全 文 ：002077　J. Shan xi A gr ic. Univ.
学 报
收稿日期:2005-03-11　　　修回日期:2005-04-23
作者简介:李彦平 (1979-), 女 (汉), 山西代县人 , 硕士 , 主要从事烟草育种方面的研究。
通讯作者:魏治中教授 , 硕士生导师。 Tel:0354-6288816;E-mail:s xauw zz@126. com
　　文章编号:1671-8151 (2006) 01-0010-03
烟草与紫苏 、 罗勒及其远缘杂种 F1 酯酶同工酶分析
李彦平1 , 韩永明2 , 魏治中1
(1. 山西农业大学 农学院 , 山西 太谷 030801;2. 山西农科院玉米所 , 山西忻州 034000)
摘 要:利用远缘杂种 8611×17Q 与紫苏 、 Hicks与罗勒的杂交子代 F1 及其亲本进行酯酶同工酶对照分析。结果表明:
两杂交组合 8611×17Q 与紫苏 、 Hicks与罗勒杂交子代 F1 的酶谱特征主要偏向于母本烟草 , 在其酶谱中发现都含有双
亲同源的酶带和新增的双亲不含有的特异酶带 , 在 Hicks 与罗勒杂交组合子代酶谱中还发现了缺失了其母本的 a1 , c3
酶带。通过以上同工酶分析 , 证明了两个杂交子代中分别传入了其父本药用植物紫苏与罗勒的遗传物质。此研究为远缘
杂交种真伪鉴定提供一种简单有效的方法。
关键词:烟草;紫苏;罗勒;酯酶同工酶
中国分类号:Q321 +. 3 文献标识码:A
Analysis of Esterase Lsozyme of the Prosterities of Tobacco by Distant Hybridiztation Between Tobacco and Medical Plant
LI Yan-ping , HAN Yong-ming , WEI Zhi-zhong.
(Collegeo f Agriculture , S hanx i Agricultural University , Taigu Shanx i 030801 , China)
Abstract:I n the present paper , analy sis o f esterase isozyme w as ca rried out in parents and their filial g ener ation by means
of distant hybridation between tobacco and medical plant such as Perilla f rutescens Britt and Coinmum bailcm L . The re-
sult revealed that the majo rity cha racters of the estera se isozyme printing in the two hybridiza tion combina tion were inclined
to female pa rent tobacco. I ts found tha t the enzymeband simila r to their pa rents and the new enzymeband which were differ-
ent to their parents were pr oduced in the hybridiza tion genera tion enzyme printing. In addition , the o ffspring of hybridiza-
tion combination in Hicks and Cinmum bailcm L. had two a1 and c5 enzymebands fewer than maternal plant (H icks).
Through the above analy sis o f esterase iso zyme , it proved tha t heredity substance in medical plants had been introduced into
their cro ss filial g ener ation. H ence , estera se iso zyme analy sis was a simple and effective method to test distant hybridiza-
