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2014 年 7 月 19 日收稿
△基金项目:国家自然科学基金项目，编号 81360522
作者简介:高娜，讲师。E － mail:gaonn08@ 163． com
* 通讯作者:景明，教授。电话(0931)8765390，E － mail:jm@
gszy． edu． cn
藏药湿生扁蕾对人结肠癌 SW480 细胞凋亡调控因子 Bcl － 2
及 Bax的 mＲNA表达的影响△
高 娜1 景 明2* 张艳霞2 王雅莉3 陈正君3
( 1．甘肃中医学院定西校区，甘肃 兰州 743000;
2．甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州 730000;
3．甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000)
摘 要:目的:探讨藏药湿生扁蕾对 SW480 细胞凋亡调控因子 Bcl － 2mＲNA及 BaxmＲNA表达的影响。方法:SW480 细胞接
种于 6 孔培养板中，24 h后分别以不同浓度( 250、500、1000 μg /ml) 的湿生扁蕾干预，继续培养 24h后，提取每组总 ＲNA，以
GAPDH和 β － actin基因为内参，采用 ＲT － PCＲ法检测 Bcl － 2 及 Bax的 mＲNA表达水平。结果:Bcl － 2 mＲNA表达随湿生
扁蕾浓度增加而减少，而 Bax mＲNA表达随湿生扁蕾浓度增加而增加，并呈现明显的剂量依赖关系。结论:藏药湿生扁蕾
干预 SW480 细胞凋亡与其抑制 Bcl － 2 的表达和促进 Bax的表达有关。
关键词:藏药湿生扁蕾; SW480 细胞; Bcl － 2; Bax
中图分类号:Ｒ291． 4 文献标识码:B 文章编号:1006 － 6810(2014)09 － 0051 － 03
结肠癌(colorectal cancer，CＲC)是常见的消化道系统
恶性肿瘤之一。据统计，全世界每年结肠癌的新增人数高
达 120 万，死亡患者约 60． 87 万［1］，严重威胁着人们的生活
与健康。而在北美、欧洲各国，结肠癌的死亡率在癌症死亡
原因中高居第 2 位［2］。随着我国人民生活水平的改善和
饮食结构的改变，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势［3］。目
前，虽然西药在以外科手术为主的综合治疗方面取得了一
定的进展，但其 5 年生存率仍维持在 50%左右［4］，导致临
床治疗失败和患者死亡的主要原因是肿瘤的易复发、转移
生物学特性及其耐药性［5，6］;其次是治疗结肠癌化疗药物
的较大毒副作用。因此，进一步深入探讨结肠癌发病机制，
探寻低毒有效的抗肿瘤药物是当前临床研究的热点课题，
也是肿瘤防治工作者面临的迫切任务之一。
藏药湿生扁蕾具有清热解毒、健脾止泻的功效，藏医用
全草治疗肠炎、痢疾、腹泻等疾病在临床上取得了很好的疗
效［7］。近年来，随着对湿生扁蕾有效成分研究的深入，其
功效也不断被发现。有研究表明，湿生扁蕾提取物能够抑
制动物体内 S180 肉瘤及其它瘤株的生长［8］，此药中的 1 －
羟基 － 3，7，8 －三甲氧基口 山 酮及 1，7 －二羟基 － 3，8 －
二甲氧基口 山 酮对卵巢癌细胞 HO － 8910 也具有毒性作
用［9］。本实验研究藏药湿生扁蕾影响 SW480 细胞凋亡的
调控因子 Bcl － 2 及 Bax 的 mＲNA 表达，并探讨其相关机
制，为结肠癌的治疗和新药开发开拓思路。
1 仪器与试药
1． 1 试验药物:藏药湿生扁蕾提取物的制备:取湿生扁蕾
