全 文 ：拟南芥 β-罗勒烯合成酶基因 T-DNA插入突变体的鉴定
马泉芳 , 魏　然 , 刘春林*
(湖南农业大学农学院 ,长沙 410128)
摘　要: β -罗勒烯 (β -Ocimene)是一种单萜挥发性有机物 ,亦是一种重要的植物通讯信号分子。为了进一步研究 β -罗勒烯的
作用机理 ,需要获得β -罗勒烯合成酶基因表达沉默的实验材料。根据 TAIR网站上公布的β -罗勒烯合成酶信息 ,从美国拟南
芥生物资源中心购买该基因的 T-DN A插入突变体材料 ,运用双引物法对这些突变体进行了 T-DNA插入位点的鉴定 ,获得
8株稳定遗传的纯合突变体 ,该结果为深入研究 β-罗勒烯的功能奠定了良好基础。
关键词: β -罗勒烯 ;单萜合酶 At TPS03; T-DNA插入突变 ;拟南芥
中图分类号: Q78　　　　文献标识码: A
文章编号: 1001-5280( 2011) 05-0477-05　　　　DOI: 10. 3969 /j. issn. 1001-5280. 2011. 05. 13
Identification of T -DNA Insertion Homozygous Mutant Lines for
Analyzing β-ocimene Synthase in Arabidopsis thaliana
MA Quan -fang , WEI Ran , LIU Chun-lin
*
( Ag ricultura l Colleg e o f Hunan Ag ricultur al Univ er sity , Chang sha, Hunan 410128, China )
Abstract: β-ocimene is one o f mono terpene, an impo rtant plant communication signaling molecule. In o rder to fur ther
study th e ro le o f β-ocim ene mechanism, homozygous m utant with β -ocimene synthase gene expression silence must be go t.
Acco rding to the information published on the TAIR w ebsite, w e bough t the T-DNA insertion mutant o f the β-ocimene
synthase gene f rom the TAIR. These homozygous mutants w ere identified by the way of double-primer method. Finally , 8
stable homozygous genetic mutants w er e obtained. These homozygous mutants lay good founda tion fo r fur ther
investig ating the func tion o f β-ocim ene.
Key words: β-ocimene; Mono terpene syntha se At T PS03; T-DNA inser tion m utant; Arabidopsis thaliana
　　β -罗勒烯 (β-ocimene)是近年来发现的 ,与植物防
御相关的植物通讯 ( plant-communication )信号分
子 [1 ] ,在自然界中包括两个同分异构体: 顺式-β -罗勒
烯 ( cis-β -ocimene ) 和 反 式-β -罗 勒 烯 ( t rans-β-
ocimene)。 β-罗勒烯是一种单萜 ( mono terpenes)化合
物。单萜是 C10类萜类化合物 ,由两个异戊二烯结构单
元组成 ,以链状、环状及其衍生物的形式广泛存在于植
物挥发油和树脂中 [2, 3 ]。 这类产物在植物的种群竞争、
吸引昆虫传粉、植食性昆虫防御等方面发挥着重要作
用 [4～ 6 ]。
研究发现 ,植物在受到外界的胁迫后 ,植株能释放
出 VO Cs(v olati le organic compounds) , VO Cs中含有
　　收稿日期: 2011-05-23
作者简介:马泉芳 ( 1981- ) ,女 ,甘肃白银人 ,硕士研究生 ,
Email: mqf- gil@ 126. com。 * 通讯作者。
基金项目: 国家自然科学基金重点项目 ( 31071455)。
一系列小分子的萜类化合物 [7, 8 ]。现在已经了解到许多
植物种类如: 玉米、棉花、利玛豆、马铃薯、烟草、拟南
芥、番茄、地中海松、三叶草、月桃叶、黄瓜等等被节肢
