全 文 ：　　收稿日期:2007-02-30
　　基金项目:吉林大学农学部博士科研启动基金资助项目(2006)
　　作者简介:李小兵(1971-),男 ,讲师 ,博士。
＊通讯作者
相思子毒素-a单克隆抗体的制备与鉴定
李小兵1 ,谢光洪1 , 周昌芳1 , 张志刚1 , 宋文学1 ,周晓翠1 ,张乃生1 , 王兴龙2 ,高宏伟2 ,王 　哲1＊ 　
(1.吉林大学 畜牧兽医学院 , 吉林 长春 130062;2.军事医学科学院 军事兽医研究所 ,吉林 长春 130062)
摘要:用含 1%甲醛的磷酸盐缓冲液对相思子毒素-a(abrin-a)减毒处理制备类毒素 , 以类毒素为免疫抗原分 4 次免
疫 3 只 BALB/ c小鼠。采用聚乙二醇(PEG)法 , 取免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/ 0)融合 ,筛选分泌抗 abrin-a
的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株。将阳性细胞株接种 BALB/c小鼠制备 McAb 腹水 , 根据亚类鉴定结果 ,分别
采用蛋白 A 或蛋白 G 亲和层析柱纯化腹水 , 间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 McAb 特异性 , Weste rn-blot 法
分析 McAb 抗原识别位点。 结果获得 1G5 、3C2 和 4G1 共 3 株 McAb 杂交瘤细胞株 , 均为抗 abrin-a 的特异性
McAb ,与相思子凝集素 、蓖麻毒素(ricin)和蓖麻凝集素均无交叉反应 , 其中 4G1 为特异性结合 abrin-a A 链的
McAb , 1G5 和 3C2 两株为特异性结合 abrin-a B链的 McAb;制备的 McAb 可用于 abrin-a含量的检测。
关键词:相思子毒素-a;单克隆抗体;酶联免疫吸附试验(ELIS A);Weste rn-blot
中图分类号:S859.8;Q78　　　文献标识码:A　　　文章编号:1005-4545(2008)07-0836-04
Preparation and identification of monoclonal antibody against abrin-a
LI Xiao-bing1 , XIE Guang-hong 1 , ZHOU Chang-fang1 , ZHANG Zhi-gang 1 , SONG Wen-xue1 , ZHOU
Xiao-cui1 ,ZHANG Nai-sheng1 ,WANG Xing-long2 , GAO Hong-wei2 ,WANG Zhe1＊ 　(1.College o f
Animal S cience and Veterinary Medicine , J i l in Universi ty , Changchun 130062 ,China;2.The Mili-
tary Veterinary I nst itute , Academy o f Mili tary Medical Sciences o f PLA ,Changchun 130062 , Chi-
na)
　　Abstract:Three BALB/ c mice were immunized four times with fo rmalin toxiods pr epar ed by attenua ting the
abrin-a in PBS containing 1% fo rmaldehyde.Using po lye thy lene g ly col(PEG)method , the immunized splenocy tes
were isolated and fused with SP2/ 0 ce lls.Screened hybirdoma cells , which secrete antibodies against abrin-a , were in-
jected into the abdominal cavity of mice.Using P ro tein A affinity chromatog raphy or pro tein G affinity chromatog ra-
phy , the antibodie s we re purified f rom ascites af te r the subtype w ere de te rmined.Indirect enzyme-linked immunoso r-
bent a ssay(ELIS A)was applied to determined the specility of the McAbs , and Western-blot assay w as used to ana-
lyze the antigenic epitopes recognized of M cAbs against abrin-a.Three strains o f hybridomas w ere obtained.These
McAbs we re specific to abirn-a without de tectable cr oss-reactivity with abrus agg lutinin , ricin and ricus agg lutinin ,
the McAb can be used to establish ELISA fo r abrin-a content detection.
