全 文 ：果 树 学 报 2013，30（1）: 55～61
Journal of Fruit Science
五叶草莓超低温保存及遗传稳定性分析
朱文涛 1，周厚成 2，王子成 1*
（1河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传工程实验室，河南开封 475004；
2中国农业科学院郑州果树研究所，郑州 450009）
摘 要：【目的】为了找出野生种质资源五叶草莓（Fragaria pentapylla）的超低温保存方法和分析超低温保存后五叶草
莓的遗传信息稳定性，【方法】 运用玻璃化法对五叶草莓离体茎尖超低温保存技术进行了研究， 并采用 AFLP 和
MSAP 技术对其遗传稳定性作了探讨。 【结果】结果表明，不同的低温锻炼时间、预培养时间、预处理时间、玻璃化溶液
（PVS2）处理时间和液氮保存时间对五叶草莓超低温保存后成活率的影响各不相同，经优化后，低温锻炼 3 周，预培
养 3 d，预处理 30 min，PVS2 处理 60 min 时，超低温保存的最高成活率可达 79.7%，液氮处理时间对成活率影响不明
显；运用 AFLP 技术对超低温后成活生长 120 d 的材料及对照材料基因组 DNA 进行了分析，超低温前后带型一致，
未发现明显差异片段； 进一步用 MSAP 技术分析了超低温保存后成活的材料和对照材料 DNA 甲基化水平差异，结
果表明超低温保存后五叶草莓 DNA 甲基化与去甲基化分别为 5.70%和 12.43%。 【结论】玻璃化法超低温保存技术可
以有效的保存五叶草莓种质资源，超低保存前后的五叶草莓基因组 DNA 没有发生多态性变化，但 DNA 甲基化水平
降低。
关键词： 五叶草莓； 超低温保存； 玻璃化法； 遗传稳定性； 甲基化
中图分类号：S668．4 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2013)01－0055－07
Cryopreservation of Fragaria pentapylla and analysis of genetic stability
ZHU Wen-tao1， ZHOU Hou-cheng2， WANG Zi-cheng1*
（1Plant Germplasm and Genetic Engineering Lab，College of Life Sciences Henan University ， Kaifeng， Henan 475004 China； 2Zhengzhou
Fruit Research Institute，CAAS，Zhengzhou， Henan 450009，China)
Abstract: 【Objective】Objective of the study was to investigate the method of the cryopreservation of Fra-
garia pentapylla and to analyze genetic stability of the samples. 【Method】The cryopreservation technology
of the F. pentapylla shoot tip in vitro was studied by vitrification early， then genetic stability of the samples
was analyzed by Amplification Fragment Length Polymorphism (AFLP) and Methylation Sensitive Ampli-
fied Polymorphism (MSAP) . 【Result】Cold acclimation， pre-culture， pre-treatment， PVS2 treatment，
and liquid nitrogen preservation time had different effects on Fragaria pentapylla’s survival rate after its
cryopreservation. The highest survival rate of shoot tips could reach to 79.7% ， but first of all，shoot tips
must be acclimated for 21 days， then pre-cultured for 3 days， and pre-treated for 30 mins， ultimately，
treated with PVS2 for 60 mins. Genomic DNA of the materials had been analyzed by AFLP after cryop-
reservation for 120 days， and there was not any obvious differences in banding patterns of DNA fragments
between survival material and control material. And then the differences of DNA methylation between sur-
vival material and control material were analyzed by MSAP. Results showed that the methylation and
demethylation rate of F. pentapylla DNA were 5.70% and 12.43%， respectively. 【Conclusion】This study
demonstrates that cryopreservation is an efficient method to keep the F. pentapylla resource. Polymorphism
changes had not been found in the genomic DNA between survival material and control material， but the
DNA methylation level had dropped.
