全 文 ：中国农学通报 2015,31(14):102-107
Chinese Agricultural Science Bulletin
罗勒烯信号传导途径各组分突变体高通量
活体荧光筛选技术系统的建立
徐 健 1,2，李 浪 2,3，刘琪文 1，刘春林 2,3，阮 颖 1,2
（1湖南农业大学生物科学技术院，长沙 410128；
2湖南省植物表观遗传和分子生物学重点实验室，长沙410128；
3湖南农业大学农学院，长沙 410128）
摘 要：为了高效率地发现罗勒烯信号传导途径上的各信号传递成分，本研究拟采用正向遗传学的策
略，即利用EMS诱变与荧光素酶-荧光素活体荧光成像检测技术体系相结合的方法筛选突变体。为此，
构建了指示基因启动子PR1pro::Luciferase和PDF1.2pro::Luciferase质粒并转化拟南芥；通过抗性筛选
与PCR检测，鉴定获得了T3代转基因纯合子植株。同时，购买了合适的高灵敏CCD相机、暗箱与软件，
通过组装调试，成功制造了一台自制的、经济适用的活体荧光检测仪。转基因纯合植株经过茉莉酸、水
杨酸或罗勒烯处理和喷施荧光底物后，放到荧光检测仪中，成功观察到了诱导后的转基因植株释放出高
亮荧光，说明活体荧光成像检测系统构建成功。这些结果为进一步利用正向遗传学的方法高效筛选罗
勒烯信号传导途径中各成分的突变体植株，以及阐明罗勒烯诱导的防御反应的作用机理奠定了良好
基础。
关键词：β-罗勒烯；PR1启动子；PDF1.2启动子；荧光素酶基因；活体荧光检测系统
中图分类号：Q943 文献标志码：A 论文编号：casb15020082
Establishment of a Living Fluorescence Detection System for High-throughput
Screening Mutants of Different Components in the Ocimene Signaling Pathway
Xu Jian1,2, Li Lang2,3, Liu Qiwen1, Liu Chunlin2,3, Ruan Ying1,2
(1College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;
2Hunan Provincial Key Laboratory of Plant Epigenetics and Molecular Biology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128;
3Agricultural College, Hunan Agricultural University, Changsha 410128)
Abstract: In order to efficiently find various signal transduction components in ocimene signaling pathway,
this study uses forward genetic strategy, namely the technology system combining EMS mutagenesis and
luciferase- luciferin in vivo fluorescence imaging detection technology for screening mutant. To do this,
PR1pro::Luciferase expression cassette and PDF1.2pro::Luciferase expression cassette driven by PR1 gene
promoter and PDF1.2 gene promoter respectively were constructed and the recombinant plasmids were
transformed into Arabidopsis. By antibiotic selection and PCR verification, T3 transgenic homozygous plants
from several lines were obtained. Meanwhile, a suitable high sensitivity CCD camera, camera obscura and
software were purchased, through assembling and debugging, a self- made, affordable in vivo fluorescence
detector was successfully generated. After treated by jasmonic acid, salicylic acid or ocimene alone followed by
基金项目：国家重点基础研究发展计划（973计划）课题“组蛋白甲基化修饰重要调控蛋白质的功能鉴定”(2012CB910501)。
第一作者简介：徐健，男，1990年出生，湖南益阳人，硕士研究生，研究方向植物防御途径分子机制研究。通信地址：410128湖南省长沙市芙蓉区湖南
农业大学生命科学楼501室，Tel：0731-84635294，E-mail：348748469@qq.com。
通讯作者：阮颖，女，1963年出生，湖南长沙人，教授，博士生导师，博士，研究方向植物发育与表观遗传。通信地址：410128湖南省长沙市芙蓉区湖南
农业大学十一教学楼南540，Tel：0731-84673684，E-mail：yingruan@hotmail.com。
收稿日期：2015-02-09，修回日期：2015-04-23。
徐 健等：罗勒烯信号传导途径各组分突变体高通量活体荧光筛选技术系统的建立
fluorescent substrate spraying, homozygous transgenic plants were submitted to fluorescence detector, high
intensity of induced-fluorescence signal in transgenic plants was detected, indicating that in vivo fluorescence
imaging detection system was successfully constructed. These results provided a powerful forward genetic
methodology and made it possible to use high- throughput selection of plants carrying mutations in ocimene
signaling pathway components, as well as shed light on the mechanism of defense responses induced by
ocimene.