　　Key words:abrin-a;McAb;ELIS A;Western-blo t
＊ Corresponding author
　　相思子毒素(abrin)是豆科植物相思子(Abrus
precatorius L .)种子中的一种 Ⅱ型核糖体失活蛋
白 ,是目前所发现的毒性最强的植物毒蛋白之一[ 1] 。
在已报道的 a、b 、c和 d 4种异构体中 ,以 abrin-a 毒
性为最强[ 1-2] 。abrin对某些肿瘤细胞的毒性是对正
常细胞毒性的 100 ～ 1 000倍 ,用其制备的免疫毒素
(I T)在血液中稳定性强于蓖麻毒素(ricin);为此 ,
abrin在恶性肿瘤的治疗上有很好的应用前景[ 3-7] 。
Godal等[ 8] 利用 abrin 和 ricin 的抗血清 ,分别建立
了 abrin和 ricin的放射免疫检测法(RIA),可用于
abrin和 ricin中毒的鉴别 ,也可用于监测免疫毒素
用于肿瘤治疗时血液中的毒素浓度 ,该方法存在一
定的交叉反应 ,应用受到限制。为此 ,本研究拟制备
abrin-a的特异性 McAb ,为建立 abrin-a高特异的免
疫学检测方法打下基础 。
836 　中 国 兽 医 学 报　2008 年 7 月　第 28 卷　第 7 期　Chin J Vet Sci　Jul.2008　Vo l.28 　No .7 　
DOI :10.16303/j.cnki.1005-4545.2008.07.022
1　材料与方法
1.1　材料　BALB/c小鼠(雌性 , 6 ～ 8周龄),长春
生物制品研究所实验动物中心;SP2/0 骨髓瘤细胞
为本室保存并传代;弗氏完全佐剂 、弗氏不完全佐
剂 、聚乙二醇(PEG , MW1400)、二甲基亚砜(DM-
SO)、β-巯基乙醇和抗体亚类鉴定试剂(IgG1 、
IgG2a、IgG2b 、IgG3 、IgM 、IgA)均为 Sigma 公司产
品;Magna PVDF T ransfer Membrane(0.45 μm),
O smonres 公司;HiTrap Pro tein G HP 、HiTrip
rPro tein A FF 、HiTrap Desalting 层析柱 , Pharma-
cia 公司;R/M IN I-1640 培养基 、50×H T 和 50 ×
HAT ,Gibco 公司;BCA 蛋白检测试剂 , Pierce 公
司;辣根过氧化物酶(H RP), Roche 公司;96孔酶标
板 , NUNC 公司;96 孔 、24 孔及 6 孔细胞培养板 ,
COS TAR公司生产;abrin-a 、相思子凝集素 、ricin 、
蓖麻凝集素为本室保存 ,经上海基康公司质谱法鉴
定[ 9] ;实验用水为超纯水;其他试剂均为分析纯 。
1.2　仪器　二氧化碳培养箱 、-70℃超低温冰箱 ,
SAN YO 公司;超纯水仪 , M illipo re 公司;HI98128
型酸度计 , HANNA 公司;酶联免疫检测仪及洗板
机 ,Bio-Rad550型;核酸蛋白检测仪 , BAKMAN 公
司;垂直板电泳仪(槽)、转移电泳槽 , BIO-RAD 公
司。
1.3　方法
1.3.1 　类毒素免疫抗原制备　参考文献方法进
行[ 10] 。取 abrin-a(2.0 g/ L)5 mL 装于透析袋内 ,对
含 1%甲醛的 10 mmo l/L PBS(pH8.0)在 4℃透析
4 d ,再对 1 000倍体积的 10 mmol/L PBS于 4℃透
析 24 h除甲醛 ,中途换液 4 次 ,取出分装后-20℃
保存 。
1.3.2　小鼠免疫　首先将类毒素与福氏完全佐剂
等量混匀 ,按50 μg/只头颈部皮下多点注射 BALB/
c小鼠;用福氏不完全佐剂乳化类毒素 ,分别在首免
后 14 、28 d进行二免和三免 ,剂量为 30 μg/只 ,腹腔
注射;首免后 42 d通过静脉注射无佐剂类毒素加强
免疫 1次 ,剂量为 50 μg/只;首免后 46 d无菌取脾
细胞进行融合。
1.3.3　间接 ELISA 检测方法的建立　按常规间接
ELISA 操作步骤 ,采用方阵法确定抗原最佳包被浓
度 、抗体最佳工作浓度及判定标准 ,P/N≥2.1判为