tion.
Key words:Tobacco;Peril la f rutescens Britt;Coinmum bailcm L;Estera se iso zyme
　　随着社会生产的发展 , 人们健康意识的日益提高 , 培养
低毒少害的新型烟草已成为烟草育种的主攻方向。采用药用
植物与烟草进行有性杂交 , 使药用植物的成分转移到烟草中
就是一种有益的探索[ 1] 。而同工酶标记作为一种最早被利用
的分子标记 , 该标记具有简便 、 快速 、 耗费不高等优点 , 可
以从分子水平上反映一些通过外部形态难以鉴定的遗传变
异 , 因此被广泛应用于植物演化 、 生理 、 病理 、 遗传以及远
缘杂种鉴定等方面的研究[2] 。
本文通过对普通烟草 Hicks 、 8611×17Q 及稳定杂种后
代与药用植物紫苏 、 罗勒远缘杂交 F1 代的幼苗酯酶同工酶
进行电泳分析 , 来验证烟草与紫苏 、 罗勒杂交后的效果 , 探
讨其杂交后代与亲本的关系。并为远缘杂交种真伪的鉴定提
供一种简单有效的手段。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
供体为药用植物:紫苏 (Peri lla f rutescens (L) . )、
罗勒 (Coimum bai licm. L);受体为普通烟草:8611×17Q 、
Hicks;通过有性和无性相结合的杂交方式 , 获得其 F1 代
(8611×17Q) ×紫苏 、 Hicks×罗勒。
1. 2　酯酶同工酶分析
样品制备及同工酶分析参照丁毅等的方法[ 3] 。 各品种
(系)在花盆里培养 , 待长到 5 ～ 6 片幼叶时 , 取幼叶各 0. 3 g ,
加 1 mL 提取液 (0. 05 MTris - Hcl pH8. 0) 冰浴中研磨成
匀浆 , 离心 , 取上清液 , 加等体积 10% (V /V) 甘油 , 冰
箱保存备用。采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 凝胶缓冲液
为 T ris -柠檬酸系统 (pH8. 9), 分离胶浓度为 10%, 浓缩
胶浓度为 4%, 电极缓冲液为 T ris - G ly 系统 (pH8. 7)。电
泳时每孔加样 50 μL , 稳压。电泳完毕 , 取下凝胶流水冲洗
片刻 , 置于染色液 0. 1 g 醋酸α-萘酯溶于 10 mL 丙酮 , 加入
100 mL0. 1 mol L-1 pH6. 4 磷酸缓冲液 , 然后加入 0. 1 g 坚
牢蓝 (RR盐) 搅拌至完全溶解 , 25℃染色 15 ～ 20 min , 流
水漂洗后观察结果并照相。同工酶区带的迁移率 Rf的计算
参见 kunus 的方法 , Rf=酶带迁移距离 /溴酚兰迁移距离[ 4] ,
求出迁移率 Rf=X2 /X1 绘制模式图。
2　结果及分析
2. 1　 (8611×17Q) ×紫苏及其亲本酯酶同工酶分析
　　在 (8611×17Q) ×紫苏及其双亲酯酶同工酶谱中 (图
DOI牶牨牥牣牨牫牳牬牪牤j牣cnki牣issn牨牰牱牨牠牳牨牭牨牣牪牥牥牰牣牥牨牣牥牥牬
1 、 2), 以其迁移速度为依据可划分为 3 个区;S 区为慢速
迁移区 Rf=0. 00 ～ 0. 30 , 在此区内母本 8611×17Q 有 3 条
酶带 a1、 a4 、 a5 , Rf值分别是 0. 03 、 0. 12 、 0. 22 , 父本紫
苏也有 3 条酶带 a2、 a3、 a5 , Rf 值分别是 0. 05、 0. 09 、
0. 22 , 其子代 8611×17Q×紫苏也有 3 条酶带 a1、 a4、 a5 ,
迁移率分别是 0. 03 、 0. 12 、 0. 22。 Fs 区为中速迁移区 Rf=
0. 31～ 0. 70 , (8611×17Q) 有 3 条酶带 b1 、 b2、 b4 , Rf值
分别是 0. 31 、 0. 38 、 0. 60。紫苏有 2 条酶带 b5、 b6 , Rf值
分别是 0. 63 、 0. 66。8611×17Q×紫苏有 4 条酶带 b1、 b2 、
b3 、 b4 , Rf 值分别是 0. 31 、 0. 38 、 0. 47 、 0. 60。 F 区为快
速迁移区 , Rf=0. 71 ～ 1. 00 , 8611×17Q 在此区有 1 条酶带
c1 , Rf值为 0. 72 , 紫苏有 3 条酶带 c1 、 c2、 c3 , Rf值分别