食草动物取食后 ,其叶片释放的有机挥发物中都包含
反式-β -罗勒烯 [7～ 10 ]。 已有研究结果表明 ,反式 -β-罗勒
烯能激发与受害植株相邻的植株产生诱导性防御反应
并改变相邻植物体内的代谢途径 ,对病原微生物产生
抗性或对食草动物产生驱赶作用 [11～ 16 ]。 刘春林等 [17 ]
以拟南芥为材料 ,分别选择水杨酸信号传导途径启动
的指示基因 PR 1与茉莉酸信号传导途径的指示基因
PDF 1. 2基因片段为探针 ,运用 Northern杂交的方法
已经发现β -罗勒烯能诱导完整植物中与水杨酸和茉莉
酸有关防御基因的表达 ,而且发现 β -罗勒烯能解除水
杨酸和茉莉酸的拮抗作用。 这表明 β-罗勒烯是一种与
植物防御启动密切相关的信号分子。
β -罗勒烯这种单萜挥发性有机物是由萜类合成酶
( terpeniod synthase, T PS)催化合成的。萜类合酶类 ,
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以氨基酸序列相似度 40%为基准将其分为 TPS-a～
T PS-g 7个亚家族 [ 18, 19] ,它主要包括单萜合成酶
( mono terpene synthase )、 倍 半 萜 合 成 酶
( sesqui terpene synthase)和二萜合成酶 ( di terpene
synthase)。除直链的多聚萜类 (如橡胶 )外 ,大多数萜
类化合物都具有环状结构。 单萜合酶分布于 TPS-b,
T PS-d, TPS-f和 TPS-g 4个亚家族。单萜合酶基因表
达受生物钟调节 ,表达量随昼夜周期交替变换而出现
高低变化。如金鱼草月桂烯合酶、罗勒烯合酶 ,拟南芥
月桂烯合酶、罗勒烯合酶基因的表达量和产物都呈现
午后高、夜间低的昼夜交替规律 [20, 21 ]。
Aubourg等 ( 2002)通过对拟南芥基因的序列分
析发现拟南芥含有 40个 TPS类似基因 ,并将这 40个
相似基因组成的家族命名为 At TPS家族。 At TPS03
( Arabidopsis thaliana terpenoid synthase 03)基因是
At TPS基因家族中的一员。 Jenny等人 [22 ]通过 cDN A
克隆 ,鉴定了一个基因 At TPS03 ,它能编码单萜合
酶 ,这种单萜合酶能高特异性催化香叶基二磷酸生成
β -罗勒烯。
为了研究β -罗勒烯的功能 ,需要获得 At TPS03基
因沉默的纯合突变体。纯合体的获得将为进一步研究
At TPS03基因在植物防御、植物通讯方面的作用奠定
良好的基础。 本实验所用材料是从美国拟南芥生物资
源中心订购 AtT PS 03基因的 T-DNA插入突变体材
料 CS879103,通过 PCR检测对其基因型进行鉴定 ,获
得了 8株稳定的纯合突变体株系。
1　材料与方法
1. 1　材料
1. 1. 1　植物材料
At TPS03基因 T-DNA插入突变体 CS8791039
( T4 代 )种子购自美国俄亥俄州立大学 ABRC
( Arabidopsis Biological Resource Center) ,野生型拟
南芥 ( Co l-0生态型 )种子由本实验室保存。
1. 1. 2　生物学试剂
2× Taq M asterMix购自北京康为世纪生物科技
有限公司 , 100 bp plus Ma rker购自北京全式金生物
技术有限公司 , Revert AidTM First St rand cDN A
Synthesis Ki t购自 Fermentas公司 ,引物均由南京金
斯瑞生物科技有限公司合成。
1. 2　方法
1. 2. 1　材料培养
先将种子消毒 ,然后散播于盛有蛭石的小钵内 ,置
于 4℃恒温黑暗培养室内春化 48 h;春化后转入人工生
长室中培养 ,环境条件为:恒温 22～ 24℃ ,光照强度为
120～ 150μmol /m2· s( 1μmol /m2· s= 53. 8 Lux ) , 16
h光照 /8 h黑暗 ,相对湿度 75% ,定时浇营养液。待其
生长至 25 d左右时 ,取幼嫩叶用于 DNA分离。
1. 2. 2　单株植物总 DNA提取
取拟南芥幼叶 2～ 3片于 1. 5 mL离心管中 ,研棒
研碎 ,至 65℃水浴锅中水浴 15 min,加 2× CTAB DNA
提取液 600μL和等体积氯仿∶异戊醇 ( 24∶ 1) ,在涡
漩器上混匀 , 14 000 rpm离心 7 min;取上清液至一新
的 1. 5 mL离心管中 ,加 2倍体积无水乙醇 ,同时加上
清液 1 /10体积的 3 mol /L NaAC轻轻颠倒混匀 ( -
20℃放置 20 min) , 14 000 rpm离心 10 min,吹干 ,溶于
