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薄荷、留兰香特异性引物PCR鉴别方法研究



全 文 :桑黄主要含有两大类成分,水溶性成分如多糖、糖蛋
白等,水不溶性成分如多酚类、呋喃酮类,水不溶性成
分的提取以 95%乙醇提取效率最高,提取内容物较
多,且操作简便,故本次实验选用桑黄醇提物作为研
究对象,建立桑黄醇提物的 HPLC指纹图谱。
3. 4 目前市售桑黄质量参差不齐,本实验收集了
10 批不同产地的火木层孔菌桑黄作为供试品,通过
峰重叠率计算、相似度分析、聚类分析等发现桑黄各
色谱峰重叠率较好,但相似度偏低,归因于成分含量
差异较大。通过聚类分析,可以将质量相似且功效
相当的桑黄药材归为一类,在本实验中,3、5、6、7、10
号归为同一类别,后续的实验发现这一类别桑黄中
的 Inoscavin A 和 Hypholomine B 的含量较高,与指
纹图谱结果相同,为桑黄鉴定提供了一定的实验依
据。本实验建立的火木层孔菌桑黄指纹图谱分析方
法对桑黄质量标准的研究具有积极作用。但要验证
桑黄指纹图谱在药材质量评价中的作用,尚需收集
大量样本,进一步深入研究。
参 考 文 献
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薄荷、留兰香特异性引物 PCR鉴别方法研究
曹 亮1,2,4,秦双双3,袁 媛2* ,朱校奇1
(1. 湖南省农业科学院农业生物资源利用研究所,湖南 长沙 410125;2. 中国中医科学院中药资源中心,北
京 100700;3. 广西药用植物园,广西 南宁 530023;4. 湖南中医药大学药学院,湖南 长沙 410208)
摘要 目的:筛选留兰香、薄荷鉴别 SNP 位点,并设计特异性引物,实现薄荷、留兰香及二者混合品的快速鉴
别。方法:通过测序及 GenBank中下载获得薄荷、留兰香的 psbA序列,通过使用 Bioedit软件比对获得 SNP位点,设
计特异性多重 PCR引物,通过条件优化,对薄荷、留兰香原植物及药材进行鉴别。结果:构建了多重 PCR 鉴别体
系,能扩增出薄荷 181 bp的鉴别条带或(和)留兰香 288 bp鉴别条带,通过一个 PCR反应就能对药材及二者混合品
进行鉴别。结论:使用多重 PCR技术可以有效鉴别薄荷、留兰香及二者的混合品。
关键词 薄荷;留兰香;SNP;PCR;分子鉴别
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)01-0041-05
收稿日期:2013-07-04
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201303117) ;北京市科技项目“道地中药功能基因组北京市重点实验室 2012 年阶梯计划项目”
作者简介:曹亮(1985-) ,男,硕士,研究方向:分子生药学;Tel:0731-84691340,E-mail:caoliang520945@ 126. com。
* 通讯作者:袁媛,Tel:010-64014411,E-mail:yyuan0732@ gmail. com。
Molecular Identification of Mentha haplocalyx and Mentha spicata with Specific Primers Multi-PCR System
CAO Liang1,2,4,QIN Shuang-shuang3,YUAN Yuan2,ZHU Xiao-qi1
(1. Institute of Agricultural and Biology Resource Utilization,Hunan Academy of Agricultural Sciences,Changsha 410125,China;
2. Chinese Materia Medica Resources Center,China Academy of Chinese Medicinal Sciences,Beijing 100700,China;3. Guangxi Botanical
Garden of Medicinal Plant,Nanning 530023,China;4. Pharmacy School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China)
Abstract Objective:To screen specific SNPs loci of Mentha haplocalyx and Mentha spicata,and then specific primers were de-
signed to identify the two species and their mixture rapidly. Methods:PsbA-trnH sequences of Mentha haplocalyx and Mentha spicata
were obtained by PCR product sequencing and downloading from GenBank. SNPs in the psbA-trnH sequences of Mentha haplocalyx and
Mentha spicata were found by ClustulW program and Bioedit software. Primers for authentication of the two species were designed ac-
·14·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2014.01.002
cording to the SNP loci,and PCR reaction system was optimized to identify the original plants. Results:Multi-PCR reaction system was
constructed. The 181 bp identification band for Mentha haplocalyx or(and)288 bp identification band for Mentha spicata could be pro-
duced by a single PCR reaction,which showed good identification ability to the two species. Conclusion:The multi-PCR reaction system
can be applied to identify Mentha haplocalyx and Mentha spicata as well as their mixture.
