全 文 ：收稿日期：２０１１　１２　２１
基金项目：国家自然科学基金项目（３０９００９７３）
作者简介：郭强梨（１９８７ ），女，河南滑县人，在读硕士研究生，研究方向：基因工程与细胞工程。Ｅ　ｍａｉｌ：５７８５８００８７＠ｑｑ．ｃｏｍ
＊通讯作者：王子成（１９７４ ），男，河南邓州人，副教授，博士，主要从事植物生物技术与表观遗传研究。Ｅ　ｍａｉｌ：ｗｚｃ＠ｈｅｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
留兰香茎尖超低温保存及遗传变异分析
郭强梨，李忠爱，邵　丽，王子成＊
（河南大学 生命科学学院，河南 开封４７５００４）
摘要：为了长久保存留兰香种质资源，以留兰香（Ｍｅｎｔｈａｅ　ｓｐｉｃａｔａｅ　Ｌ．）茎尖为材料，对其玻璃化超
低温保存条件进行研究，并运用扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）和甲基敏感扩增多态性（ＭＳＡＰ）对玻
璃化超低温保存再生材料（处理组）的遗传与表观遗传稳定性进行分析。结果表明：留兰香试管苗
于４℃低温锻炼２８ｄ，于添加２ｍｏｌ／Ｌ甘油的 ＭＳ培养基中预培养４ｄ，０℃下于ＰＶＳ２ 中脱水
５０ｍｉｎ，液氮保存１ｈ或者更长时间，成活率最高，可达６０％左右，再生植株分化正常；超低温处理
后再生材料（处理组）与正常继代材料（对照组）之间未发现有ＤＮＡ片段的差异；与对照相比，处理
组的材料均发生了甲基化状态与水平的变化，全基因组ＤＮＡ胞嘧啶甲基化水平降低，另外，甲基
化与去甲基化位点比率分别为８．９３％和１２．３％，说明超低温处理能够引起ＤＮＡ甲基化的变化。
由此推测，ＤＮＡ甲基化可能是植物适应超低温保存的机制之一。
关键词：留兰香；超低温保存；ＡＦＬＰ；ＭＳＡＰ；ＤＮＡ甲基化
中图分类号：Ｓ５６７．２３　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００４　３２６８（２０１２）０６　０１２８　０５
Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｅｎｔｈａ　ｓｐｉｃａｔａ　Ｌ．Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ａｎｄ
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ
ＧＵＯ　Ｑｉａｎｇ－ｌｉ，ＬＩ　Ｚｈｏｎｇ－ａｉ，ＳＨＡＯ　ｌｉ，ＷＡＮＧ　Ｚｉ－ｃｈｅｎｇ＊
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋａｉｆｅｎｇ　４７５００４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅａｒｍｉｎｔ（Ｍｅｎｔｈａ　ｓｐｉｃａｔａ　Ｌ．）ｆｏｒ　ａ　ｌｏｎｇ　ｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔ－
ｔｉｐｓ　ｏｆ　ｓｐｅａｒｍｉｎｔ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｖｉｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｏｆ
ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＭＳＡＰ）ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
（ＡＦＬＰ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎｄ　ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｈｏｏｔ　ｔｉｐｓ　ｗｅｒｅ　ｃｒｙｏａｃｃｌｉｍａｔｉｚｅｄ　ａｔ　ａ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（４℃）ｆｏｒ　２８
ｄａｙｓ，ｐｒｅ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　２ｍｏｌ／Ｌ　ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ａｆｔｅｒ　４ｄａｙｓ，ｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ　ｉｎ
ＰＶＳ２ａｔ　０℃ｆｏｒ　５０ｍｉｎ，ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ｆｏｒ　１ｈｏｕｒｓ　ｏｒ　ｌｏｎｇｅｒ，ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ
ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｕｐ　ｔｏ　６０％．Ｎｏ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｂａｎｄ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｈｅ
ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｗａｓ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｉｎ　ｒｅｃｙｃｌｅｄ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｙ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｙｌａ－
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｗｅｒｅ　８．９３％ａｎｄ　１２．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｉｔ　ｓｕｇｇｅｓｔｓ　ｔｈａｔ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈ－
ｙｌａｔｉｏｎ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｕｓｅｄ　ｂｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｔｏ　ｃｏｍｂａｔ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｍｅｎｔｈａ　ｓｐｉｃａｔａ　Ｌ．；ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ＡＦＬＰ；ＭＳＡＰ；ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
　　留兰香（Ｍｅｎｔｈａ　ｓｐｉｃａｔａ　Ｌ．）又名绿薄荷、花香
菜，为唇形科薄荷属多年生草本植物，在民间被广泛
药用和食用［１－３］，也可用作香皂之香精。另外，留兰
香可用作地被植物，在水土流失严重的坡地种植可
有效减轻和控制水土流失，起到良好的生态保护作
用［４－６］。我国关于留兰香种质资源保存的研究目前
　河南农业科学，２０１２，４１（６）：１２８－１３２
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2012.06.027
尚鲜见报道。作为多年生草本植物，留兰香在长期
种植过程中，易感染各种病害，造成病毒的积累，使
产量下降。建立离体保存技术，对于种质保存和病
毒脱除都具有重要的意义［７－８］。鉴于此，采用玻璃化
法对留兰香离体茎尖的超低温保存技术进行了初步
研究，并对超低温保存后留兰香叶片ＤＮＡ甲基化
状态和水平进行了检测，以期为该物种种质的长期
保存提供技术手段。
１　材料和方法
１．１　材料
以河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传
工程实验室所提供的留兰香幼苗为试验材料，选用
继代培养基 ＭＳ＋０．２ｍｇ／Ｌ　６ ＢＡ＋０．０２ｍｇ／Ｌ
ＮＡＡ进行增殖培养，ｐＨ值５．８，培养温度（２５±２）℃，
光照时间１２ｈ／ｄ。
１．２　方法
１．２．１　超低温保存过程　参照王子成等［９］的方法，
具体操作步骤如下。
①低温锻炼：将继代培养２０ｄ的留兰香试管苗
置于４℃冰箱中进行低温锻炼，并设置时间梯度，分
别为０、７、１４、２１、２８、３５、４２ｄ。
②预培养：取低温锻炼后的试管苗，在无菌条件
下切取１～２ｍｍ长的茎尖，置于固体预培养培养基
中，分别预培养１、２、３、４、５、６ｄ，然后转入加有液体
预处理培养基的无菌冷冻管中，每管１０个茎尖，
２０℃下处理２０ｍｉｎ。固体预培养培养基为 ＭＳ＋
２ｍｏｌ／Ｌ甘油＋０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖＋７ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ
值５．８；液体预处理培养基为 ＭＳ＋２ｍｏｌ／Ｌ甘油＋
０．４ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，ｐＨ值５．８。
③玻璃化保护剂（ＰＶＳ２）处理：用无菌胶头滴管
吸出液体预处理培养基，加入玻璃化溶液ＰＶＳ２ 并
置于０℃冰水混合物中处理不同时间，分别为２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０ｍｉｎ。ＰＶＳ２ 溶液为 ＭＳ＋３０％
甘油＋１５％乙二醇＋１５％ 二甲基亚砜＋０．４ｍｏｌ／Ｌ
蔗糖，ｐＨ值５．８。
④液氮保存：将冷冻管放入纱布袋，迅速投入液
氮中保存，液氮保存时间设为１、２４、４８、７２、９６ｈ
５个梯度。将在液氮中保存不同时间的材料快速取
出，４０℃水浴中化冻２～３ｍｉｎ，在超净工作台下吸去