灭菌的超纯水中后作为 PCR扩增的 DNA模板。
1. 2. 3　 DN A的 PCR扩增
PCR反应体系。反应体系为 15μL:模板 2μL, 2×
Taq MasterMix 7. 5μL,正向引物 F 0. 1μL,反向引物
R 0. 1μL,用 ddH2O补足至 15μL。
PCR反应条件。 ( 1)预变性 , 94℃ , 3 min; ( 2)变
性 , 94℃ , 40 s; ( 3)退火 , 62℃ , 35 s, 72℃延伸 45 s(从
变性至延伸 35个循环 ) ; ( 4)最后延伸 , 72℃ , 7 min。反
应结束 16℃保存。
1. 2. 4　 PCR产物的检测
检测 PCR产物一般利用 1. 6%的琼脂糖凝胶进行
电泳 ,其中电泳缓冲液为 1× T AE,电压为 5 V /cm ,用
EB进行染色 , PCR产物上样量为 8μL,电泳结果用本
实验室的凝胶成像系统拍照记录。
1. 2. 5　 PCR引物的设计
每个 T-DNA单株基因型的鉴定需要 3条引物 ,分
别是: LP,位于基因组上距离 T-DNA插入位点左断臂
600 bp; RP,位于距离 T-DNA插入位点右臂端 300
bp; T-DN A左断臂引物 LB3(表 1)。 PCR引物设计参
照 ( ht tp: / /signal. salk. edu /tdnaprimers. 2htm l. )相
关资料。
1. 2. 6　纯合突变体中模板基因表达的 RT-PCR验证
待纯合突变体生长至 32 d时 ,取 2株已被初步鉴
定为纯合子的植株和 1株野生型 ( Col-0) ,用剪刀在其
莲座叶上剪一刀 ,其中对每株纯合子剪创 2片 , 8 h后
取样 ,液氮速冻后 ,用 Trizo l法提取 RNA,用 Fermentas
公司的 Rever t AidTM First St rand cDN A Synthesis
Kit进行反转录得到 cDN A,然后对这 3株材料的
At TPS03进行半定量 RT-PCR分析 ,其中所用引物见
表 1。 PCR反应条件为 94℃预变 3 min, 94℃ 50 s, 61℃
退火 40 s, 72℃延伸 50 s,最后延伸 72℃ 8 min, 16℃保
存 ,扩增 35个循环。以基因 Actin 2为对照。
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表 1　PCR扩增所用的引物及其序列
Table 1　Primer sequences used for the PCR ampl ifi cation
引物名 序　　　列
Actin2-F 5′ATGGC TGAGGCTGATGATATTCAAC3′
Actin2-R 5′CT AGAGAGGGATTTGACTCGTCTTGAT3′
At TPS03-F( LP) 5′TGCCATT AACGTGGAC TAAGG3′
At TPS03-R( RP) 5′TCGATCT ATCCGGTTT TTGTG3′
LB3( BP) 5′TAGCATCTGAATTTC AT AACCAATCTCGAT ACAC3′
2　结果与分析
2. 1　PCR引物设计
原理如图 1所示。 当用 LP和 RP这对引物进行
PCR检测时 ,在野生型植株 ( wild type, WT)和杂合子
(heterozygous lines, HZ)植株中产生一条 PCR产物
带 ,分子量大约是 900 bp,而纯合子 ( homozygous
lines, HM )植株中没有 PCR产物形成 ;当用 RP和 LB3
这对引物 PCR检测时 ,在野生型植株中没有 PCR产
物 ,而在杂合子植株和纯合子植株中均有一条 PCR产
物带 ,分子量大小为 410+ Nbp。
图 1　PCR引物设计原理
a. PCR引物设计示意图 ; b.电泳结果示意图。 来自 http: / /signal. sa lk. edu /tdnaprimers. 2html
Fig . 1　Pr inciples of primer design of PCR
a. Schematic diag ram o f primer design o f PCR; B. Schema tic diag ram o f Electr ophor esis results
2. 2　T -DNA插入位点鉴定结果
T-DNA突变体材料长至 25 d时 ,取 4株 ,提取基
因组 DNA作为模板进行 PCR扩增 ,以一株野生型植
株基因组 DNA作为对照模板。 当分别用 LP、 RP和
RP、 LB3这两对引物进行 PCR扩增时 ,根据电泳结果
(图 2)可判断 ,除了作为对照的 1号泳道 ,其他相邻的
两个泳道中 ,当有两条分子量分别为 900 bp和 410+
