全 文 ：书民 族 医 药
Ethnomedicine and Ethnopharmacy
基金项目:国家自然科学基金项目 (编号 81360522)。
作者简介:王雅莉 (1975 －)，女，副教授。研究方向:免疫与分子生物学。
通信作者:景明 (1963 －)，男，教授，硕士研究生导师。研究方向:中藏药新制剂开发研究。
藏药湿生扁蕾对人结肠癌细胞 SW480 增殖调控因子
CyclinD1、CDK4、PCNA和 p21
kip1·mＲNA表达的影响
王雅莉1* 景 明1，2* 张艳霞1，2 陈正君1 高 娜1 赵慧巧1 刘娟娟1 苏永春3
1． 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000;2． 甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000;
3． 甘肃省武威肿瘤医院，甘肃 武威 733000
【摘 要】 目的:探讨藏药湿生扁蕾对人结肠癌细胞 SW480 增殖调控因子 CyclinD1、CDK4、PCNA 和 p21kip1·mＲNA 表达的影响。
方法:将 SW480 细胞接种于 6 孔培养板，24h后分别用不同浓度 (0. 25、0. 50、1. 00 mg /ml)的湿生扁蕾干预，继续培养 24h，提取每组总
ＲNA，以 GAPDH基因为内参，采用 ＲT － PCＲ 法检测 CyclinD1、CDK4、PCNA 及 p21kip1的 mＲNA 表达水平。结果:PCNA、CyclinD1 及
CDK4 的 mＲNA表达随湿生扁蕾浓度增加而减少，而 p21kip1 mＲNA的表达随湿生扁蕾浓度增加而增加，并呈现明显的剂量依赖关系。结论:
藏药湿生扁蕾干预 SW480 细胞的增殖与其抑制 CyclinD1、CDK4、PCNA的表达和促进 p21kip1的表达作用有关。
【关键词】 藏药湿生扁蕾;结肠癌 SW480 细胞;增殖调控因子
【中图分类号】Ｒ29 【文献标志码】A 【文章编号】1007 － 8517 (2014)03 － 0001 － 02
结直肠癌 (ColoreetalCarcinom，CＲC)是当今世界上最
常见的恶性肿瘤之一。在西方发达国家，其发病率高居恶
性肿瘤的第 2 位。随着经济的发展和人均寿命的延长、生
活方式和膳食结构的改变，我国结直肠癌的发病率也明显
上升，每年新增病例己超过 17 万，尤其在天津、上海等大
城市更为突出，男性高居第 3 位，女性仅次于乳腺癌而居
第 2 位［1、2］。且其发病递增速度已达世界均数的两倍，我国
已全面进入结直肠癌高发地区行列。如何有效的预防和治
疗 CＲC，成为医学界高度关注的重要课题之一。此病在临
床治疗方面，虽然以手术、药物为基础的联合化疗、放疗
等治疗手段为患者带来了希望。但治疗过程中常用的化疗
药普遍存在价格高、毒副作用大的缺点。因此，寻找、研
制高效、低毒的药物就成为目前 CＲC 治疗中迫待解决的
问题。
藏药湿生扁蕾 (GentianopsispaludosaMa)为藏族民间
常用草药，为 1 年生草本，分布于青海海北、黄南、玉树
等地区。具有消热、解毒和利湿消黄等功效［3］。近年来倍
受关注。目前，有关其化学成分及临床应用已经成为研究
重点，且多集中在其有效成分的分离、提取、药理作用等
方面。由于其重要的药用价值，开发利用有着广阔的市场
前景。湿生扁蕾现已在甘肃、青海作为重要藏药进行深度
开发［4］。
前期研究发现，藏药湿生扁蕾的提取物可抑制人结肠
癌细胞 SW480 的增殖，并诱导其凋亡。本研究观察了湿生
扁蕾对 SW480 细胞增殖调控因子 CyclinD1、CDK4、PCNA
及 p21kip1表达的影响，探讨藏药湿生扁蕾干预 SW480 细胞
增殖的分子机制，为结肠癌的治疗和新药开发开拓思路。
1 实验材料与方法
1. 1 实验材料①药物:藏药湿生扁蕾提取物 (GTP，由甘
肃中医学院科研实验中心提供)，规格 10g 原药材 /1g 提取
物浸膏;②细胞:结肠癌 SW480 细胞株)，购自齐氏生物