冷冻保护液，然后在２０℃下用添加有１．２ｍｏｌ／Ｌ蔗
糖的 ＭＳ洗涤液将茎尖洗涤３次，每次１０ｍｉｎ。将茎
尖取出并置于无菌滤纸上吸去残留在其表面上的洗
涤液成分后，接种到恢复培养基上。恢复培养基为
ＭＳ＋１．０ｍｇ／Ｌ　ＧＡ３＋１．０ｍｇ／Ｌ　６ ＢＡ＋３％蔗糖＋
０．７％琼脂，ｐＨ值５．８。暗培养３ｄ后转移到正常光
照条件下进行恢复培养，７ｄ后统计成活率。
成活率＝超低温保存后成活的茎尖数／保存的
总茎尖数×１００％。
１．２．２　ＤＮＡ提取　取超低温保存处理组和对照组
（正常继代）的留兰香叶片，使用Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｖｅｒ．３．０进行ＤＮＡ提取。
１．２．３　ＤＮＡ检测　取ＤＮＡ原液８．０μＬ，稀释至
３．０ｍＬ，用紫外分光光度计测定２６０ｎｍ和２８０ｎｍ
波长下的吸光值，计算ＤＮＡ纯度和原液ＤＮＡ质量
浓度。ＤＮＡ 纯度＝ＯＤ２６０／ＯＤ２８０，ＤＮＡ 质量浓度
（ｎｇ／ｍＬ）＝５０×ＯＤ２６０×稀释倍数。取 ＤＮＡ原液
２μＬ，１％琼脂糖凝胶上稳压（５Ｖ／ｃｍ）电泳３０ｍｉｎ，
检测 ＤＮＡ 的质量，若主条带明亮，并且无拖尾现
象，则ＤＮＡ可用于后续试验。
１．２．４　ＡＦＬＰ分析　ＡＦＬＰ分析参照 Ｈａｏ等的方
法［１０］，略作改动：①选用 ＤＮＡ双酶切体系：２０μＬ
体系含２００ｎｇ　ＤＮＡ、３ＵＥｃｏＲⅠ和３Ｕ ＭｓｅⅠ，
３７℃酶切３ｈ，然后６５℃保温２．５ｈ；②连接：ＥｃｏＲ
Ⅰ 接头，ＭｓｅⅠ接头，Ｔ４连接酶，２５℃连接２．５ｈ；
③预扩：引物为Ｅ　Ａ、Ｍ　Ｃ；④选扩。⑤选扩产物
９４℃变性５ｍｉｎ后上样于６％ＰＡＧＥ，恒功率５５Ｗ电
泳２．５ｈ，固定、银染漂洗与显色后拍照并分析结果。
１．２．５　ＭＳＡＰ分析　基因组的ＤＮＡ甲基化变化
采用 ＭＳＡＰ方法分析，参照Ｃｅｒｖｅｒａ等［１１］和李雪林
等［１２］的方法，并略作改动。与上述ＡＦＬＰ方法类似，
其中内切酶组合为ＥｃｏＲⅠ／ＨａｐⅡ和ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｐⅠ。
接头为ＥｃｏＲⅠ接头和Ｈ　Ｍ接头，预扩引物为Ｅ　Ａ
和ＨａｐⅡ ＭｓｐⅠ。
２　结果与分析
２．１　不同处理对超低温保存留兰香茎尖存活率的
影响
２．１．１　低温锻炼时间　如图１所示，低温锻炼
２８ｄ，留兰香茎尖存活率高达５９．２％，然后随着锻
炼时间的延长，成活率出现下降趋势。且叶片逐渐
枯黄、淡褐色的茎尖增多，低温锻炼４２ｄ时存活率
降到最低４．０％。
２．１．２　预培养时间　将低温锻炼２８ｄ的留兰香茎
尖转入固体预培养培养基中，结果如图２所示，茎尖
成活率随预培养时间的延长呈现先升高后降低的趋
势，预培养３ｄ时，超低温保存效果最好，成活率达
到６２．５％。
２．１．３　ＰＶＳ２ 处理时间　ＰＶＳ２ 处理是超低温保存
过程中极为关键的一步。结果表明（图３）：ＰＶＳ２ 处
９２１　第６期 郭强梨等：留兰香茎尖超低温保存及遗传变异分析
理５０ｍｉｎ时的茎尖成活率最高，时间过短或更长都
不利于茎尖的成活和再生。可能是由于时间过短导
致玻璃化不完全，冻存过程中植物茎尖受到损伤；时
间过长，ＰＶＳ２ 的毒害作用导致茎尖存活率下降。
２．１．４　液氮保存时间　由图４可知，液氮保存时间
对植物茎尖的成活率影响不大，可能是由于在超低
温状态下细胞生理代谢水平几乎降为零，处于一种
“生机停顿”状态，时间梯度对试验结果已经没有意
义（图４）。这也可以说明液氮保存可以作为植物种
质资源长期保存的一种有效方法。
图１　低温锻炼时间对超低温保存后留兰香
茎尖存活率的影响
图２　预培养时间对超低温保存后留兰香
茎尖存活率的影响
图３　ＰＶＳ２ 处理时间对超低温保存后留兰香
茎尖存活率的影响
图４　液氮处理时间对超低温保存后留兰香
茎尖存活率的影响
２．２　应用ＡＦＬＰ分子标记检测留兰香基因组稳定
性结果
应用ＡＦＬＰ技术对处理组和对照组的材料进
行检测分析，６对引物共扩增出可统计条带３６５条。
如图５所示，２组材料之间没有出现多态性位点。
说明对照与处理样品之间基因组序列保持一致，没
有发生该方法可以检测到的遗传变异。
Ｈ１，Ｈ２为ＥｃｏＲⅠ／ＭｓｅⅠ酶切；Ｈ１、Ｈ２泳道分别为
对照组和处理组的ＡＦＬＰ带型
图５　超低温处理与对照之间基因组的ＡＦＬＰ扩增结果
２．３　应用 ＭＳＡＰ分子标记检测留兰香基因组ＤＮＡ
甲基化结果
２．３．１　甲基化水平　 ＨｐａⅡ和ＭｓｐⅠ是一组同裂
酶，二者均识别并切割５′ＣＣＧＧ３′序列，但是对胞嘧啶
的甲基化敏感性不同。ＨｐａⅡ对胞嘧啶的甲基化极
其敏感，能识别并切割非甲基化和半甲基化位点，而
不能切割全甲基化位点。而ＭｓｐⅠ能识别并切割非
甲基化和全甲基化位点而不能切割半甲基化位点。
处理组和对照组的 ＤＮＡ 经 ＨｐａⅡ／ＥｃｏＲⅠ
（Ｈ）和ＭｓｐⅠ／ＥｃｏＲⅠ（Ｍ）酶切后的产物有４种类
型，但是，在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上只能检测
出３种类型。其中，类型Ⅰ表明ＣＣＧＧ位点没有发
生甲基化变化（如图６中ａ所示），类型Ⅱ表明