Key words Mentha haplocalyx Briq.;Mentha spicata L.;SNP;PCR;Molecular identification
薄荷为唇形科薄荷属植物薄荷 Mentha haplo-
calyx Briq. 的干燥地上部分,具有疏散风热、清利头
目、利咽、透疹、疏肝行气的功能,主治风热感冒、风
温初起、头痛、目赤、喉痹、口疮、风疹、麻疹和胸胁胀
闷〔1〕。留兰香 Mentha spicata L. 为同属植物,具有
治疗感冒、咳嗽、胃痛、腹胀、神经性头痛的作用,外
用可治跌打肿痛、结膜炎、小儿疮疔等〔2〕。二者来
源、主要成分、功能主治均存在差异,因此不能混用。
建立一种简便可靠的薄荷、留兰香鉴别方法对于保
障药材安全有效使用十分必要。
对于薄荷与留兰香的鉴别方法,前人多有研究,
如原植物特征、性状特征、显微鉴别、理化鉴别
等〔2〕。近年来,以分子生物学为基础的检测方法被
应用于药材鉴别中,如庞晓慧等〔3〕通过 ITS2 序列差
异对薄荷及其混伪品进行了鉴别研究。该方法克服
了药材传统鉴别方法准确度不高、主观性大等缺点,
但该方法也需依赖于测序技术,并需进行序列分析技
术,依靠聚类或序列比对等方法才能进行有效区分。
位点特异性 PCR 技术可用于检测单个或多个
位点的核苷酸变异,通过单个 PCR反应即可鉴别药
材真伪,无需测序等操作,准确快捷,已成功用于藁
本〔4〕、石斛〔5〕等的鉴别。其中扩增受阻突变系统是
通过对单个 SNP 位点的特异引物进行 3端第 2 个
碱基错配,获得特异性较高的鉴别引物,用于真伪鉴
别。本文通过使用 ARMS 技术,利用薄荷、留兰香
的 SNP位点构建特异引物鉴别技术实现 2 种药材
及其混合品的鉴别,为其快速鉴别提供一种新的方
法。
1 试剂、仪器和材料
1. 1 试剂 2 × CTAB 提取液,1 × TAE 缓冲液,琼
脂糖(Promega公司) ,溴化乙锭(Fluka 公司) ,DNA
Tap 聚合酶(Takara 公司) ,100 bp DNA Marker
(Takara公司) ,三氯甲烷﹑无水乙醇﹑异丙醇等试
剂均为国产分析纯。
1. 2 仪器 5332 PCR 仪(德国 Eppendorf) ,DYY-
12 电泳系统(北京市六一仪器厂) ,5810R低温冷冻
离心机(德国 Eppendorf) ,GBOXHR 紫外凝胶成像
分析仪(英国 Syngene) ,MM400 混合型球磨仪(德国
Retsch) ,KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声
仪器有限公司) ,微量移液器(德国 Eppendorf) ,ND-
1000 核酸定量仪(美国 NanoDrop)。
1. 3 材料 薄荷、留兰香原植物于 2012 年 10 月分
别采集于湖南省农业科学院药用植物资源圃和广西
药用植物园;药材分别购自安徽亳州药材市场、河北
安国药材市场,由中国中医科学院郝近大研究员、安
徽中医学院周建理教授、广西药用植物园余丽莹研
究员鉴定,材料来源及鉴定人见表 1,凭证标本保存
于中国中医科学院。
表 1 薄荷、留兰香样品来源信息
批次 品名 产地或购买地 数量 备注 鉴定人
1 薄荷 湖南长沙 10 新鲜基原植物 Mentha haplocalyx Briq. 郝近大
2 薄荷 产地不详,购于安国药市 20 药材袋装 郝近大
3 薄荷 产地不详,购于亳州药市 20 药材散装 周建理
4 留兰香 湖南永州市 10 新鲜基原植物 Mentha spicata L. 郝近大
5 留兰香 广西药用植物园 14 硅胶干燥植物材料 余丽莹
6 留兰香 产地不详,购于亳州药市 20 药材散装 周建理
7 留兰香 青海 20 药材袋装 郝近大
2 方法
2. 1 DNA 提取 将材料用球磨仪研磨成粉,取约
0. 02 g粉末置于 2. 0 mL的微量离心管中,加入 900
μL已灭菌的 CTAB 提取液(2% CTAB,100 mmol /L
Tris-HCl,20 mmol /L EDTA,1. 4 mol /L NaCl)、0. 01 g
PVP 40000、10 μL β-巯基乙醇充分振荡混匀,65 ℃
水浴 1. 0 ~ 1. 5 h,期间轻摇 2 ~ 3 次。水浴结束后取
出,冷却至室温,加入 900 μL 氯仿-异戊醇(24∶ 1) ,