Key words: β-ocimene; PR1 promoter; PDF1.2 promoter; luciferase; living fluorescence detection system.
0 引言
植物通讯(Plant Communication)是指植物与植物
(plant-to-plant)以及植物与昆虫(plant-to-insect)之间的
跨空间信号传递以及信号接受体所做出的生理应答和
行为反应。植物在受到食草昆虫取食后，受侵害的植
物体会释放出复杂的有机挥发气体，作为信号分子的
有机挥发物，能使植物-食草昆虫-昆虫天敌这三营养
水平的生物之间产生复杂而精细的防御反应。比如受
害植株产生的挥发物可以使其周围接收到信号的植株
产生防御反应[1]。
根据已有的报道，不同种植物如玉米[2]、棉花[3]、黄
瓜[4]、利马豆[5-6]、番茄[7]、桃树[8]等受不同种节肢食草动
物取食，受害植株释放出的挥发性物质中都含有一种
相同的单萜类化合物——反式 -β-罗勒烯 (trans-β-
ocimene, (E)-β-ocimene, EOC)植物通讯信号分子 [9-10]。
Navia-Gine等[11]发现蒺藜苜蓿被昆虫取食的叶片释放
的(E)-β-ocimene比未受损伤的叶片高2倍。Opitz等[12]
对棉花的研究发现，当植株遭受创伤或昆虫取食后，
(E)-β-ocimene的释放量最高能提高 15倍。罗勒烯是
无环单萜类化合物，化学名 3,7-二甲基-1,3,6,-辛三
烯。越来越多的研究结果显示EOC在植物防御方面
起着重要作用，比如EOC能激发与受害植物相邻的植
株产生诱导性防御反应[9-10]，改变相邻植物体内的代谢
途径[13-15]，对食草动物产生驱赶作用[11,16]，吸引取食害虫
的天敌[17-18]。Arimura等[9]发现EOC能诱导SA途径相
关抗性基因PR2和PR3的表达；Godard等[19]发现EOC
能促进 JA途径相关基因LOX2、VSP1的表达升高。刘
春林等 [20]发现 EOC能诱导 JA/ET途径的指示基因
PDF1.2和SA途径的指示基因PR1同时表达。这些研
究表明EOC诱导的信号传导与植物防御反应，既有与
SA及 JA/ET途径在信号传导末端相交集的地方，又有
自己独特的信号传导过程。但目前关于罗勒烯信号传
导途径的作用机制以及模式尚不明确。
为了揭示EOC信号传导途径的分子基础与在植
物防御途径的作用机制，从策略上笔者拟采用正向遗
传学的方式来筛选 EOC信号传递途径上的组成成
分。本研究利用特异性扩增引物扩增拟南芥Col-0的
SA防御途径指示基因 PR1和 JA/ET途径指示基因
PDF1.2的启动子区域，将其与荧光素酶基因融合后转
到拟南芥中；利用笔者自己组装的荧光检测系统成功
筛选到了罗勒烯诱导表达的高亮荧光转基因拟南芥植
株。这为利用EMS诱变寻找EOC在植物防御途径中
的关键基因以及进一步深入研究β-罗勒烯在植物防御
中作用机理奠定了可靠的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
限制性内切酶 BamHI与 XmaI购自 Fermentas公
司，PCR Mix购自康为世纪公司；pEASY-Blunt Simple
Cloning Kit、标准分子量DNA Marker购自全式金公
司；PrimerSTAR HS DNA Polymerase、T4 ligase购自
Takara公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均
购自OMEGA公司；D-luciferin游离酸购自上海楷洋公
司 。 大 肠 杆 菌 DH5α、农 杆 菌 GV3101，载 体
pCAMBIA1381Z-Luc均为湖南农业大学表观遗传与
