全 文 ：［收稿日期］ 20150720(004)
［第一作者］ 王桂红，主任药师，硕士生导师，从事中药新制剂、新剂型的研究工作，Tel:18986026269，E-mail:843773585@ qq． com
［通讯作者］ * 郑国华，博士，教授，博士生导师，从事中药新制剂、新剂型的研究工作，Tel:027-68890113，E-mail:zgh1227@ sina． com
HPLC测定留兰香中橙皮苷和迷迭香酸的含量
王桂红1，张群2，3，谭永霞2，吴勇2，吴宁3，顾承刚3，郑国华2* ，何建华2，3
(1. 湖北中医药大学 国医堂，武汉 430061;2. 湖北中医药大学 药学院，武汉 430065;
3. 武汉药谷科技开发有限公司，武汉 430075)
［摘要］ 目的:建立留兰香药材中橙皮苷、迷迭香酸的 HPLC含量测定方法。方法:采用戴安高效液相色谱仪，对供试品
溶液的制备方法、流动相等分析条件进行了优化筛选，并对分析方法的线性范围、重复性、加样回收率等进行考察，建立分别
测定橙皮苷、迷迭香酸的留兰香药材质量控制方法。结果:采用 Inertsil ODS-3 C18色谱柱(4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流动相乙
腈-0. 2%磷酸溶液(18∶ 82)等度洗脱，流速 1. 0 mL·min －1，测定留兰香中橙皮苷和迷迭香酸的检测波长分别为 283，330 nm，柱
温分别为 30，35 ℃。回归方程橙皮苷为 Y = 27. 61X + 0. 040 2 (r = 0. 999 9，0. 008 434 ～ 1. 687 μg) ，平均加样回收率为
96. 43%(ＲSD 1. 4%) ;迷迭香酸为 Y = 51. 44X － 0. 172 3(r = 0. 999 9，0. 018 91 ～ 1. 891 μg) ，平均加样回收率为 99. 99%(ＲSD
1. 7%)。结论:该方法简便准确、分离度好、重复性好，可用于留兰香中橙皮苷和迷迭香酸的含量测定。
［关键词］ 留兰香;橙皮苷;迷迭香酸;高效液相色谱法
［中图分类号］ Ｒ284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)06-0038-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016060038
Content Determination of Hesperidin and Ｒosmarinic Acid in
Menthae Spicatae Herba by HPLC
WANG Gui-hong1，ZHANG Qun2，3，TAN Yong-xia2，WU Yong2，WU Ning3，
GU Cheng-gang3，ZHENG Guo-hua2* ，HE Jian-hua2，3
(1. Guoyitang，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430061，China;
2. School of Pharmacy，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，China;
3. Wuhan Yaogu Science and Technology Development Co． Ltd．，Wuhan 430075，China)
［Abstract］ Objective:To develop an HPLC method for determining the content of hesperidin and
rosmarinic acid in Menthae Spicatae Herba． Method:The conditions of sample preparation，chromatography
column and mobile phase were optimized． The linear ranges，reproducibility and recovery rate were evaluated based
on a Thermo Scientific HPLC system to establish the method of quality control for determining the content of
hesperidin and rosmarinic acid in Menthae Spicatae Herba． Ｒesult:HPLC analysis was conducted on a Inertsil
ODS-3 C18 column (4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，which was eluted with the mobile phase of acetonitrile-0. 2%
phosphoric acid (18 ∶82) ，at a flow rate of 1. 0 mL·min －1 under the temperature of 30 ℃，and the detection
wavelength was set at 283 nm for hesperidin，and that of rosmarinic acid was under temperature of 35 ℃，and the