阳性 ,否则为阴性;用于抗血清及 McAb效价检测。
1.3.4　细胞融合及筛选　参考文献方法进行[ 11] 。
脾细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞按 10∶1 ,采用 PEG 法
融合 ,再用含 20%小牛血清的 HAT 培养基重悬细
胞 ,精确计数并调整浓度后 ,加入铺有饲养细胞的
96孔细胞培养板中 ,每孔 1滴 ,每滴 1 ～ 2个细胞 ,
于 37℃、5%CO 2 及饱和湿度的培养箱中培养。于
培养后 3 d 每孔补加 1滴 HA T 培养液 , 6 、9 、12 d
半量换液 ,到 14 d换为 HT 培养基 ,待克隆长至 1/3
～ 1/2时 ,取培养上清采用间接 ELISA 法筛选 。阳
性孔采用有限稀释法作 3 ～ 4次亚克隆 ,直到所有克
隆孔的细胞都是阳性为止。建株的杂交瘤细胞再扩
大培养 、冻存和制备腹水。
1.3.5　腹水制备及纯化　取 8 ～ 10 周龄 BALB/c
小鼠 ,腹腔注射 0.5 mL 无菌石蜡油 , 7 ～ 10 d后取
对数生长期的阳性杂交瘤细胞株 ,用无血清 PRMI-
1640培养液洗涤 、重悬 ,按照每只 6×105/mL 的量
腹腔注射 , 7 ～ 10 d 后收集腹水。将收集到的腹水
置 37℃温箱 2 h ,再转入 4℃冰箱过夜 ,次日 4000 r/
min离心 10 min ,取上清于-20℃冰箱冻存备用或
立即按照鼠源 McA b亚类鉴定试剂盒说明进行免
疫球蛋白 IgG亚类鉴定。
根据亚类鉴定结果 , 采用 Hitrap rPro tein A
Sephro se FF 亲和柱或 Hitrap Pro tein G HP 亲和
柱纯化腹水中的 McAb。参考 BCA 蛋白检测试剂
盒使用说明 ,采用标准试管法测定 McAb浓度。
1.3.6　McAb效价检测　采用间接 ELISA 法测定
杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水效价 。
1.3.7　特异性鉴定　分别同时以 1 mg/L 和 100
mg/ L 的相思子凝集素 、ricin 和蓖麻凝集素等 3种
类似物包被酶标板 ,采用间接 ELISA 法检测 McAb
特异性 ,SP2/0培养上清作阴性对照 , P/N ≥2.1判
定为阳性反应 ,否则为阴性反应 。
1.3.8　Western-blot 分析　SDS-PAGE 电泳分离
abrin-a及经 β-巯基乙醇处理后的 abrin-a ,采用含
10%甲醛的 CAPS 电印迹缓冲系统转膜 ,以腹水为
一抗 ,辣根酶标记的羊抗鼠 IgG 为二抗 , TMB 显
色 。
2　结果
2.1　杂交瘤细胞株的建立　使用 abrin-a 类毒素免
疫 BALB/c小鼠4次后 ,3只小鼠抗血清效价均在 1
∶1.0×105 以上。采用聚乙二醇化学融合方法 ,进
行了 3次细胞融合 ,共筛选出 3株杂交瘤细胞 ,分别
命名为 1G5 、3C2和 4G1 ,经过 4次亚克隆 , 100%的
检测孔保持了分泌抗 abrin-a抗体的能力。
2.2　McAb 的特异性　间接 ELISA 法测定1G5 、
3C2和 4G1与相思子凝集素 、ricin 及蓖麻凝集素等
3种类似物交叉反应结果见表 1。当 3 种类似物包
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被质量浓度高达 100 mg/L 时 , P/N 值均小于 2.1 ,
为阴性反应。表明 3 株 McAb 1G5 、3C2和 4G1 与
相思子凝集素(abrus AGG)、ricin 及蓖麻凝集素
(ricus AGG)等 3种类似物无交叉反应 。
表 1　McAb 与 3种类似物间接 ELISA 反应结果
D450
抗原/
(m g· L -1)
M cAb
1G5 3C2 4G1 NC
ab rin-a 0.06 2.240 2.105 2.135 0.052
ricin 1 0.065 0.063 0.064 0.054
100 0.087 0.076 0.065 0.059