ＣＣＧＧ位点发生了半甲基化（如图６中ｂ所示），类
０３１ 河南农业科学 第４１卷　
型Ⅲ表明ＣＣＧＧ位点发生了全甲基化（如图６中ｃ
所示）。由表１可知，经超低温处理后留兰香全基因
组ＤＮＡ胞嘧啶甲基化水平降低，并且全甲基化率
高于半甲基化率。
Ｈ１，Ｈ２为ＨｐａⅡ／ＥｃｏＲⅠ酶切，Ｍ１，Ｍ２为ＭｓｐⅠ／ＥｃｏＲⅠ
酶切；Ｈ１和 Ｍ１泳道为对照组的 ＭＳＡＰ带型；Ｈ２和 Ｍ２
泳道为处理组的 ＭＳＡＰ带型
图６　超低温处理与对照之间基因组
的甲基化敏感性扩增结果
２．３．２　甲基化状态　利用１２对不同引物组合对处
理组和对照组的ＤＮＡ双酶切产物进行扩增，共出
现１２种带型（表２），甲基化带型主要有多态性和单
态性２种。多态性即对照与处理组之间有不同的带
型〔甲基化（Ａ型）、去甲基化（Ｂ型）和不定类型（Ｃ
型）〕，表明ＣＣＧＧ位点甲基化状态在超低温处理之
后发生改变。单态性即对照组与处理组之间有相同
的带型 （Ｄ型），表明低温处理后ＣＣＧＧ位点的甲基
化状态没发生变化。
由表３可知，处理组的ＤＮＡ甲基化（Ａ型）位
点数为４５个，占总甲基化多态性扩增位点数的
８．９３％；去 甲 基 化 （Ｂ 型）位 点 数 为 ６２ 个，占
１２．３％；总甲基化多态性为２３．０２％；甲基化状态未
发生变化（Ｄ型）的比率为７６．９８％。
由此，处理组与对照组相比，总甲基化比率降
低；在扩增的甲基化位点中，去甲基化的位点数高于
发生甲基化的位点数，同时基因组ＤＮＡ甲基化多
态性也随之增加。
表１　超低温保存对留兰香基因组ＤＮＡ甲基化水平的影响
样本 未甲基化带数／个 完全甲基化带数／个 半甲基化带数／个 总扩增带数／个 总甲基化带数／个 总甲基化比率／％
对照组 ２６３（５４．４５％） １８９（３９．１３％） ３１（６．４２％） ４８３　 ２２０　 ４５．５５
处理组 ３０４（６３．８７％） １４４（３０．２５％） ２８（５．８８％） ４７６　 １７２　 ３６．１０
　注：括号中数据为占扩增总数的比例。
表２　处理组与对照组材料的甲基化带型
酶切方式
Ｈ　 Ｍ　 Ｈ　 Ｍ
甲基化状态变化
处理前 处理后
变异位
点数／个
带型
０　 ０　 ０　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
４ Ｂ３
０　 ０　 １　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
７ Ｂ４
０　 １　 １　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
３１ Ｂ１
１　 ０　 １　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ　ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ　ＧＧＣＣ
２０ Ｂ２
１　 １　 １　 ０
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ　ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ　ＧＧＣＣ
８ Ａ２
１　 １　 ０　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
９ Ａ１
０　 １　 ０　 ０
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
１８ Ａ３
１　 ０　 ０　 ０
ＣＣＧＧ　ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ　ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
１０ Ａ４
０　 １　 １　 ０
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ　ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ　ＧＧＣＣ
９ Ｃ
１　 １　 １　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
２４６ Ｄ１
１　 ０　 １　 ０
ＣＣＧＧ　ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ　ＣＣＧＧ
ＣＣＧＧ　ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ　ＧＧＣＣ
１１ Ｄ２
０　 １　 ０　 １
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
ＣＣＧＧ
ＧＧＣＣ
１３１ Ｄ３
　注：Ｃ和ＣＣ表示甲基化的胞嘧啶；１：有带，０：无带。
１３１　第６期 郭强梨等：留兰香茎尖超低温保存及遗传变异分析
表３　超低温保存对留兰香基因组ＤＮＡ甲基化状态的影响
样本
甲基化
带数／个
总甲基化多态性带型
