全 文 ：天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:107-109
文章编号:1001-6880(2008)01-0107-03
　
　
　收稿日期:2007-04-30　　　接受日期:2007-07-17
＊通讯作者 E-mail:pzyu@shmu.edu.cn
RP-HPLC法测定椭圆叶花锚和花锚中异龙胆黄素的含量
申晓娟 ,段书涛 ,俞培忠＊
复旦大学药学院 , 上海 200032
摘　要:建立了用 RP-HPLC法测定花锚属(Haleniagenus)植物中异龙胆黄素含量的方法 , 采用 KromasilC18柱
(4.6×300mm, 5μm),甲醇-水(65:35)为流动相 , 流速为 1.5 mL/min;检测波长 215nm;异龙胆黄素在 20 ～ 500
μg/mL范围内线形关系良好 , 回归方程为:Y=175.7X-178.92(R=0.9997), 平均回收率为 99.57%, RSD=
1.20% (n=5)。用本方法测得椭圆叶花锚(Haleniaeliptica)中异龙胆黄素的含量为 20.46 μg/g, 花锚(Halenia
corniculate)则为 4.44 μg/g;花锚中的异龙胆黄素是首次被检测到。
关键词:异龙胆黄素;椭圆叶花锚;花锚;含量测定;HPLC
中图分类号:R284.1;Q949.95 文献标识码:A
DeterminationofIsogentisininHaleniaelipticaand
HaleniacorniculatebyRP-HPLC
SHENXiao-juan, DUANShu-tao, YUPei-zhong＊
DepartmentofChemistryofNaturalDrugs, SchoolofPharmacy, FudanUniversity, Shanghai200032 , China
Abstract:AreversedphaseHPLCmethodwasestablishedtodeterminethecontentofisogentisininHaleniagenus.The
sampleswereanalyzedonC18 Column(4.6×300 mm, 5μm), withthemobilephaseofmethanol-H2O(65:35)atthe
detectionwavelengthof215nm, theflowrateof1.5 mL/min.Thelinearrangewasfrom20 to500μg/mLforisogenti-
sin.Regressionequation:Y=175.7X-178.92 (R=0.9997);Theaveragerecoverywas99.57%, RSD= 1.20% (n
=5).ThecontentofisogentisininHaleniaelipticaandHaleniacorniculatewere20.46 and4.44 μg/grespectively.
IsogentisinwasfirstdetectedinHaleniacorniculate.
Keywords:isogentisin;Haleniaelliptica;Haleniacorniculate;contentmeasurement;RP-HPLC
　　龙胆科 (Gentianaceae)花锚属(Halenia)植物全
球约有 80余种 ,分布于北半球及南美 ,其中已进行
有关植物化学研究的有四种:H.corniculate、H.elip-
tica、H.campnulate、H.asclepiadea。我国有该属植物
两种 ,为花锚 H.corniculate和椭圆叶花锚 H.elipti-
ca,主产分布于华北 、西北 、西南各省 ,为蒙藏常用药
物 ,具有抗肝炎 [ 1] 、抗阿米巴[ 2] 、免疫调节 [ 3] 等作