detection wavelength was set at 330 nm． The regression equation of hesperidin was Y = 27. 61X + 0. 040 2 (r =
0. 999 9，0. 008 434-1. 687 μg)and that of rosmarinic acid was Y = 51. 44X － 0. 172 3 (r = 0. 999 9，0. 018 91-
1. 891 μg) ;the average recovery of hesperidin was 96. 43% (ＲSD 1. 4%) ，for rosmarinic acid it was 99. 99%
(ＲSD 1. 7%)． Conclusion:The method is simple，accurate，and repeatable，and so can be used for determining
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the content of hesperidin and rosmarinic acid in Menthae Spicatae Herba．
［Key words］ Menthae Spicatae Herba;hesperidin;rosmarinic acid;HPLC
留兰香［1］具有和中理气、祛风散寒、消肿止痛
之功效，用于伤风感冒、胃气痛、鼻衄、目赤、疔疮热
疥等［2］。现代研究表明，留兰香主要化学成分为黄
酮类、酚酸类、挥发油类成分等。其中橙皮苷具有明
显的抑菌能力，此外还具有抗炎、抑制氧化自由基、
促进胃肠道平滑肌运动的作用［3-4］;迷迭香酸抗炎
活性强，还具有清除自由基及抗氧化作用［5-7］。留
兰香药材收载于《贵州省中药材、民族药材质量标
准》2003 年版，原标准只有性状鉴别，未对药效成分
进行定量检测。本文建立采用高效液相色谱法留兰
香中橙皮苷和迷迭香酸的含量测定方法，为留兰香
的品质选择和质量控制提供试验数据。
1 材料
Ultimate3000 型高效液相色谱系统 (LPG-
3400SD 泵，WPS-3000SL Analytical 自动进样器，
TCC-3000ＲS柱温箱，VWD-3100 检测器，Chromeleon
色谱工作站，塞默飞) ，HH-4 型数显恒温水浴锅(江
苏省金坛市荣华仪器制造有限公司) ，AB135-S 型和
AL204 型电子天平(瑞士梅特勒-托利多) ，613T 型
便携式超声波清洗机(深圳市浩拓电子科技有限公
司)。
橙皮苷(批号 110721-201316，纯度 95. 3%)、迷
迭香酸(批号 111871-201404)对照品均购自中国食
品药品检定研究院。10 批留兰香药材经湖北中医
药大学生药教研室鉴定为唇形科植物留兰香
Mentha spicate的全草。甲醇、乙腈为色谱纯，无水乙
醇、磷酸为分析纯，实验用水为娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2. 1 色 谱 条 件 Inertsil ODS-3 C18 色 谱 柱
(4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，流动相乙腈-0. 2%磷酸
(18∶ 82) ，流速 1 mL·min －1，进样量 10 μL，橙皮苷
检测波长 283 nm，柱温 30 ℃;迷迭香酸检测波长
330 nm，柱温 35 ℃。
2. 2 对照品溶液的制备 精密称取橙皮苷对照品
8. 85 mg，用甲醇超声溶解定容至 50 mL 量瓶中，得
质量浓度为 168. 7 mg·L －1的橙皮苷对照品溶液。
精密称取迷迭香酸对照品 9. 59 mg，用 60%乙醇超
声溶解定容至 50 mL 量瓶中，得质量浓度为 189. 1
mg·L －1的迷迭香酸对照品溶液。
2. 3 供试品溶液的制备 称取留兰香粉末(过三
号筛)约 0. 3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精
密加入 60%乙醇 50 mL，密塞，称定质量，置水浴中
回流 3 h，冷却至室温，用 60%乙醇补足减失的质
量，摇匀，滤过，取续滤液，即得橙皮苷供试品溶液。
称取留兰香粉末(过三号筛)约 0. 3 g，精密称
定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入 60% 乙醇 50
mL，密塞，称定质量，置水浴中回流 5 h，冷却至室
温，用 60%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续
滤液，即得迷迭香酸供试品溶液。
2. 4 系统适应性考察 分别取橙皮苷和迷迭香酸
的对照品溶液和供试品溶液，按照 2. 1 项下色谱条
件进行分析，结果供试品中橙皮苷和迷迭香酸的色
谱峰与其他峰之间得到了很好的分离，色谱分离度
均 ＞1. 5;按橙皮苷和迷迭香酸的色谱峰计算得出的
理论塔板数均 ＞ 4 000;拖尾因子在 0. 95 ～ 1. 05。见
图 1，2。
A．对照品;B． 供试品;1. 橙皮苷
图 1 留兰香中橙皮苷的 HPLC
Fig． 1 HPLC chromatograms of hesperidin in Menthae
Spicatae Herba
2. 5 精密度试验 分别取橙皮苷和迷迭香酸对照
品溶液，按照 2. 1 项下色谱条件，连续进样 6 次。测