药材，粉碎，过四号筛，称取粉末 100g，加 15 倍量 70%乙醇
回流提取 1． 5h，滤取药液，药渣再用 12 倍量 70%乙醇回流
提取 1． 5h，合并两次药液，滤过，滤液回收乙醇后备用。药
渣挥尽乙醇，加 12 倍量水煎煮 1． 5h，滤过，滤液减压浓缩
后与醇提浸膏合并，冷冻干燥，即得。
湿生扁蕾提取物供试液的制备:称取湿生扁蕾提取物
50 mg，用 0． 02%二甲基亚砜溶解，抽滤除菌，－ 20℃保存
备用。需要时(用生理盐水)稀释至工作液。
1． 2 细胞株:人结肠癌 SW480 细胞株购自江苏江阴齐氏
152014 年 9 月第 9 期 中国民族医药杂志
生物科技有限公司。
1． 3 试剂:DMEM培养基(Hyclone公司);胎牛血清(FBS，
Hyclone公司);0． 25%胰蛋白酶(trypsin，Hyclone 公司);二
甲亚砜(DMSO，Gibco 公司);PBS(磷酸盐缓冲液，Hyclone
公司);Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司);ＲT 试剂盒和 PCＲ
试剂盒(Promega 公司);PCＲ 引物(上海英俊生物有限公
司)。
1． 4 仪器:超净工作台(苏州净化设备公司);二氧化碳培
养箱(德国 Heraeus 公司);9600 型 PCＲ 仪(美国 PE 公
司);Gel DOC 2000 型凝胶成像分析系统;5417Ｒ 高速冷冻
离心机(德国 Eppendorf公司);APC 300 型电泳仪和水平式
电泳槽(美国 Bio － Ｒad公司)。
2 方法与结果
2． 1 SW480 细胞的培养:采用常规培养 SW480 细胞，培养
液为含有 10% 小牛血清及青、链霉素各 100u /ml DMEM
液，在 37℃，饱和湿度，5%CO2 孵箱中培养，细胞单层贴壁
生长至 80% ～ 90%融合时，以 0． 25%胰蛋白酶 /EDTA 消
化后传代培养，处于对数生长期的细胞用于实验。
2． 2 ＲT － PCＲ法检测 Bc1 － 2 和 Bax的 mＲNA表达:对数
生长期的 SW480 细胞经胰酶消化后，接种于 6 孔培养板
中，细胞数量约为 2 × 105 个 /孔，24 h 后分别以不同浓度
(250、500、1000 μg /ml)的湿生扁蕾提取物干预，继续培养
24h后，提取每组总 ＲNA。
2． 2． 1 细胞总 ＲNA 的提取:按照 Trizol 试剂盒说明方法
进行，随后取 2μgＲNA按照逆转录反应试剂盒要求配制反
应体系进行反转录，反转录后产物置于 － 20℃保存，用于
PCＲ扩增。
2． 2． 2 目的基因 PCＲ 扩增:在 NCBI 上查目的基因全序
列，利用 Premier5． 0 软件设计引物序列。Bcl － 2:F:5 －
CAG CTG CAC CTG ACG CCC TT － 3，Ｒ:5 － GCC TCC
GTT ATC CTG GAT CC － 3;Bax:F:5 － TGC TTC AGG GTT
TCA TCC AGG －3，Ｒ:5 － TGG CAA AGT AGA AAA GGG
CGA －3;GAPDH:F:5 － CG ACC ACT TTG TCA AGC TCA
－ 3，Ｒ:5 － AG GGG TCT ACA TGG CAA CTG － 3;β － ac-
tin:F:5`－ GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCCTA － 3 ，`Ｒ:5`－
GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG － 3 。`取 cDNA 1． 0?