Ａ型 Ｂ型 Ｃ型 多态性
单态性带型
（Ｄ型）
处理组 ５０４　 ４５（８．９３％） ６２（１２．３％） ９（１．８％） １１６（２３．０２％） ３８８（７６．９８％）
　注：甲基化带数＝Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ；括号中数据为占甲基化带数的比率。
３　讨论
本研究对留兰香的超低温保存技术进行了初步
研究，发现采用低温锻炼和预培养可以大大提高留
兰香超低温保存成活率，而ＰＶＳ２ 处理时间也对超
低温保存成活有重要影响，这与其他植物超低温保
存的结果相似［９，１３］。从形态以及分子方面对超低温
保存后再生留兰香材料进行了遗传稳定性检测。就
形态上，处理组与对照组相比没有明显的变化；
ＡＦＬＰ分析表明，处理组与对照组之间未发现差异
条带，说明留兰香材料在ＤＮＡ水平上没有发生遗
传变异，这与Ｋａｉｔｙ等、Ｐｅｒｅｄｏ等在木果上的研究结
果一致［１４－１５］；ＭＳＡＰ分析表明，处理组的ＤＮＡ胞嘧
啶甲基化水平降低，并且全甲基化率高于半甲基化
率，另 外 甲 基 化 与 去 甲 基 化 分 别 为 ８．９３％ 和
１２．３％，这说明了超低温处理能够引起ＤＮＡ甲基
化的变化。在经超低温处理的再生材料表观遗传变
异方面有也有报道，如 Ｋａｉｔｙ等［１４］、Ｐｅｒｅｄｏ等［１５］与
何艳霞等［１６］的研究结果表明，经过超低温处理的材
料与对照组相比均发生了甲基化变化。应该指出的
是，超低温保存后再生的材料中留兰香油含量等与
对照有无区别，还需要进行研究，另超低温保存后再
生材料的病毒脱除情况也需要进一步分析。
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ｐｈｉｓｍ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ　ｉｎ　ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ　ｐｌａｎｔｓ　ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ　ｆｒｏｍ　ｃｒｙｏｐｒ－
ｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｒｙｏ－ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，２３（１）：３７－４６．
［１１］　Ｃｅｒｖｅｒａ　Ｍ，Ｒｕｉｚ－Ｇａｒｃｉａ　Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｚａｐａｔｅｒ　Ｊ．Ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ＡＦＬＰ　ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ
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ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓａｎｉｔａｒｙ　ｓｔａｔｅ　ｏｆ　ａ　ｃｖ
Ｐｒｕｎｕｓ　ｒｏｏｔｓｔｏｃｋ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｙ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｗｉｔｈ
Ｐｌｕｍ　ＰｏｘＰｏｔｙｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ，１９９７，１２３：１８９－１９６．
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ｅｖａｌｕａｔｉｏｎａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅ－
ｓｅｒｖｅｄ　ｐａｐａｙａ　ｃｌｏｎｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐ，２００９，２８：
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［１５］　Ｐｅｒｅｄｏ　Ｅ　Ｌ，Ａｒｒｏｙｏ－Ｇａｒｃｉａ　Ｒ，Ｒｅｅｄ　Ｂ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅ－
ｔｉｃａｎｄ　ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｌｄ－
ｓｔｏｒｅｄｈｏｐｓ（Ｈｕｍｕｌｕｓ　ｌｕｐｕｌｕｓ　Ｌ．）［Ｊ］．Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，
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２３１ 河南农业科学 第４１卷