得橙皮苷和迷迭香酸峰面积的 ＲSD 分别为 0. 3%
和 0. 5%，表明仪器精密度良好。分别精密称取同
一个批次的样品(批号 20140928)6 份，按 2. 3 项下
方法制备橙皮苷供试品溶液，按 2. 1 项下色谱条件
分别进行测定，得到橙皮苷的平均质量分数为
1. 198%，ＲSD 1. 9%，表明该方法的重复性良好。
2. 6 线性关系的考察 取 2. 2 项下 168. 7 mg·L －1
的橙皮苷对照品溶液，189. 1 mg·L －1的迷迭香酸对
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A．对照品;B． 供试品;1. 迷迭香酸
图 2 留兰香中迷迭香酸的 HPLC
Fig． 2 HPLC chromatograms of rosmarinic acid in Menthae
Spicatae Herba
照品溶液稀释为系列对照品溶液。按照 2. 1 项下色
谱条件，进样分析，以各自的进样量(μg)为横坐标
X，峰面积为纵坐标 Y，绘制标准曲线，得到橙皮苷回
归方程为 Y = 27. 61X + 0. 040 2(r = 0. 999 9) ，表明
橙皮苷在0. 008 434 ～ 1. 687 μg 与峰面积呈良好的
线性关系;迷迭香酸回归方程为 Y =51. 44X －0. 172 3
(r = 0. 999 9) ，表明迷迭香酸在0. 018 91 ～ 1. 891 μg
与峰面积呈良好的线性关系。
2. 7 稳定性试验 取新制备的橙皮苷供试品溶液，
在室温下放置 0，1，2，4，6，8，10，12，24 h 后，按照
2. 1 项下色谱条件来进行测定，记算峰面积，ＲSD
0. 4%。表明橙皮苷的供试品溶液在 24 h 内基本
稳定。
取新制备的迷迭香酸供试品溶液，在室温下放
置 0，2，4，6，8，10，12，16，20，24，30，36，42，48 h 后，
按照 2. 1 项下色谱条件来进行测定，结果峰面积
ＲSD 1. 0%。表明迷迭香酸的供试品溶液在 48 h 内
基本稳定。
2. 8 重复性试验 分别精密称取同一个批次的样
品(批号 20140928)6 份，按 2. 3 项下方法制备橙皮
苷供试品溶液，按 2. 1 项下色谱条件进行测定，得到
橙皮苷的平均质量分数为 1. 21%，ＲSD 1. 7%，表明
该方法的重复性良好。
分别精密称取同一个批次的样品 (批号
20141217)6 份，按 2. 3 项下方法制备迷迭香酸供试
品溶液，按 2. 1 项下色谱条件进行测定，得到迷迭香
酸的平均质量分数为 0. 110%，ＲSD 1. 9%，表明该
方法的重复性良好。
2. 9 回收率试验 精密称取同一批已知含量的留
兰香样品(批号 20140928，橙皮苷质量分数为
1. 204%)6 份，每份约 0. 15 g，分别精密加入橙皮苷
对照品溶液适量，按照 2. 3 项下方法制备橙皮苷供
试品溶液，按 2. 1 项下色谱条件进行测定。结果见
表 1。
表 1 橙皮苷的加样回收率试验
Table 1 Ｒesults of recovery test of hesperidin in Menthae Spicatae
Herba
No．
称样量
/ g
样品中量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
ＲSD
/%
1 0． 151 1 1． 819 2 3． 513 8 97． 93
2 0． 151 8 1． 827 7 3． 478 7 95． 40
3 0． 151 1 1． 819 2 3． 521 7 98． 38
96． 41 1． 4
4 0． 152 2 1． 832 5 3． 483 6 95． 41
5 0． 150 4 1． 810 8 3． 460 7 95． 34
6 0． 151 0 1． 818 0 3． 479 1 95． 98
注:加入量均为1. 730 5 mg。
精密称取同一批已知含量的留兰香样品(批号
20141217，迷迭香酸的质量分数为 0. 110%)6 份，每
份约 0. 15 g，分别精密加入迷迭香酸对照品溶液适
量，按照 2. 3 项下方法制备迷迭香酸供试品溶液，按
2. 1 项下色谱条件分别进行测定。结果见表 2。
表 2 迷迭香酸的加样回收率试验
Table 2 Ｒesults of recovery test of rosmarinic acid in Menthae
Spicatae Herba
No．
称样量
/ g
样品中量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
ＲSD
/%
1 0． 150 1 0． 165 1 0． 354 2 100． 00
2 0． 150 7 0． 165 8 0． 358 1 101． 69
3 0． 150 8 0． 165 9 0． 359 3 102． 27
99． 99 1． 7
4 0． 150 9 0． 166 0 0． 353 7 99． 25
5 0． 150 5 0． 165 6 0． 351 3 98． 20
6 0． 150 4 0． 165 4 0． 351 8 98． 57
注:加入量均为0. 189 1 mg。
2. 10 样品含量测定 取 10 批不同产地留兰香，分
别按 2. 3 项下方法制备供试品溶液，按照 2. 1 项下
色谱条件进样测定。结果见表 3。
3 讨论
比较留兰香粉末过三号筛和过二号筛 2 个品种
(由于留兰香药材纤维性强，不易打粉，故在此不考