植物发育实验室保存提供。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥生长 用纯水拌好营养土，将拟南芥种子
播于装有营养土的小钵中，封保鲜膜保湿，避光4℃低
温处理 3天，转移至光照培养室培养 3天后揭膜[21]，生
长条件是 22~25℃[22]，长日照(16 h/8 h)，根据土壤的干
湿程度适当浇水。
1.2.2 克隆PR1和PDF1.2基因启动子的引物设计 根
据TAIR上查找到已公布的PR1、PDF1.2基因序列，在
参考已有发表资料的基础上，PR1的启动子序列为
-1 bp到 -2303 bp，PDF1.2的启动子序列为 -1 bp到
-1485 bp。利用引物设计软件 Primer Premier5，以及
结合双元表达载体pCAMBIA1381Z-Luc（图1）上多克
隆位点限制酶类型与启动子序列上的限制性内切酶类
型，选择在正向引物的 5’端连接XmaI的酶切位点序
列，反向引物的 5’端连接BamHI酶切位点序列，所设
计的克隆引物由上海生工生物有限公司合成，实验所
用引物及检测引物序列如下：
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pPDF1.2- XmaI- F：5’- CCCCCGGGGGAAATC
TTTGGTGCTTGATCG-3’；
pPDF1.2- BamHI- R：5’- CGGGATCCCGTATAGA
TGTATGTGTTGTGTGAAG-3’；
pPR1-XmaI-F：5’-TCCCCCCGGGGGGATAACG
ATCATTGATTAGTATA-3’；
pPR1-BamHI-R：5’-CGGGATCCCGATGGTTATT
GTTGTGTTAT-3’；
用于转基因植株的PCR检测引物为 3条，在荧光
酶素基因上设1条共同的引物，PR1与PDF1.2基因启
动子上各设 1 条正向引物，PCR 产物大小都为
800 bp。具体序列如下：
LUC-JR：5-GCAACTCCGATAAATAACGCG-3；
pPR1- JF：5- ATCTTAATTGCCAAACTGTCCGA-
3；
pPDF1.2- JF：5- TGTCTAGGGGTGATCCTCTA
ATCG-3。
1.2.3 PR1pro::Luc与 PDF1.2pro::Luc表达质粒的构建
用CTAB[23]法提取拟南芥Col-0的总DNA。利用上面
设计的 2对引物，以总DNA为模板，扩增出两基因的
启动子片段。切胶回收后连接到 pEASY-Blunt vector
上，通过热激法[24]转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR检
测出阳性克隆送测序。用XmaI和BamHI两种限制性
内切酶分别对测序正确的 pEASY- Blunt- PR1pro、
pEASY-Blunt-PDF1.2pro和 pCAMBIA1381Z-Luc进行
双酶切，分别回收目标片段和目标载体；T4连接酶
16℃连接过夜，获得具有 PR1pro::Luc与 PDF1.2pro::
Luc表达框的2种质粒；通过热激法转化感受态大肠杆
菌DH5α，对PCR检测出为阳性的菌落，扩大培养后用
OMEGA公司质粒提取试剂盒提取质粒而后双酶切
验证。
1.2.4 拟南芥遗传转化与转基因植株筛选 将经XmaI
和 BamHI 双酶切验证正确的质粒 PR1pro::Luc 与
PDF1.2pro::Luc 通过冻融法 [25]转化到根癌农杆菌
GV3101中，并进行菌落 PCR鉴定和双酶切验证。挑
取正确的菌落，接种到 10 mL YEB培养基中（含庆大
霉素 30 mg/L、卡那霉素 50 mg/L、利福平 100 mg/L），
在 28℃和 200 r/min条件下培养 36 h。再将培养的菌
液转至新 50 mL YEB中扩大培养；用浸花法[26]转化野