是 0. 72 、 0. 79、 0. 86 , 子代 (8611×17Q) ×紫苏有 2 条酶
带 c1、 c4 , Rf 值分别为 0. 72 、 0. 90。由上可以看出 , (8611
×17Q) ×紫苏及其亲本的酯酶同工酶带多集中在 Fs 区 ,
有 2～ 4 条酶带 , 其中子代最多 , 有 4 条酶带 , 母本有 3 条
酶带 , 父本有 2条酶带;其次是 S 区 , 子代及其父母本各有
3 条酶带;在 F 区酶带最少 , 子代有 2 条酶带 , 父本紫苏有
3 条酶带 , 母本 8611×17Q 此区有 1条酶带。
图 1 (8611×17Q) ×紫苏及其双亲酯酶同工酶图谱
Fig. 1 Ester ase isozyme zymog ram figure o f 8611 ×
17Q ×Peri lla f rutescens. L
图 2 (8611×17Q) ×紫苏及其双亲酯酶同工
酶谱模式图
Fig. 2 Esterase isozyme zymog ram patterns o f
8611×17Q ×Perilla f rutescens. L
从图 (1、 2) 中可看出 , 在酯酶同工酶中 , 杂交子代
(8611×17Q) ×紫苏有 1 条强带 c1 (Rf=0. 72), 6 条次级
酶带 a1、 a5、 b1、 b2 、 b3 、 b4 (Rf=0. 03、 0. 22 、 0. 31、
0. 38、 0. 47 、 0. 60), 2 条弱酶带 a4、 c4 (Rf=0. 12、 0. 09)
出现。与双亲同源的酶带有 2 条 a5 (Rf=0. 22)、 c1 (Rf=
0. 72), 其中 a5的酶带比双亲的都强 , c1 的酶带比母本的酶
带强而弱于父本的酶带 。子代与母本单独同源的酶带有 5 条
a1( Rf=0. 03)、a4(Rf=0. 12)、b1(Rf =0. 31)、b2(Rf =
0. 38)、b4(Rf=0. 60)。与父本单独同源的酶带没有出现。有
2 条 b3 (Rf=0. 47)、 c4 ( (Rf=0. 90) 的酶带为子代所独
有 , 但父母本都没有的新增酶带 。
2. 2　Hicks×罗勒及其亲本酯酶同工酶分析
图 3　Hicks×罗勒及其双亲酯酶同工酶图谱
Fig. 3　Este rase iso zyme zymogram o f Hicks×Coimum bai-
licm. L
图 4　Hicks×罗勒及其双亲酯酶同工酶谱模式图
Fig. 4　Estera se isozyme zymog ram patterns of Hicks×Co-
imum bai licm. L
　　在 Hicks×罗勒及其双亲酯酶同工酶谱 (图 3、 4) 中 ,
可以看出 , 在 S 区慢速迁移区有 1 ～ 4 条酶带 , 其中子代
Hicks×罗勒有一条酶带 a4 (Rf=0. 22), 母本 Hicks 有 2 条
酶带 a1 (Rf=0. 06)、 a4 (Rf=0. 22), 父本罗勒有 4 条酶带
a2 、 a3、 a4、 a5 其 Rf 值分别为 0. 08、 0. 13 、 0. 22、 0. 28。
中速迁移区有 2 ～ 3 条酶带 , 母本 Hicks 有 2 条酶带 b1
112006　　　　　　　　　　　　　　李彦平等:烟草与紫苏 、 罗勒及其远缘杂种 F 1 酯酶同工酶分析
(0. 36)、 b4 (Rf=0. 57), 子代有 3 条酶带 b1 (Rf=0. 36)、
b2 (Rf=0. 43)、 b4 (Rf=0. 57), 父本罗勒也有 3 条酶带
b1 (Rf=0. 36)、 b3 (Rf=0. 53)、 b5 (Rf=0. 63)。在 F 区
快速迁移区有 1 ～ 2 条酶带 , 父本有 2 条酶带 c1 、 c2 其 Rf
值分别为 0. 71 、 0. 79 、 母本 Hicks 也有 2 条酶带 c1 (Rf=
0. 71)、 c3 (Rf=0. 88), 子代 Hicks ×罗勒有 1 条酶带 c1 ,
其 Rf=0. 71。由此可以看出 , Hicks×罗勒及其双亲的酯酶
同工酶带多集中在 S 区 , 有 1 ～ 4 条酶带 , 其中父本罗勒最
多有 4 条酶带 , 母本与子代分别为 2 条和 1 条酶带。此外 ,
在 Fs 区也分布着较多的带 , 子代和父本罗勒有 3 条酶带 ,