科技有限公司;③主要试剂:DMEM 培养基 (Hyclone 公
司)，0. 25%胰蛋白酶 (trypsin，Hyclone 公司)，胎牛血清
(FBS，Hyclone 公司)，PBS (磷酸盐缓冲液，Hyclone 公
司)，二甲亚砜 (DMSO，Gibco 公司)，ＲT 试剂盒 (Pro-
mega公司)，Trizol 试剂盒 (Invitrogen 公司)，PCＲ 试剂盒
(Promega公司)，Taq 聚合酶 (TaKaＲa 公司)，PCＲ 引物
(上海英俊生物有限公司);④主要仪器:超净工作台 (苏
州净化设备公司)，二氧化碳培养箱、5417Ｒ高速冷冻离心
机 (德国 Heraeus公司)，9600 型 PCＲ仪 (美国 PE公司)，
Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统、APC 300 型电泳仪和
水平式电泳槽 (美国 Bio － Ｒad 公司)，DU － 650 型蛋白核
酸分析仪 (美国 Beckman公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 SW480 细胞的培养 采用常规培养 SW480 细胞，培
养液为含有 10%小牛血清及青、链霉素各 100u /ml DMEM
液，在 37℃，饱和湿度，5%CO2 孵箱中培养，细胞单层贴
壁生长至 80%左右融合时，以 0. 25%胰蛋白酶 /EDTA消化
后传代培养。
1. 2. 2 SW480 细胞分组 处于对数生长期的细胞分成以下 4
组:空白对照组 (加等体积的 PBS)、湿生扁蕾低剂量组
(0. 25mg /ml)、湿生扁蕾中剂量组 (0. 5mg /ml)和湿生扁
蕾高剂量组 (1. 0mg /ml)。
1. 2. 3 ＲT － PCＲ 检测 CyclinD1、CDK4、PCNA 及 p21 的
mＲNA的表达水平 SW480 细胞经胰酶消化后，接种于 6 孔
培养板，细胞数约为 2 × 105 个 /孔，24h后分别以不同浓度
的湿生扁蕾干预，培养 24h后，提取每组总 ＲNA。
1. 2. 3. 1 细胞总 ＲNA 的提取 按照 Trizol 试剂盒操作说明
方法进行，随后取 2μgＲNA 按照逆转录反应试剂盒要求配
制反应体系进行反转录，反转录后产物置于 － 20℃保存，
用于 PCＲ扩增。
1. 2. 3. 2 目的基因 PCＲ 扩增 在 NCBI 上查目的基因全序
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Chinese journal of ethnomedicine and ethnopharmacy
民 族 医 药
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列，利用 Premier5. 0 软件设计引物序列。CyclinD1:F:5
－ TGG ATG CTG GAG GTC TGC GAG GAA － 3，Ｒ:5 －
GGC TTC GAT CTG CTC CTG GCA GGC － 3;CDK4:F:5
－ CAT GTA GAC CAG GAC CTA AGC － 3，Ｒ:5 － AAC
TGG CGC ATC AGA TCC TAG － 3;PCNA:F:5 － GCT
GAC ATG GGA CAC TTA － 3，Ｒ:5 － CTC AGG TAC AAA
CTT GGT G － 3;p21kip1:F:5 － GCG ACT GTG ATG CGC
TAA TGG － 3，Ｒ:5 － TAG AAA TCT GTC ATG CTG GTC
TGC － 3;GAPDH:F:5 － CG ACC ACT TTG TCA AGC
TCA － 3，Ｒ:5 － AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG － 3。
取 cDNA 1. 0?l，加 10 × Taq Buffer 2. 0?l，25 mM Mg2 +