Key words: Fragaria pentapylla； Cryopreservation； Vitrificationearly； Genetic Stability； Methylation
收稿日期： 2012－08－27 接受日期： 2012－12－13
基金项目： 国家自然科学基金（30900973）；河南省基础与前沿技术项目（0032010031）
作者简介： 朱文涛，在读硕士生，Tel: 15103784488，E-mail: zhuwentao2010@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 13849126494，E-mail: wzc@henu.edu.cn
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2013.01.015
果 树 学 报 30 卷
栽培种凤梨草莓（Fragaria ananassa Duch.）是一
种营养价值与经济价值较高的园艺作物， 目前被视
为一种经济植物而被广泛栽培[1]。由于野生草莓具有
广泛的适应性和多种优良特性，例如：风味品质、抗
病、抗虫和抗不良环境胁迫等，通常作为栽培种草莓
改良的重要材料[1-3]。 五叶草莓（Fragaria pentapylla），
也叫泡儿，秧泡儿，原产我国，是我国丰富的野生草
莓资源的一种[4]，它具有抗寒、抗病性强、果实香味浓
等特点， 是进行栽培种培育和改良的理想亲本。 同
时，五叶草莓属于二倍体草莓，染色体数目少[5]，基因
组小得多， 使其成为蔷薇科植物基因功能研究中有
应用潜力的良好材料。 五叶草莓以及野生草莓都是
宝贵的野生资源， 然而目前没有一种有效的手段使
其种质资源得到长期保存。
上世纪 70—80 年代建立起的超低温保存技术
对种质资源保存具有重要的意义[6-7]。 超低温保存技
术是将植物材料保存在-80 ℃及其以下， 使细胞内
的物质代谢与生长活动近乎停止，处于“生机停顿”
（suspended animation）状态，从而实现植物材料的长
期保存。 目前，进行超低温保存的方法有多种[6-7]，主
要是玻璃化法、包埋干燥法、包埋玻璃化法、小滴玻
璃化法等。 然而，植物在超低温保存过程中，会涉及
到一系列的胁迫[8]，这些胁迫有可能对其遗传的稳定
性产生一定的影响。近年来，许多学者就超低温保存
后再生材料的遗传稳定性问题做了大量的研究和分
析，主要集中在：（1）超低温保存材料的基因组遗传
稳定性研究；（2）超低温保存再生材料的表观遗传信
息变异情况分析等方面[8]。 在基因组稳定性方面，许
多学者运用了 AFLP [9]、RAPD 等多种技术对材料的
基因组进行了分析，袋鼠花（Anigozanthos viridis）[10]、
苹果 [11]、拟南芥 [12]、椰子（Cocos nucifera L.） [13]等大部
分研究都证明了超低温之后基因组没有发生改变，
但是在冷杉[14]、木瓜[14-15]等少数研究中却发现其基因
组改变的现象。对超低温保存中的 DNA甲基化变化
的研究中 ，发现苹果 [10]、木瓜 [15]、蛇麻草 （Humulus
lupulus）[16]、拟南芥[17]、虎耳草科酷栗属 [18]等不同基因
型的植物材料经过超低温保存后甲基化水平均发生
了不同程度的变化。 我们采用玻璃化法对五叶草莓
进行了超低温保存， 运用 AFLP 技术对超低温保存
前后五叶草莓材料的基因组信息进行分析， 以确定
五叶草莓材料超低温保存后基因组遗传稳定性是否
良好， 同时运用 MSAP技术对超低温前后的五叶草
莓的 DNA甲基化水平进行分析，探讨五叶草莓超低
温前后的甲基化水平变化以及变化趋势， 以期为完
善超低温保存后五叶草莓的研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
以河南大学植物种质资源及遗传实验室提供的
五叶草莓 （F. pentapylla） 幼苗为实验材料，五叶草
莓采自秦岭地区。
1.2实验方法
1.2.1 组织培养体系的建立 自田间选取五叶草莓
健壮的匍匐茎，取 1.5～3.0 cm 长的顶芽，采用常规方
法进行清洗和消毒，选用 MS+6-BA 1.0 mg·L-1 +IBA
0.1 mg·L-1作为五叶草莓诱导培养基，MS+6-BA 0.5
mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1作为继代培养基， 培养出大
量的五叶草莓组培苗。
1.2.2 超低温保存过程 采用的超低温方法为玻璃
化法[17，19]，该方法在前人的基础上加以改良，其具体
的操作流程为：首先，将继代培养 25 d 的试管苗置
于 4 ℃冰箱低温锻炼，并设置时间梯度为 0、1、2、3、
4、5 周，记录植株生长情况；其次，取低温锻炼后的
试管苗，在无菌条件下切取茎尖约 5 mm，将其置于
预培养培养基 （MS +0.4 mol·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂，
pH=5.8）中 4 ℃预培养，培养时间为 0、1、2、3、4 d；然
后， 将茎尖转入加有液体预处理培养基的无菌冷冻
管中 20 ℃预处理，每管 15 个茎尖，预处理时间 0、
10、20、30、40 min；然后用无菌胶头滴管吸出预处理
液，加入玻璃化溶液 PVS2（MS+30%（w/v）甘油+15%
（w/v）乙二醇+15%（w/v）DMSO+0.4 mol·L-1）0 ℃处理
0、20、40、60、100 min；接下来，将冷冻管放入纱布袋
并迅速投入液氮中保存 1、7、14 d；最后，将材料快
速取出，42 ℃水浴化冻处理 2~3 min，在超净工作台
下吸去冷冻保护液， 用含有 1.0 mol·L-1蔗糖的 MS
洗涤液将茎尖洗涤 3次，每次 10 min，并接种到恢复
培养基上进行培养（培养条件：温度 （24±1）℃，光照
12 h·d-1），21~25 d统计数量并计算成活率。
试验重复 3次，求平均成活率。 计算公式为：
成活率（%）=（玻璃化超低温保存后成活的茎尖
数/保存的总茎尖数）×100
1.2.3 五叶草莓超低温保存前后 AFLP 分析 采用
改良的 CTAB 法 [20]提取五叶草莓总 DNA， -20 ℃保