生型拟南芥Col-0。浸染后的植株暗处理24 h后，移到
长日照条件下生长。T0代种子在含潮霉素B的培养基
上进行抗性筛选，抗性苗经PCR检测为转基因苗的，
再进入纯合子的筛选阶段，直至T3代得到纯合株系。
1.2.5 高灵敏CCD活体荧光成像系统的组装 根据萤
火虫荧光酶催化荧光素放射出的荧光光谱范围[27]与价
格因素，选用Andor公司的高灵敏度CCD相机（型号
为 DU934P- BV），这款相机为背照式 CCD(Back
Illuminated CCD)和可见优化(Vis optimized)，在 450~
780 nm之间有很好的量子效率(Quantum Efficiency)，
最高值在540 nm左右，这与需要检测的荧光光谱的范
围高度契合。数据采集、处理与输出的软件选用
Andor公司的Solis Imaging A，这款软件在 32 bit与 64
bit的Windows(XP, Vista, 7 and 8)下都兼容。从国内公
司订制暗箱，内配升降台一个。电脑为联想台式 PC
机。将相机、暗箱和电脑组装成活体荧光检测系统。
1.2.6 利用CCD活体荧光成像系统进行荧光检测 荧
光检测参考朱健康[28]实验室的方法，稍作修改。试验
材料为MS培养基上生长12天左右的T3代转基因纯合
子植株。分别用10 μmol/L罗勒烯，5 μmol/L茉莉酸甲
酯或 5 μmol/L 水杨酸甲酯保湿处理 24 h 后，将
1 mmol/L的D-荧光素均匀喷洒于小苗上，避光处理
5 min，利用CCD活体荧光成像系统进行荧光检测。
2 结果与分析
2.1 PR1，PDF1.2启动子与荧光素酶基因表达质粒的
构建
以设计好的 2对引物分别扩增PR1、PDF1.2启动
子目标片段，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离扩增产
物，得到的 2个扩增片段的大小与目标片段预计大小
一致（PR1 启动子为 2303 bp，PDF1.2 启动子为
1485 bp）（图2）。这2个片段克隆到中间载体pEASY-
Blunt vector上，对目标片段进行测序，测序的序列在
图1 双元表达质粒构建示意图
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徐 健等：罗勒烯信号传导途径各组分突变体高通量活体荧光筛选技术系统的建立
NCBI上进行 BLAST比对，结果与已公布的 PR1、
PDF1.2的启动子序列一致。
将序列正确的 2个中间载体与 pCAMBIA1381Z-
Luc载体同时进行BamHI和XmaI双酶切，电泳回收目
标片段后，将回收到的PDF1.2与PR1启动子序列分别
与双酶切的pCAMBIA1381Z-Luc载体连接，分别构建
成PDF1.2pro::luciferase与PR1pro::luciferase两个表达
质粒。经 PCR检测与质粒进行双酶切验证。双酶切
结果得到的条带大小与预期的片段大小一致（图 3），
证明载体构建成功。
3000 bp2000 bp
2000 bp1500 bp
Pro：promoter的缩写
图2 高保真扩增PR1、PDF1.2启动子
3000 bp2000 bp
2000 bp1500 bp
M：100 bp DNA Marker
图3 PDF1.2::luciferase与PR1::luciferase质粒双酶切验证
2.2 拟南芥转化与纯合子筛选
将构建好的质粒通过农杆菌介导的浸花法转化
Col-0，收集T0代种子，铺在含潮霉素的筛选培养基上，
从筛选到的抗性苗中各取14株，提取这些抗性苗的基
因组 DNA，分别用 pPR1- JF/LUC- JR引物对，以及
pPDF1.2-JF/LUC-JR引物对其进行PCR检测，Col-0总
DNA作为阴性对照，结果发现除了 pPR1-JF/LUC-JR
引物对检测的 6号抗性苗没有条带外，其余均扩增出