母本 Hicks有 2条。 F 区酶带分布相对较少 , 父本与母本分
别都为 2 条酶带 , 子代为 1 条酶带。
从图 (3、 4) 中还可以看出 , 在酯酶酶谱中 , 子代
Hicks×罗勒以 1 条强带 c1 (Rf=0. 71), 2 条次强带 a4 (Rf
=0. 22), b4 (Rf=0. 57), 2 条弱带 b1 (Rf=0. 36)、 b2
(Rf=0. 43) 出现 , 与双亲同源的酶带有 3 条 , a4 (Rf=
0. 22)、 b1 (Rf=0. 36)、 c1 (Rf=0. 71), 其中 a4 的酶带与
双亲酶带的强弱基本一致 , 而 b1的酶带比双亲的酶带稍弱 ,
c1 的酶带介于双亲酶带强弱之间。 子代与母本单独同源的
酶带有 1 条 b4 (Rf=0. 57), 母本 Hicks 的酶带 a1 (Rf=
0. 06)、 c3 (Rf=0. 88) 的酶带在子代中没有出现 , 表现为
缺失 , 与父本单独同源的酶带在子代没有出现 , 在子代中新
增的 1 条酶带 b2 (Rf=0. 43), 这条新增带为弱带 , 父母本
都没有与其对应的酶带 。
3　结论与讨论
通过上述对烟草与药用植物远缘杂交 F 1 代及其双亲的
酯酶同工酶电泳分析 , 结果表明:
(1) 不同父本的杂交后代品系的酯酶同工酶谱都出现了
双亲的同源的酶带 , 其主要酶带倾向于母本烟草 , 同时也出
现一些变异 , 在两个组合中都出现了双亲所没有的新增酶
带 , 这可能是药用植物的外缘 DNA 的一段调控序列整合到
烟草的基因组中打破了原有的同工酶表达类型而产生的。陈
芳远等[ 5]在水稻与菅草的远缘杂交后代的同功酶分析中也分
别得到了高粱 、 菅草的酶带以及父母本均没有的新酶带 , 这
与本研究相似。
(2) 在两个组合中都发现了介于双亲强弱之间的酶带。
在 Hicks×罗勒及其双亲的酶谱中其子代有母本酶带缺失现
象。
(3) 利用材料间同工酶特征酶谱可以鉴定远缘杂交的真
伪 , 在两个杂交组合中 , F1 远缘杂种都具有双亲的特征酶
带 , 并发现 , 杂种 F1 酶谱中有新带 , 这可能是两亲本基因
互作而产生的。证明了两个杂交子代中已分别传入了其父本
药用植物紫苏与罗勒的遗传物质。可见 , 利用双亲的同工酶
特征酶带是鉴定远缘杂交真伪最简单的检测手段之一。
参 考 文 献
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(上接第 9 页)
　　 (2) 谷子氮离子注入和60 Co 辐照的效应有明显的区
别。从形态学观察 , 低剂量的60Co 辐照诱发早熟变异较大 ,
高剂量的60Co 辐照诱发高秆变异较大 , 而氮离子诱发矮秆 、
穗长等有益变异较大。若想获得综合性状良好的变异单株 ,
杂交育种等常规育种方法和生物技术方法相结合是一种有效
而有前途的育种方法。
3. 2 　等体离子束的育种学意义
诱变育种的最终目的是获得符合育种目标的有益突变
体。从诱变效果看 , 理化因素可以诱发染色体畸变和基因突
变。从以往的研究结果看 , 辐射处理的结果主要是诱发染色
体畸变。辐射处理虽然更容易提高变异率 , 但染色体畸变的
结果常常破坏了原有的遗传平衡。这样 , 辐射处理后代中的
变异类型尽管较多 , 但获得的有益突变体却较少。而等体离
子束注入对染色体的损伤作用小于γ射线等诱变源 , 可较多
地诱发微突变和点突变等基因突变 , 不至于造成遗传平衡的
破坏 , 获得的有益突变体也较多 。我们的实验也初步证实了
这一点 , 变异个体的形态学观察表明氮离子注入诱发矮秆 、
早熟等有益性状变异大于60Co 辐照。实验初步获得了一些
有益突变体 , 如穗长突变体 G45 , 穗长 48 cm 比对照增长
59%, 粒色突变体 G19 、 G85籽粒由黑色变为亮黄色。这证
明尽管诱变育种中存在诱发突变方向尚难掌握等问题 , 离子
注入作为一种新兴的诱变技术在其发展中还是有着广阔的应
用前景。
参 考 文 献
[ 1] 郑冬官 , 方其英 , 黄德祥 , 等. 离子注入在棉花诱变育种中的诱变功效 [ J] . 安徽农业大学学报 , 1994 , 21 (3):315-317.
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12 　　　　　　　　　　　　山 西 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　26 (1)