存备用。 AFLP 分子标记技术的实验程序主要参照
Turner 等[10]和郝玉金等 [11]的 AFLP 程序，引物设计如
表 1。 AFLP 分子标记技术主要包括以下几个过程：
选用限制性内切酶 EcoRI/MseI 对目的基因组 DNA
进行双酶切、连接、预扩增、选择性扩增、变性聚丙烯
56
1 期














    
表 1 接头和引物序列
Table 1 Sequences of adapters and primers
朱文涛等: 五叶草莓超低温保存及遗传稳定性分析
酰胺凝胶电泳、银染检测。
1.2.4 超低温前后五叶草莓 DNA 甲基化变化
MSAP 分析 利用 MSAP 技术分析基因组的 DNA
甲基化变化，此方法主要参照 Cervera 等[21]与何艳霞
等[17]的方法，引物设计如表 1。 该方法在 AFLP 的基
础上用对甲基化敏感的 MspⅠ和 HapⅡ代替 AFLP
分子标记中的高频酶 MseⅠ，然后用 EcoRⅠ/HpaⅡ
和 EcoRⅠ/MspⅠ的组合对目的 DNA 进行酶切，酶
切产物随后进行连接、预扩增、选择性扩增、电泳及
银染， 其操作过程和程序与上述 AFLP 分析的操作
一致。
2 结果与分析
2.1 超低温保存结果与分析
2.1.1 低温锻炼对超低温保存后茎尖成活率的影响
对五叶草莓低温锻炼时间不同， 其超低温保存后
成活率也会受到不同程度的影响， 低温锻炼能明显
影响保存后茎尖存活率。 如图 1所示锻炼 21 d时存
活率为最高值 51.9%，随着锻炼时间的延长，成活率
出现下降趋势。 在低温锻炼期间观察发现经过 28 d
后试管苗叶片逐渐变成黄褐色， 保存后再生材料存
活率也有所下降。
2.1.2 固体预培养对超低温保存成活率的影响 用
固体预培养培养基对五叶草处理的时间不同， 则超
低温保存后成活率的影响也不同。 固体预培养能明
显影响保存后茎尖存活率， 如图 2所示固体预培养
时间为 3 d 时存活率为 61.5%。 低温锻炼 3 周的苗
在只改变固体预培养时间的条件下， 其他条件限定
在液体处理时间 20 min，pvs2处理时间 60 min，超低
温处理时间 1 d，固体预培养为 3 d。
引物和接头 Adapters and primers 序列 Sequences
接头 adapters
MseI-adapterI
MseI-adapterII
EcoRI-adapterI
EcoRI-adapterII
HpaⅡ- MspI-adapterI
HpaⅡ- MspI-adapterII
预扩引物 Preselective primers
E-A
M-C
HpaⅡ-MspI
选扩引物 Selective primers
EcoR-AAC
EcoR-AAG
EcoR-ACA
EcoR-ACT
EcoR-AGG
EcoR-ACC
Mse-CAA
Mse-CAC
Mse-CAG
Mse-CAT
Mse-CCA
HpaⅡ-MspI-TCCA
HpaⅡ-MspI-TCAA
5-GACGATGAGTCCTGAG-3
5-TACTCAGGACTCAT-3
5-CTCGTAGACTGCGTACC-3
5-AATTGGTACGCAGTC-3
5-GATCATGAGTCCTGCT-3
5-TCATGATCCTGCTCG-3
5-GACTGCGTACCAATTCA-3
5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3
5-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3
5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3
5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3
5-GACTGCGTACCAATTCACA-3
5-GACTGCGTACCAATTCACT-3
5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3
5-GACTGCGTACCAATTCACC-3
5-GACTGCGTACCAATTCACG-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3
5-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3
5-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCCA-3
5-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCAA-3














   
图 2 固体预培养对超低温保存成活率的影响
Fig. 2 The effect of pre-culture periods on survival rate of
the cryopreserved
图 1 低温锻炼对超低温保存成活率的影响
Fig. 1 The effect of cold acclimation periods on survival rate
of the cryopreserved
低温锻炼时间 Cold acclimation periods/d
固体预培养时间 Pre-culture periods/d
存
活
率
Su
rv
iv
al
ra
te
/%
存
活
率
Su
rv
iv
al
ra
te
/%
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果 树 学 报 30 卷
图 5 野生草莓超低温前后基因组的 AFLP 扩增结果
M1 泳道为对照 AFLP 的带型，M2 泳道为处理后的 AFLP 带型
Fig. 5 Profiles of AFLP in F. pentapylla between control and
cryopreservation treatment
Lane M1 is AFLP patterns of control， while Lane M2 is AFLP patterns
of treatment.