充分振荡混匀,12 000 r /min 离心 10 min。取上清,
加入等体积氯仿-异戊醇(24 ∶ 1) ,充分振荡混匀,
12 000 r /min 离心 10 min。取上清,加入 2 /3 体积
预冷的异丙醇溶液,- 20 ℃放置 0. 5 h以上。取出,
·24· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
12 000 r /min离心 10 min,弃上清,沉淀用 70 %乙醇
洗涤 2 次,无水乙醇洗涤 1 次,37 ℃挥干乙醇,用适
量灭菌水溶解,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA提取
情况,并使用核酸定量仪进行浓度测定,然后 - 20 ℃
保存。
2. 2 引物设计 选择通用引物 psbA-trnH(见表 2)
对薄荷、留兰香基原植物样品进行扩增并测序,获得
第 1 批薄荷、第 4 批留兰香序列各 10 条;搜索 Gen-
bank数据库中薄荷、留兰香的 psbA-trnH序列,获得
8 条薄荷(GenBank 中登陆薄荷序列的拉丁名为
Mentha canadensis L. )、22 条留兰香序列;对所有 50
条薄荷、留兰香序列进行多重比对,筛选获得薄荷、
留兰香 SNP 位点 3 个。利用 168(T /C)和 273(A /
T)位点设计多重 PCR引物(图 1) ,引物设定参照相
关方法进行,并引入错配碱基〔6〕。构建扩增受阻突
变系统。
表 2 薄荷、留兰香引物序列
类型 名称 序列
通用序列引物 psbA 5-GTTATGCATGAACGTAAT-
GCTC-3
trnH 5-CGCGCATGGTGGATTCA-
CAATCC-3
F1 5-CTAGCTGCTATCGAAGCTCC-3
特异性鉴别
引物
R1(留兰香) 5-TTCAATTTCAACTTTTTTA-
GAAATTCA-3
R2(薄荷) 5-AATACTACTAGAAAATAT-
AGAAACA-3
注:“C”为错配碱基
图 1 薄荷、留兰香 ARMS引物设计
2. 3 PCR扩增条件
2. 3. 1 通用引物扩增条件:PCR 反应体系:总体积
25 μL,其中 10 × buffer 缓冲液 2. 5 μL,dNTP 20
nmol(10 mmol /L,2. 0 μL) ,引物各 2. 5 pmol(5
μmol /L,0. 5 μL) ,rTap酶 1 U(5 U /L,0. 2 μL) ,BSA
0. 5 μL,DNA 20 ng(1 μL) ,灭菌蒸馏水 17. 8 μL。
PCR反应条件:94 ℃预变性 4 min 后,94 ℃变
性 30 s,50 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 35 s,35 个循环后
72 ℃延伸 8 min。获得 PCR产物通过 2. 5%的琼脂
糖凝胶电泳,并用 EB染色观察。
2. 3. 2 特异引物扩增条件优化:特异引物的起始
反应体系和反应条件同通用引物。分别考察了引物
F1 + R1(特异扩增留兰香) ,F1 + R2(特异扩增薄
荷)的退火温度、dNTP浓度、引物浓度、DNA 模版浓
度、酶浓度以及扩增循环数对 PCR 反应效率的影
响,通过单因素方法筛选最适 PCR扩增条件。各条
件的具体参数设计如下:
(1)退火温度:48. 8、49. 3、50. 1、51. 1、51. 8、
52. 6、53. 2、54. 6、55. 2、56. 3、57. 2、57. 2 ℃;
(2)dNTP:5、10、20、40 nmol;
(3)引物:0. 5、1. 25、2. 5、5、7. 5、10 pmol;
(4)DNA 模版:200、100、20、10、2、1、0. 2、0. 1、
0. 02、0. 01、0. 002、0. 001 ng;
(5)DNA聚合酶:0. 25、0. 5、1、2、2. 5、3 U;
(6)扩增循环数:分别使用 28、32、35、38、41 个
循环进行扩增。
2. 4 多重 PCR鉴别体系建立 为了能在一个反应
中鉴别薄荷或留兰香,以 F1、R1、R2 三条引物组合,
即 F1 + R1 + R2 在同一 PCR 反应中存在,构建多重
PCR体系,用于薄荷、留兰香的鉴别。反应体系和