1. 2μl，10 mM dNTP0. 4μl，上下游引物各 0. 4? l，1U /
mlTaq酶 0. 6μl，DEPC水 14. 0μl 配成 20μl 的总反应体积。
在 95℃预变性 3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35 个循
环，72℃10min。扩增产物 4℃保存，用于琼脂糖凝胶电泳。
1. 2. 3. 3 PCＲ产物表达 取 PCＲ 扩增产物 10μl，加 2μl 的
loading buffer (6 ×)充分混匀后，加到 1. 5%琼脂糖凝胶上
样孔中，通电，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿时停止
电泳。
2 结果
SW480 细胞经不同浓度湿生扁蕾提取物作用 24 h 后，
CyclinD1、CDK4、PCNA mＲNA的表达随药物浓度增加而减
少，而 p21kip1m ＲNA表达随药物浓度增加而增多，并呈现
明显的剂量依赖关系。见图 1。
图 1 湿生扁蕾对 SW480 细胞 Cyclin D1、CDK4、PCNA和
p21kip1的 mＲNA表达的电泳图 (内参 GAPDH)
3 讨论
适度的细胞增殖和凋亡是维持细胞群体数量稳定的重
要条件，其调控错综复杂，受到细胞内、外多种因素和环
节的影响，其中任何一个环节发生障碍，都可导致疾病的
发生。肿瘤的发生主要特点是细胞凋亡不足，增殖过度，
细胞群体稳态被破坏，导致病变细胞异常增多，病变组织
器官体积增大，功能异常［5］。
CDK是细胞周期运转的驱动力量之一，其激活依赖于
与 Cyclin的结合和其中某些氨基酸残基的磷酸化状态。当
Cyclin浓度升高到阈值时，可作为调节亚基与催化亚基
CDK结合形成复合物，驱动细胞周期的运行。当一些增殖
信号 (生长因子、丝裂原等)与细胞膜上的相应受体结合
后，可启动细胞内的信号转导，促进 CyclinD1 的合成，Cy-
clinD1 与 CDK4 相结合后，使抑制蛋白 (Ｒb)磷酸化而丧
失抑制转录因子 E2F的作用，游离的 E2F激活 DNA合成基
因，促使细胞从 G0 进入 G1 期［6］。除了促进细胞进入细胞
周期进行分裂外，研究还发现，CyclinD1可以结合组蛋白去
乙酰基酶 P /CAF，亦可以结合转录因子 TFⅡD［7］等，通过
和这些转录因子的结合，起到促进细胞周期运行的作用，
而起过度表达则可致细胞增殖失控而发生恶性化。
PCNA也是一种细胞周期相关蛋白，但它不与 CDK 相
结合，而是作为 DNA 聚合酶的附属蛋白，促进 DNA 的延
伸，在 G1 晚期，其表达大幅度增加，S 期达到高峰，G2 ～
M期明显下降，其量的变化与 DNA合成一致，检测其在细
胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标［8］。
p21kip1能特意抑制 CDK 蛋白的功能，对细胞有抑制作
用，一旦细胞受到毒素或辐射损害，p21kip1可与 CyclinD /
CDK结合并抑制其活性，减少 pＲb 蛋白磷酸化，引起 G1
期阻滞促进修复，调控细胞周期确保遗传物质精确的传递
给下一代，以消除 DNA损伤而引发肿瘤［9］。
实验结果表明，藏药湿生扁蕾作用结肠癌 SW480 细胞
24 h后，与对照组比较，CyclinD1、CDK4、PCNA mＲNA 的
表达减少，p21kip1·mＲNA的表达增多，并呈现明显的剂量
依赖关系。说明湿生扁蕾引起结肠癌 SW480 细胞凋亡可能
与其抑制 CyclinD1、CDK4、PCNA mＲNA 的表达和促进
p21kip1·mＲNA的表达有关，而通过湿生扁蕾对 SW480 细
胞周期及增殖的调控可能有助于对结肠癌患者的病情治疗。
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(收稿日期:2013. 12. 16)
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