了较亮的条带，条带大小与预期结果一致，为 800 bp
（图 4）。收获转基因植株的种子，继续进潮霉素筛选
与PCR检测，直到获得T3代纯合子。
2.3 纯合子转基因植株的荧光检测
在培养皿中生长12天的转基因纯合植株，经过茉
莉酸甲酯、水杨酸甲酯和罗勒烯24 h的处理后。在植
株上喷施底物D-荧光素，黑暗中放置5 min，转到自组
装的高灵敏CCD活体荧光成像系统下观察，结果看到
明显的发明亮荧光的小植株（图5）。表明构建的荧光
酶-荧光素报告系统在拟南芥当中能正常工作，以及自
组装的活体荧光检测系统都能正常工作。至此，由报
告系统与活体荧光检测系统组成的筛选技术体系构建
成功。
3 结论与讨论
罗勒烯是一个受到关注时间不长的一个植物通讯
信号分子。为提高筛选罗勒烯信号传导途径上各种组
分的基因突变体的效率，借助萤火虫荧光酶-荧光素的
报告系统与活体荧光成像系统相结合组成的技术体系
是目前较为有效且创新的技术手段。本研究通过对不
同高灵敏CCD相机的技术参数分析，选用合适的相
机，成功组装了一台经济适用的荧光活体检测仪，并通
过此套荧光检测系统成功获得罗勒烯诱导表达的高亮
荧光转基因植株（图5）。这套系统效率高，理论上讲，
一个150 mm ×14 mm的培养皿能够铺大约500颗拟南
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芥种子；活体成像系统的图像处理仅需 5 min，利用这
套体系一天至少能筛选大概 15000株幼苗，10天可以
筛选 15万株苗。也就是说拟南芥中的每个基因平均
有 5次以上的被突变的机会，这为鉴定罗勒烯信号传
导途径的组成成分奠定了良好的基础。
目前，采用正向遗传学策略来研究信号传导途径
上的各种成分，主要的手段是EMS诱变加活体荧光检
测，而实施这这一过程的主要障碍之一是：昂贵的活体
荧光检测仪器导致这套系统难以普及。笔者自组装的
这套荧光素酶-荧光素报告加活体荧光检测系统，相对
市场上销售的同功能商品化的仪器，其价格只有市场
上的1/3到1/6，破解了仪器昂贵这一现实难题，一般普
通实验室都可以承担。另外，这套自组装仪器，不仅适
合拟南芥突变体筛选，也适合其他不同大小的植株，因
为只需调节暗箱中的升降台的高度就可以适合不同大
小的材料。这套系统对于普及用正向遗传学的方法来
筛选不同信号途径中各组成成分突变体，揭示信号传
导机制有现实意义。
另外，从纯合子转基因植株的荧光检测情况来看，
并不是所有的转基因植株都能发出希望的荧光，有的
转基因植株不能发出可以检测到的荧光，有的不诱导
也能发出高亮的荧光。出现这种现象的原因应该很复
杂，比如转基因的修饰沉默，插入位点的位置效应，底
物D-荧光素的喷施不均匀等。尽管原因复杂，也说明
一种现象，即转基因纯合子要想成为能用于能有效筛
选到理想突变体的基础材料，就必须筛选到不诱导不
发荧光，诱导后能发高亮荧光的植株，用这种类型植株
的种子进行EMS诱变。此外，对植物防御途径的研
M：100 bp DNA Marker，T1：T1代抗性苗，T3：T3代转基因纯合植株
图4 转基因植株的分子检测
A为CCD相机和暗箱组装成活体荧光检测仪器；B为喷施底物D-荧光素后检测到的发冷光的荧光植株
图5 喷施荧光底物后检测到的发荧光植株
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徐 健等：罗勒烯信号传导途径各组分突变体高通量活体荧光筛选技术系统的建立
究，首先要注意的是控制好环境条件，不同生物胁迫和
非生物胁迫都可能影响活体荧光的检测。实验当中就
遇到过因为出现根部发生虫害，导致带 PR1::
Luciferase表达框植株的荧光检测非常微弱或检查不
出的异常现象。通过严格控制环境条件，这种现象
消失。
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