条件通过“2. 3. 2”项下方法优化,并考察引物比例
即 R2∶ R1 对 PCR 反应效率的影响,两引物的比例
分别设为 5∶ 1、4∶ 1、3∶ 1、2∶ 1、1∶ 1、1∶ 2、1∶ 3、1∶ 4。优
化多重 PCR鉴别体系。
2. 5 混杂品鉴别方法研究及药材鉴别
2. 5. 1 薄荷、留兰香混杂品鉴别: (1)将薄荷与留
兰香原植物粉碎后,将粉末按一定比例混合后提取
总 DNA,薄荷粉末所占比例分别为 97%、90%、
50%、10%、3%。(2)将薄荷、留兰香 DNA 进行等
体积混合,获得薄荷、留兰香的 DNA 混合样品 2 份
(浓度分别为薄荷∶留兰香 = 20. 2∶ 6. 1,15. 6∶ 6. 5)。
利用优化的多重 PCR体系对薄荷、留兰香以上 2 种
混合品进行鉴别。
2. 5. 2 药材鉴别:使用以上 DNA 提取方法,提取
各批次药材的 DNA,硅胶干燥材料 14 份,每批药材
各取 10 个单独的叶片或茎组织提取 DNA,检测
DNA浓度,使用“2. 4”项下鉴别体系进行鉴定。
3 结果分析
3. 1 特异引物扩增条件优化 由于在多重 PCR鉴
别引物中,人为引入错配位点,因此首先需要考察退
火温度对 PCR 反应效率的影响,从图 2-A 可以看
出,不同退火温度对 PCR扩增结果影响较大。引物
F1 + R1 在 48. 8 ~ 57. 2 ℃均能扩增出专一的留兰香
特异性条带,而薄荷样品没有条带,且 55. 2 ℃以上
时条带较弱,其大小为 288 bp。引物 F1 + R2 在
50. 1 ~ 53. 2 ℃范围内能扩出专一的薄荷条带,留兰
香无带,大小为 181 bp,在第 6 个梯度即 52. 6 ℃能
获得明亮条带,但当退火温度达到第 7 个梯度即
53. 2 ℃时,扩增效率明显降低,且在第 9 个梯度温
·34·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
度为 55. 2 ℃时没有产物(图 2-B)。综合考虑 2 组
引物退火温度对 PCR扩增效率的影响,本研究选择
52 ℃用于进一步条件优化,筛选最适 PCR 扩增条
件。
图 2 退火温度对留兰香与薄荷 PCR反应效率的影响
注:A为引物 F1、R1 组合;B为引物 F1、R2 组合;1 ~ 12 样品为留兰香;13 ~ 24 样品为薄荷。退火温度:1、13:48. 8 ℃;2、14:49. 3 ℃;3、15:
50. 1 ℃;4、16:51. 1 ℃;5、17:51. 8℃;6、18:52. 6℃;7、19:53. 2 ℃;8、20:54. 6 ℃;9、21:55. 2 ℃;10、22:56. 3 ℃;11、23:57. 2 ℃;12、24:57. 2 ℃;
M:DL2000 marker
优化条件分析结果表明,DNA模板浓度在 1 ~
200 ng范围内均能获得 PCR 扩增条带,且 20 ng 浓
度的扩增效果较好。dNTP 浓度为 10 nmol,引物浓
度 10 pmol,Taq酶 1 U,35 个扩增循环条件下,2 对
引物组合分别能获得有效扩增。优化后的 PCR 反
应体系为:总体积 25 μL,其中 10 × buffer 缓冲液
2. 5 μL,dNTP 10 nmol(10 mmol /L,1. 0 μL) ,引物各
10 pmol(5 μmol /L,2. 0 μL) ,rTap 酶 1U(5U /μL,
0. 2 μL) ,BSA 0. 5 μL,DNA 20ng(1 μL) ,灭菌蒸馏
水 15. 8 μL。扩增条件为 94 ℃预变性 4 min,94 ℃
变性 30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 35 s,35 个循环
后72 ℃延伸 8 min。
3. 2 多重 PCR鉴别体系 为了进一步简化体系,
本研究对多重 PCR体系进行了优化。结果表明,F1
浓度与 R1 + R2 浓度相同,且 R1 与 R2 浓度比为
1. 0 ~ 2. 0 时均能扩出明亮的薄荷、留兰香鉴别条
带。优化后的多重 PCR鉴别体系为:总体积 25 μL,
其中 10 × buffer 缓冲液 2. 5 μL,dNTP 10 nmol(10
mmol /L,1. 0 μL) ,引物 F1 10 pmol(5 μmol /L,2