Nbp的 PCR产物时 ,说明该植株在该位点有 T-DNA
插入 ,而且是杂合子植株 (如 2和 3, 6和 7号泳道 ) ;当
只有一条分子量为 410+ Nbp的 PCR产物时 ,说明该
植株在该位点有 T-DNA插入 ,而且是纯合子植株 (如
4和 5, 8和 9号泳道 )。通过 PCR扩增和电泳结果分析 ,
最后得到 2株纯合子植株 ,分单株收集种子。
待 T-DNA插入纯合突变体材料长至 30 d时 (图
3) ,其株型比 Co l-0野生型小 ,抽薹早于 Col型。
2. 3　纯合子RT-PCR检测
将已初步鉴定的 2株纯合突变体与 1株野生型
Col-0(图 3) ,用剪刀对莲座叶进行剪创伤处理 , 8 h后 ,
图 2　电泳结果
Fig . 2　Electrophoresis results
　　注: 泳道 1: LP+ RP引物 ,以野生型 Col-0的 DN A为模板扩
增作为对照 ;泳道 2、 4、 6、 8: LP+ RP引物 ,以突变体 DN A为模
板扩增 ;泳道 3、 5、 7、 9: LP+ LB3引物 ,以突变体 DN A为模板扩
增 ;泳道 2和 3、 4和 5、 6和 7、 8和 9分别以同一株突变体 DN A为
模板。
分别提取总 RNA,对分离的 RNA进行 RT-PCR检测 ,
结果 (图 4)显示 2株纯合突变体没有扩增产物 ,而野生
型 Co l-0有带 ,说明 AtTPS 03基因的表达因 T-DNA
插入而被完全沉默了。 T-DNA插入位点的鉴定结果
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与 RT-PCR两方面的结果证实鉴定的 T-DNA插入纯
合突变体可以用于下一步的 AtT PS 03基因对植物生
长发育方面的研究。
图 3　a:Col -0野生型 ;b: T -DNA插入的纯合子: 2号 (为泳道中的 4和 5)和 3号 (为泳道中的 8和 9)
图 4　T -DNA 插入纯合子体内AtTPS03基因的表达情况
Fig . 4　AtTPS03gene expression of T -DNA
　insertion homozygous mutants
Fig . 3　a: Columbia -0 type ; b: T -DNA insertion homozygous mutants: 2(l ane 4, 5)and 3 (lane 8, 9)
　　待 T-DNA插入纯合突变体材料长至 50 d
时 (图 5) ,与 Col-0型相比 , T-DN A插入纯合
子其株型变小 ,叶片有的轻微泛黄 ,果荚变短 ,
茎秆变细 ,成熟期早于 Col-0型。
3　讨　论
对 T-DNA插入突变体的鉴定 ,引物的设
计一般是直接利用 h ttp: / /signal. salk. edu /
图 5　a:Col -0野生型 ;b: T -DNA插入的纯合子: 2号和 3号
Fig . 5　a:Columbia-0type ;b: T -DNA insertion homozygous mutants 2and 3
tdnaprimers. 2h tm l网页提供的软件。本实验也是根据
T AIR官方网站公布的基因 AT 4G16740. 1的 T-DNA
插入位置 , 找到其突变体的类型 , 搜索到检测所需的
3条引物 , 对突变体进行检测 , 检测结果小于 1 000
bp,与理论值 1 044 bp有些出入 ,比网站上公布的结果
小。
双引物法检测获得的 T-DNA插入纯合突变体 ,
一定要对其进行基因表达分析。因为从理论上讲 , T-
DN A插入的片段比较大 ,插入突变往往使基因处于沉
默状态 ,大多数实验结果也证实这一理论。但是有时也
会遇到 ,尽管是纯合插入突变体 ,但是目标基因还是能
够表达。 笔者实验时就遇到过一次: 得到的纯合 T-
DNA插入突变体 ,插入位点是在基因的信号肽序列
上 , RT-PCR检测结果却发现该基因能够转录获得有
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功能的 cDN A。
在相同培养条件下 ,发现 AtTPS 03基因纯合突
变体与野生型 Col-0的形态有差异。突变体株型变小 ,
莲座叶叶片泛黄 ,出现提前衰老现象 ;侧枝数目少 ,茎
秆变细 ,花型变小 ,果荚变短 ;成熟期早于 Co l-0型。这
种现象表明 , AtT PS 03基因可能参与调控植物的生
长发育。 所以本实验获得的 AtTPS 03基因纯合突变
体为进一步研究 β -罗勒烯的功能奠定了良好基础。
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