虑筛孔更小的筛子) ，发现过二号筛的提取率低于
过三号筛的留兰香粉末。
供试品提取方法采用单因素考察法，以橙皮苷、
迷迭香酸的含量为检测指标，对提取方法(索氏提
取、超声、回流)进行了考察，发现加热回流法的提
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表 3 10 批不同来源留兰香中橙皮苷、迷迭香酸的含量测定
Table 3 Determination results of hesperidin and rosmarinic acid in
Menthae Spicatae Herba from ten cultivated sources %
No． 产地 批号 橙皮苷 迷迭香酸
1 江苏南京 20140928 1. 204 0. 036
2 湖北黄冈 20141121 0. 154 0. 845
3 贵州遵义 20141217 0. 106 0. 110
4 云南曲靖 20150112 0. 066 0. 068
5 安徽亳州 20150119 0. 083 0. 076
6 重庆万州 20150326 0. 093 0. 075
7 湖南怀化 20150429 0. 323 0. 414
8 广西桂林 20150504 0. 241 0. 066
9 广东河源 20150512 1. 090 0. 034
10 湖北恩施 20150710 0. 256 0. 141
取效果最好;然后比较了提取溶剂(水、乙醇、甲
醇) ，相比之下，乙醇的提取效果明显较好;在此基础
上考察了乙醇浓度的影响，结果 60%乙醇提取效果
最好;再对不同回流时间(0. 5，1，2，3，4，5，6 h)进行
比较，结果发现 60%乙醇为溶剂回流提取 3 h时橙皮
苷的提取基本完全(随着时间的增加，橙皮苷的含量
呈先增加后降低的趋势，回流 3 h时含量达到顶峰) ，
确定该工艺参数为橙皮苷的供试品制备方法;发现
60%乙醇为溶剂回流提取 5 h 时迷迭香酸的提取基
本完全(随着时间的增加，橙皮苷的含量呈先增加后
降低的趋势，回流 5 h时含量达到顶峰) ，确定该工艺
参数为迷迭香酸的供试品制备方法。
参考《中国药典》2010 年版一部中陈皮项下测
定橙皮苷和夏枯草项下测定迷迭香酸［8］的检测波
长分别为 283 nm 和 330 nm，此波长可避免杂质干
扰且可较好的检测该 2 种成分。
考察了乙腈和不同浓度磷酸水溶液在等度洗脱
条件下，以及 2 者的不同比例，另外还考察了不同柱
温，结果橙皮苷和迷迭香酸分别在 2. 1 项色谱条件
下色谱峰的出峰时间、峰形和分离度情况均达到了
很好的状态。
供试品的提取方法不同(提取溶剂相同，但提
取时间不同，供试品无法采用相同的制样方法) ，再
者，橙皮苷和迷迭香酸的含量测定时检测波长、柱温
均不同，故最终确定将橙皮苷和迷迭香酸的含量测
定方法分开研究。
为了保证在色谱条件有小的变动时，不影响留
兰香中橙皮苷和迷迭香酸的含量测定结果，以使方
法便于常规检验，对其色谱条件进行了耐用性研究。
橙皮苷考察柱温(30 ± 2)℃，流速(1. 0 ± 0. 2)mL·
min，检测波长(283 ± 2)nm，磷酸浓度(0. 2 ±
0. 02)%，流动相比例变化 ± 1%以及不同品牌和同
一品牌不同柱号的色谱柱，测定橙皮苷含量;结果柱
温、流速、检测波长、磷酸浓度、流动性比例对测定结
果无显著影响;不同品牌的色谱柱对含量测定影响
很大，需适当改变色谱条件才能达到较好的分离效
果，而使用同一品牌(Inertsil ODS-3 C18)不同批号的
色谱柱，对含量的测定结果无影响;橙皮苷的含量测
定时应注意色谱柱这一影响因素。迷迭香酸考察柱
温(35 ± 2)℃，流速(1. 0 ± 0. 2)mL·min －1，检测波
长(330 ± 2)nm，磷酸浓度(0. 2 ± 0. 02)%，流动相比
例变化 ± 1%以及不同品牌的色谱柱，测定橙皮苷供
试品溶液含量;结果柱温、流速、检测波长、磷酸浓
度、色谱柱对测定结果无显著影响;流动相比例变化
对结果有一定的影响;迷迭香酸的含量测定时应注
意流动相比例这一影响因素。
留兰香主要为南方部分地区用药，北方市场较
少见。本文通过对 10 个产地 10 批留兰香样品进行
测定，结果显示，不同产地之间的含量差异较大，造
成差异的原因可能是采收期和产地不同等，但其是
否具有规律性有待进一步深入研究。
本文建立了留兰香中橙皮苷和迷迭香酸高效液
相含量测定方法，该方法简便准确、分离度和重复性
好，专属性强，为留兰香质量标准及资源开发利用奠
定了一定的基础和依据。
［参考文献］
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沈阳药科大学，2008:1-13．
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［5］ 曾建伟，吴锦忠，林忠宁，等． HPLC 测定不同产地佛
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新发现［J］．中国新药杂志，2013，22(4) :433-437．
［8］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典． 一部［S］． 北
京:中国医药科技出版社，2010:176-177，263.
［责任编辑 顾雪竹］
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