用 。
研究表明 ,异龙胆黄素(isogentisin, 1, 3-二羟基-
7-甲氧基口山酮)仅存在于龙胆科龙胆属(Genti-
ana)、獐牙菜属(Swertia)植物中 ,是该科标志性化合
物之一 [ 4] 。具有单胺氧化酶(MAO)抑制活性 [ 5] ,分
支杆菌抑制活性 [ 6] 。为进一步调查龙胆科植物中
异龙胆黄素的存在 ,我们建立反相高效液相色谱法
测定异龙胆黄素的方法 ,分别对产于我国云南和内
蒙古的 2个花锚属植物进行测定 ,首次发现花锚属
(Halenia)中也存在异龙胆黄素 。
图 1　异龙胆黄素的结构
Fig.1　Thestructureofisogentisin
1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
大连依利特高效液相色谱仪:P200I型泵 ,
UV200II紫外可变波长检测器 , EChrom98色谱工作
站;甲醇为色谱纯 (天津市四友精细化学品有限公
司);水为重蒸水。
1.2　药材及对照品
椭圆叶花锚(Haleniaeliptica)于 2005年 5月采
自云南大理 ,由大理学院药学院生药教研室马晓匡教
授鉴定。花锚(Haleniacorniculate)源自内蒙古 ,由内蒙
古民族大学蒙医药学院包巴根那老师赠送并鉴定。
异龙胆黄素对照品由本课题组从椭圆叶花锚
(Haleniaeliptica)中分离得到 ,经 ESI-MS、1HNMR谱
和 ROSEY谱鉴定结构 , HPLC检测 ,纯度为 98.5%。
1.3　色谱条件
色谱柱:KromasilC18柱(4.6×300 mm, 5 μm)
(大连依利特公司填装);流动相:甲醇-水(65:35);
流速:1.5mL/min;柱温:室温;检测波长:215nm;进
样量:10μL。
1.4　系统适用性试验
理论塔板数不低于 12000。
1.5　方法学考察
1.5.1　线性范围的考察
标准溶液储备液配置:准确称取异龙胆黄素
(isogentisin)对照品 2 mg,置于 1 mL容量瓶中 ,用
90%甲醇溶解 ,定容至刻度 ,摇匀 ,作为标准溶液储
备液(浓度为 2mg/mL)。
标准曲线使用液配置:依次分别精密量取标准
溶液储备液 250、150、100、50、10 μL置 1 mL容量瓶
中 ,用甲醇定容至刻度 ,摇匀 , 0.45 μm微孔滤膜过
滤 ,取续滤液 ,即得 500、300、200、100、20 μg/mL系
列对照品溶液。
在上述色谱条件下注入高效液相色谱仪 ,记录
色谱图 。以对照品峰面积 Y对其溶液浓度 X作图 ,
绘制标准曲线 ,得异龙胆黄素的回归方程为:Y=
175.7X-178.92, R=0.9997 (n=5),结果表明:龙
胆黄素在 20 ～ 500 μg/mL范围内线性关系良好 。
1.5.2　精密度考察
日内精密度:吸取 200 μg/mL对照品溶液在上
述色谱条件下重复进样 5次 ,测定峰面积 ,计算得峰
面积的 RSD为 0.77%。
日间精密度:吸取 200 μg/mL对照品溶液在上
述色谱条件于第一 、二 、三日重复进样 ,测定峰面积 ,
计算得峰面积的 RSD为 1.63%。
1.5.3　样品溶液制备
称取椭圆叶花锚粉末 10.0 g,精密称定 ,置锥形
瓶中 ,加甲醇 250 mL,密塞 ,称定重量 ,超声 (功率
180 W)提取 40 min,放至室温 ,再称定重量 ,用甲醇
补足减失的重量 ,摇匀 ,滤过 ,滤液于低温冷置 0.5
h,析出固体 ,过滤 ,同法提取三次 ,合并滤液蒸干 ,用
甲醇定容于 1mL容量瓶中 ,摇匀 ,经 0.45 μm微孔
滤膜过滤 ,取续滤液备用。析出的固体经甲醇溶解
后 ,在上述色谱条件下检测 ,不含异龙胆黄素 。
1.5.4　重现性试验
取椭圆叶花锚样品 ,按 “样品溶液制备 ”项下操
作 ,平行制备 5份溶液 , 在上述色谱条件下进行
