by abrin-a
ρ(abrin-a)/
(μg·mL-1) 次数Number of times 峰面积Peak area
平均回收值/(μg·mL-1)
Average value of
recovery
变异系数/ %
CV
回收率/ %
Recovery rate
546.720 3 386 581 555.468±3.611 0.65 101.6
145.792 3 103 051 151.478±2.000 1.32 103.9
12.757 3 6 427 13.803±0.874 6.33 108.2
表 4　水加标测定
Table 4.Detection of water samples contaminated by abrin-a
ρ(abrin-a)/(μg·mL-1) 次数Number of times 峰面积Peak area 平均回收值/(μg·mL
-1)
Average value of recovery
变异系数/ %
CV
回收率/ %
Recovery rate
546.720 3 370 466 532.505±9.319 1.75 97.4
145.792 3 95 888 141.272±4.605 3.26 96.9
12.757 3 5 630 12.668±1.005 7.93 99.3
844　　　吉林农业大学学报　2008年 12月
Journal of J ilin Agricultural University 2008 , December
2.4　最低检测限
取 1∶320 稀释的 abrin-a 标准品(5.883μg/
mL)进行HPLC分析 ,进样 10μL时信噪比约为 5 ,
进样 7.4μL 时(约44 ng)信噪比约为 3 ,进一步减
少进样量时信噪比<3 ,由此可知该法最低检测限
是44 ng ,具有较高的灵敏度。
3　结　论
本研究利用 abrin 可与琼脂糖凝胶结合的特
点 ,选择 Sepharose 6B 进行 abrin-a 的富集 , 用含
0.1 mol/L 半乳糖的磷酸盐缓冲液洗脱 , abrin-a样
品处理简便 ,处理后香肠样品中的杂质对 HPLC
分析结果影响可以忽略。该方法用于处理人工污
染香肠及水样品时回收率高 、重复性好 。
在本方法色谱条件下 ,无需有机溶剂以及梯
度洗脱等复杂的洗脱条件即可将 abrin-a 与其他
成分有效分离 , abrin-a 保留时间较短[(9.80 ±
0.02)min , n =25] , 线 性 范围 为 11.765 ～
941.200μg/mL ,最低检测限 44 ng 。该分析方法
操作简便 、速度快 、灵敏度较高 、重复性好 ,进一步
验证了 Shodex Protein KW-802.5色谱柱在分离
大分子蛋白质时非特异吸附能力较低 、具有较高
的分辨力以及较高的样品回收率等特点 。
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(上接第 841页)
呈现很大的影响 。加入反冲洗废水后形成具有一
定比例的粗细颗粒搭配 ,能使某些处于未完全脱
稳状态的颗粒在“网捕”和“卷扫”作用下得以去
除 ,但反冲洗废水的比例不宜太大 ,否则由于反冲
洗废水的加入而过高地增加了处理水的浊度 ,抵
消了反冲洗废水中絮凝体对混凝的有利作用[ 7] 。
综上所述 , 反冲洗废水的回用比应控制在
10%以内 ,对试验所用原水的浊度去除来说 ,10%
的回用比约可以节省 20%的混凝剂 。
3　结　论
净水厂滤池反冲洗废水回收利用具有节约水
资源和保护水环境的双重意义 。净水厂直接回用
反冲洗废水可以提高水处理效果 ,节约混凝剂。
但是 ,随着反冲洗废水投加量的增加 ,滤后水细菌
总数明显增加。随着《生活饮用水卫生标准》
(GB5749-2006)的实施 ,对出厂水也有了更高的
要求 ,所以在考虑直接回收利用滤池反冲洗废水
时 ,不能盲目进行 ,特别要关注直接回收利用对供
水生物安全性的影响 。
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