l，加 10 × Taq Buffer2． 0?l，25 mM Mg2 + 1． 2?l，10 mM
dNTP0． 4?l，上下游引物各 0． 4?l，1U /mlTaq 酶 0． 6?l，
DEPC水 14． 0?l配成 20?l 的总反应体积。在 95℃预变
性 3min，94℃40s，55℃40s，72℃45s，35 个循环，72℃10min。
扩增产物 4℃保存，用于琼脂糖凝胶电泳。
2． 2． 3 PCＲ 产物表达:取 PCＲ 扩增产物 10μl，加 2μl 的
loading buffer(6 ×)充分混匀后加到 1． 5%琼脂糖凝胶上样
孔中，通电，电泳至溴酚蓝染料到达凝胶最前沿后停止电
泳。
结果表明，SW480 细胞经不同浓度湿生扁蕾处理 24 h
后，Bcl － 2 mＲNA的表达随浓度增加而减少，而 Bax mＲNA
表达随浓度增加而增多，并呈现明显的剂量依赖关系。湿
生扁蕾对 SW480 细胞 Bcl － 2 mＲNA 及 BaxmＲNA 表达的
电泳图见图 1、图 2。
图 1 湿生扁蕾对 SW480 细胞 Bcl － 2mＲNA
及 BaxmＲNA表达的电泳图(内参 GAPDH)
图 2 湿生扁蕾对 SW480 细胞 Bcl － 2 mＲNA
及 BaxmＲNA表达的电泳图(内参 β － actin)
3 讨 论
细胞凋亡是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序
而导致的细胞死亡过程，适度适时的细胞凋亡是维持细胞
群体数量稳态的重要手段，而如果凋亡失调就会影像机体
的正常生长、发育，并可导致各种疾病［10］。肿瘤是机体在
各种滞留因素的作用下，细胞生长调控发生严重紊乱、细胞
异常增殖而形成的新生物，常表现为局部的异常组织团
块［11］。
目前认为，肿瘤的发生与细胞凋亡不足密切相关。Bcl
－ 2 家族的成员是高等动物中生存和死亡信号重要的整合
因子。该家族成员分为三大类，抗凋亡基因，如 Bcl － 2、Bcl
－ XL等;促凋亡基因，如 Bax、Bak 等;双向调控基因，如 c
－ myc，Bclx［12］。其中 Bcl － 2 和 Bax 表达的比例是决定细
胞凋亡与否的关键。Bcl － 2 本身的活性受相关蛋白 Bax
的调节，Bax 增高时能和 Bcl － 2 形成异二聚体(Bcl － 2 －
Bax)，抑制 Bcl － 2 的功能从而抑制细胞凋亡，反之则形成
二聚体(Bax － Bax)诱导凋亡［13，14］。因此，Bax /Bcl － 2 的比
例决定了细胞对凋亡刺激的敏感性，最终决定了细胞的生
存和死亡。
本实验结果表明，藏药湿生扁蕾作用结肠癌 SW480 细
胞 24 h后，Bcl － 2 mＲNA 的表达减少，而 Bax mＲNA 表达
增多，并呈现明显的剂量依赖关系。说明湿生扁蕾引起凋
亡基因 Bcl － 2、Bax表达的变化可能是其促进 SW480 细胞
凋亡的机制之一，而通过湿生扁蕾对 SW480 细胞 Bcl － 2、
Bax表达的的调节可能有助于改善结肠癌患者的病情及生
存状况。
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2014 年 7 月 21 日收稿
The Effect of Tibetan Medicine Gentianopsis Paludosa
About Colon Cancer SW480 Cell Apoptosis
Ｒegulatory Factors mＲNA Expression of Bcl － 2 and Bax
1Gao La，Jing Ming1，2，Zhang Yanxia1，2，Wang Yali1，Chen Zhengjun1
( 1Gansu college of traditional Chinese medicine，Lanzhou 730000;
2Chinese medicine pharmacology and toxicology key laboratory of Gansu province，Lanzhou 730000)
［Abstract］Objective:Discuss the effect of Tibetan medicine gentianopsis paludosa for SW480 cell apoptosis
regulatory factors Bcl － 2mＲNA and BaxmＲNA． Methods:Inoculate SW480 cell in 6holes culture plate． Inter-
vene in gentianopsis paludosa using different concentration (250，500，1000 μg /ml)after 24h． Continue to de-
velop 24h，and extract each group total ＲNA． Use GAPDH and β － actin gene as internal reference． Then adopt
ＲT － PCＲ assay to detect mＲNA expression level of Bcl － 2 and Bax． Ｒesults:Bcl － 2mＲNA expression are re-
ducing with gentianopsis paludosa concentration increasing． While BaxmＲNA expression is increasing with gen-
tianopsis paludosa concentration increasing，and it presents the obvious dose dependency． Conclusion:Tibetan
medicine gentianopsis paludosa control SW480 cells proliferation． It is connected with inhibition of Bcl － 2 ex-
pression and promoting Bax expression．
［Key words］Tibetan medicine gentianopsis paludosa;SW480 cell;Bcl － 2;Bax
352014 年 9 月第 9 期 中国民族医药杂志