HPLC分析 ,测定峰面积 , 计算得峰面积的 RSD为
1.20%。
1.5.5　稳定性试验
取一份样品溶液 ,分别在 0、12、24、36、48 h进
样 ,以峰面积进行稳定性考察 ,测定峰面积 ,计算各
峰面积的 RSD为 1.83%。
1.5.6　加样回收率试验
称取已测知含量的椭圆叶花锚样品 5份 ,每份
10.0 g,精密称定 , 每组分别精密加入龙胆黄素
0.197mg对照品溶液 ,按 “样品溶液制备 ”项下操
作 ,在上述色谱条件下进行 HPLC分析 ,计算得平均
回收率为 99.57%(RSD为 1.20%)。
2　结果与讨论
2.1　供试品测定
取椭圆叶花锚和花锚药材粉末 ,按 “样品溶液
制备 ”项下操作 ,在上述色谱条件下进样分析 ,测定
峰面积 ,代入标准曲线计算异龙胆黄素的含量 ,椭圆
叶花锚中异龙胆黄素含量为 20.46 μg/g,花锚中异
龙胆黄素含量为 4.44 μg/g,色谱图见图 2。
图 2　对照品(A)、椭圆叶花锚样品(B)和花锚样品(C)HPLC色谱图
Fig.2　TheHPLCChromatogramofisogentisinforthestandard(A), sampleofHaleniaeliptica(B)andsampleof
Haleniacorniculate(C)byHPLC
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2.2　讨论
2.2.1　在色谱条件的选择上 ,我们考察了不同长度
的色谱柱 、不同比例的甲醇-水以及不同 pH值对异
龙胆黄素和其它成分的分离情况 ,发现只有在流动
相甲醇:水为 65:35,在 300 mm的色谱柱上 ,异龙胆
黄素方能与其它成分完全分离 ,但在该条件下 ,一些
极性较低的一羟基取代的口山酮的保留时间较晚 ,
影响了检测效率 ,所以 ,在保证在异龙胆黄素与其它
成分的分离度的条件下 ,我们把流速从 1.0 mL/min
适当提高到 1.5mL/min,缩短了整个分析时间。
2.2.2　本研究对回流和超声提取法进行了比较 ,结
果表明超声提取法的提取率优于回流提取 ,且提取
简单快捷 ,故本实验采取超声提取法 。
2.2.3　本研究分别以甲醇 、90%甲醇 、80%甲醇 、
70%甲醇作为提取溶剂平行操作 ,结果发现 ,甲醇的
提取效果优于其他比例的溶剂 ,故选择甲醇作为提
取溶剂 ,简单方便 。
2.2.4　由于异龙胆黄素在椭圆叶花锚和花锚中的
含量非常低 ,所以必须提高待测样品的浓度 ,按以上
方法提取后仍较难检测到 ,所以必须加以浓缩 。由
于提取物中含有大量极性较低的成分 ,浓缩后的样
品不能被甲醇完全溶解 ,同时也会影响分析时间和
柱效 ,所以我们采取低温冷置的方法 ,让甲醇不溶的
成分在低温下析出 ,在不影响分析的准确性的条件
下 ,提高了待测溶液的浓度 ,使本方法能较好地对异
龙胆黄素进行定量测定。
2.2.5　用本方法测定了我国仅有的 2种花锚属植
物椭圆叶花锚(Haleniaeliptica)和花锚(Haleniacor-
niculate)中的异龙胆黄素 ,首次检测到花锚(Halenia
corniculate)中也含有异龙胆黄素;2种植物中异龙胆
黄素的含量相差较大 ,这与植物品种 、产地 、采摘季
节 、贮藏的时间等都有关系;本研究仅提供一种异龙
胆黄素的检测方法 ,有关植物体内的含量变化情况
尚需作进一步研究 。
致谢:感谢大理学院药学院刘光明教授 、马晓匡
教授提供并鉴定椭圆叶花锚(Haleniaeliptica)原植
物;同时感谢内蒙古民族大学蒙医药学院包巴根那
老师赠送并鉴定花锚(Haleniacorniculate)原植物。
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109Vol.20 申晓娟等:RP-HPLC法测定椭圆叶花锚和花锚中异龙胆黄素的含量