μL) ,R1 5 pmol(5 μmol /L,1 μL) ,R2 5 pmol(5
μmol /L,1 μL) ,rTap 酶 1U(5 U /μL,0. 2 μL) ,BSA
0. 5 μL,DNA 20ng(1 μL) ,灭菌蒸馏水 15. 8 μL。
3. 3 薄荷、留兰香混杂品鉴别方法 由于实际生
产中,可能出现薄荷、留兰香药材掺杂的情况,为了
有效鉴别掺杂品,本研究将原植物材料按一定质量
比混合后提取 DNA,并利用多重 PCR鉴别体系进行
检测。结果表明,薄荷或留兰香在混合样品中所占
质量比为 3% ~97%时,样品 DNA 均能检测出相应
的鉴别条带,且随着质量比增加,条带丰度增加。而
在薄荷、留兰香等体积 DNA混合样品中,均能检测出
薄荷、留兰香鉴别条带,由于 DNA混合品中薄荷、留
兰香的 DNA浓度不同,条带亮度稍有差异(图 3)。
图 3 薄荷、留兰香多重 PCR鉴别结果
注:1 ~ 4 为薄荷药材;5 ~ 8 为留兰香药材;9 ~ 13 为不同比例薄荷、留兰香(薄荷所占比例依次为 97%、90%、50%、10%、3%) ;14、15 为薄
荷、留兰香 DNA混合样;16、17 为留兰香基原植物;18、19 为薄荷基原植物;20 为空白对照;M:100 DNA ladder(从上至下依次为 500、400、300、
200、100 bp)
3. 4 薄荷、留兰香药材的分子鉴别 通过对各批
次薄荷、留兰香药材提取 DNA,第 2、3 批薄荷药材
DNA条带较弥散,但核酸仪分析显示含有一定量
DNA,浓度范围为 26. 5 ~ 359. 1 ng,并且能扩增到薄
荷的 181 bp鉴别条带;第 5 批留兰香硅胶干燥样品
均获得高质量 DNA,DNA 电泳检测条带明亮,且都
能扩出留兰香的 288 bp鉴别条带,第 6 批留兰香药
材均能扩增出留兰香鉴别条带,第 7 批留兰香药材
DNA提取质量一般,扩增产物中获得了 1 条薄荷特
异性条带,提示该批次留兰香药材中可能存在薄荷
混杂的情况。
4 小结与讨论
薄荷、留兰香均为薄荷属重要的药用和食用植
物,其药材性状十分相似。本研究利用 2 种药材基
原植物的 psbA-trnH 序列,筛选获得用于鉴别薄荷、
留兰香的 2 个 SNP位点,并建立了多重 PCR鉴别体
·44· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月
系,在此基础上对反应条件进行优化。利用该方法
可以有效地鉴别薄荷、留兰香及其混合品。
分子鉴定技术快速简便,对于鉴定人员专业要求
较低,基于位点特异性的鉴别技术在已知药材品种和
可能伪杂品的鉴别中,具有较好的应用价值,但该技
术需要预先分析获得 SNP位点,并设计特异、稳定的
引物才能够准确有效的鉴别,有一定局限性,但对于
常用药材及其伪杂品的鉴别具有快速准确的效果。
参 考 文 献
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太白贝母栽培品的生药学研究
沈 力1,周 浓2* ,付绍智1,易东阳1,贾 晗1,陈洪源1,吴应梅2
(1. 重庆三峡医药高等专科学校,重庆 404120;2. 重庆三峡学院生命科学与工程学院,重庆 404000)
摘要 目的:对太白贝母栽培品进行生药学研究,为该药的进一步研究与开发利用提供依据。方法:采用生药
学常规方法进行原植物鉴定、性状鉴定、显微鉴定及浸出物、总皂苷与总生物碱的含量测定。结果:太白贝母栽培
品因生长年限不同性状差异较大,除松尖略似松贝“怀中抱月”外,其余各规格在性状特征上均与传统川贝母差异
大,多扁圆锥形或圆柱形,体表稍粗糙,基部隘缩,味苦。其浸出物含量、总生物碱含量相差较大,总皂苷含量无明显
差异。结论:实验结果显示浸出物、总皂苷、总生物碱的含量与川贝母现行的等级划分不成正向相关关系或不相关。
建议等级划分在考虑药材外观性状直径、长短时,应根据不同的应用要求,结合有效成分的含量测定进行评价。
关键词 太白贝母;栽培品;生药学
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)01-0045-05
收稿日期:2012-08-12
基金项目:重庆市基础与前沿研究计划项目(CSTC 2013jcyjA10120) ;重庆市自然科学基金计划项目(CSTC 2009BB5236)