abrus AGG 1 0.047 0.044 0.046 0.050
100 0.054 0.057 0.059 0.051
ricus AGG 1 0.055 0.053 0.053 0.056
100 0.079 0.075 0.070 0.060
　　注:NC为阴性对照
2.3　McAb 的亚类鉴定和纯化　McA b亚类鉴定
结果表明 ,1G5为 IgG1 亚类 , 3C2 、4G1均为 IgG2b
亚类 。根据亚类特点 , 4G1 、3C2 腹水采用 Hitrap
rPro tein A Sephrose FF 亲和柱纯化 ,1G5腹水采用
Hitrap Protein G HP 亲和柱纯化。BCA 标准试管
法测定纯化后的 3C2 、4G1 、1G5 蛋白质量浓度分别
为:3.0 、8.0和 1.2 g/L。
2.4 　McAb 的效价 　间接 ELISA 法测定 1G5 、
3C2 、4G1细胞培养上清的效价分别为 1∶400 、1∶
600和 1∶800;腹水效价分别为 1∶2.0×104 , 1∶
3.2×105 和 1∶3.2×105 。
2.5　Western-blot分析　3株 McAb 1G5 、3C2 、4G1
均可与完整的 abrin-a 特异性结合 ,其中 4G1 可特
异性识别并结合 abrin-a A 链 , 1G5 、3C2可特异性
识别并结合 abrin-a B链(图 1 ～ 4)。
图 1　abrin-a 和相思子凝集素 SDS-PAGE 电泳结果　1.小
分子蛋白质量 Marke r;2.相思子凝集素;3.完整的
abrin-a;4.经 β-二巯基乙醇处理后的相思子凝集素;
5.经 β-二巯基乙醇处理后的 abrin-a
图 2　1G5 Weste rn-blot结果　1.经β-二巯基乙醇处理后的
abrin-a;2.小分子蛋白质量 Marker;3.完整的 abrin-
a;4.空白对照;5 , 6.经 β-二巯基乙醇处理后的 abrin-
a
图 3　3C2 Weste rn-blot结果　1.经 β-二巯基乙醇处理后的
abrin-a;2.小分子蛋白质量 Marker;3.完整的 abrin-
a;4.经 β-二巯基乙醇处理后的 abrin-a
图 4 　4G1 Weste rn-blot 分析结果　1.小分子蛋白质量
Marker;2.完整的 abrin-a;3.空白对照;4.经 β-二巯
基乙醇处理后的 abrin-a
3　讨论
abrin是一种大分子植物蛋白 ,免疫原性好 ,但
由于其高毒性(小鼠的 LD50为 2 ～ 20 μg/kg),通常
采用甲醛减毒处理 ,以低毒的类毒素作为免疫抗原
838 　中 国 兽 医 学 报　2008 年 7 月　第 28 卷　第 7 期　Chin J Vet Sci　Jul.2008　Vo l.28 　No .7 　
制备抗血清[ 9-10] 。本研究利用相思子类毒素免疫 3
只 BA LB/c小鼠 4次之后 ,均获得较满意的免疫效
果 ,利用小鼠杂交瘤细胞技术 ,成功筛选出 3株分泌
抗相思子毒素的 McAb 杂交瘤细胞株 ,再次证明使
用 1%甲醛处理 abrin-a 的方法在明显降低毒性的
同时 ,还可很好地保留 abrin-a 的免疫原性。
鉴于 abrin-a与相思子凝集素 、ricin 、蓖麻凝集
素等 II 型核糖体失活蛋白结构相似 ,抗 abrin-a 的
多克隆抗体(PcA b)与这些类似物存在一定程度的
交叉反应[ 8 , 12] 。间接 ELISA 法结果表明 ,本试验制
备得到的 3株抗 abrin-a的 McAb与上述 3种类似
物均没有交叉反应 ,说明了针对单个抗原决定簇的
McAb比 PcA b 具有更高的特异性;Western-blo t
分析进一步表明 ,4G1与 1G5 、3C2 的抗原结合位点
不同 , 4G1 为特异抗 abrin-a A 链的 McA b , 1G5 、
3C2均为特异性抗 abrin-a B 链的 McAb ,这为今后
abrin-a的定量检测和亲和层析奠定了基础 。
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