作者简介:沈力(1966-) ,男,硕士,教授,主要从事中药资源与品质研究;E-mail:sl_zyx@ 126. com。
* 通讯作者:周浓,E-mail:erhaizn@ 126. com。
Pharmacognostical Study on Cultivated Fritillaria taipaiensis
SHEN Li1,ZHOU Nong2,FU Shao-zhi1,YI Dong-yang1,JIA Han1,CHEN Hong-yuan1,WU Ying-mei2
(1. Chongqing Three Gorges Medical College,Chongqing 404020,China;2. College of Life Science and Engineering,Chongqing Three
Gorges University,Chongqing 404000,China)
Abstract Objective:To study on the pharmacognostical characteristics of cultivated Fritillaria taipaiensis for providing basis for
further development and research. Methods:Botanical,macroscopic and microscopic identifications,and determination of the content of
extract,total saponins and total alkaloids were carried out. Results:Because of various growing years,cultivated Fritillaria taipaiensis had
diffferent properties,in addition to tip slightly resembling songbeis tip“embracing the moon”,there were greatly different characteris-
tics in the rest of specifications comparing with the traditional Fritillaria cirrhosa. Some were shallow conical or cylindrical,some had
slightly rough surface,and some bases were constricted,bitter in taste. There were great differences in its extract and total alkaloids con-
tent,and no obvious differences in the content of total saponins. Conclusion:The experimental results show that the extract,total sapo-
nins and total alkaloids content are not positively correlated or relevant with the current classification of Fritillariae Cirrhosae Bulbus. To
consider the medicinal appearance diameter and length,the grade classification should be based on different application requirements,
and combined with the evaluation of active ingredients.
Key words Fritillaria taipaiensis P. Y. Li;Cultivated;Pharmacognostical research
·54·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月