图 4 PVS2 处理 对超低温保存成活率的影响
Fig. 4 The effect of PVS2 treatment periods on survival
rate of the cryopreserved




















PVS2 装载时间 PVS2 treatment periods/min
图 3 液体预处理对超低温保存成活率的影响
Fig. 3 The effect of pretreatment periods on survival rate
of the cryopreserved



















液体预处理时间 Pretreatment periods/min
2.1.3 液体处理培养基对超低温保存成活率的影响
对五叶草莓液体进行不同时间的处理， 则其超低
温保存后成活率影响也不同， 液体处理时间能明显
影响保存后茎尖存活率。 液体预处理随着时间的增
加，成活率表现为先增加后减小的趋势，在处理 30
min时成活率最高，达到 79.7%（图 3）。
2.1.4 PVS2 处理对超低温保存成活率的影响 超
低温玻璃化过程是对保存起着至关重要的作用，冰
冻保护剂 PVS2 处理使茎尖内组织进一步脱水则是
玻璃化过程中极为关键的一步。 结果表明 （图 4）
PVS2处理 60 min时的茎尖成活率为 79.7%，达到最
高，时间过短或更长都不利于茎尖的成活和再生。这
很可能是由于时间过短导致的玻璃化不完全， 从而
在冻存过程中植物茎尖受到损伤。 当处理时间高于
60 min 时，由于 PVS2 本身对材料有毒害作用，进而
导致茎尖存活率下降。
2.2 超低温前后的 AFLP分析结果
应用 AFLP 技术对超低温保存前后的五叶草莓
材料进行检测分析，14 对引物共扩增出可统计条带
526 条，部分条带如图 5 所示，在超低温保存前后的
五叶草莓材料之间没有出现多态性位点。 说明对照
与超低温处理样品之间基因组序列保持一致， 没有
发生该方法可以检测到的遗传变异。
2.3 超低温前后的MSAP分析
HpaⅡ和 MspⅠ是一组均识别并切割 5’CCGG
3’ 序列的同裂酶，HpaⅡ对胞嘧啶的甲基化极其敏
感，它不能切割任何一个或两个均甲基化的序列，能
够识别切割单链发生甲基化。 MspⅠ对内部胞嘧啶
的甲基化是不敏感的， 对外部胞嘧啶的甲基化则很
敏感。因此，超低温处理和对照五叶草莓材料提取的
DNA 经 HpaⅡ/EcoRⅠ（H）和 MspⅠ/EcoRⅠ（M）酶
切后的产物通常有 4种甲基化类型，但是，在聚丙烯
酰胺凝胶电泳分析胶上只能检测出 3种甲基化类型
（图 6）。其中，类型Ⅰ表明 CCGG位点没有发生甲基
M1 M2 M1 M2 M1 M2 M1 M2
750
bp
500
250
100
图 6 超低温处理与对照之间五叶草莓基因组的甲基化
敏感性扩增结果
H 为 HpaII / EcoRI 酶切，M 为 MspI / EcoRI 酶切 H1 和 M1 泳道为
对照材料 MSAP 带型，H2 和 M2 泳道为处理材料 MSAP 带型
Fig. 6 Profiles of MSAP in F. pentapylla between control and
cryopreservation treatment
H represent digestion with HpaII/EcoRI， M represent digestion with
Mspl/EcoRI. Lanes H1 and M1 are MSAP patterns of control， while Lanes
H2 and M2 are those of treatment
H1 M1 H2 M2 H1 M1 H2 M2
bp
500
250
100
存
活
率
Su
rv
iv
al
ra
te
/%
存
活
率
Su
rv
iv
al
ra
te
/%
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1 期
注: H 代表 HpaII/EcoRI；M 代表 Mspl/EcoRI 酶切； C 和 CC 表示甲基化的胞嘧啶；1. 有带；0. 无带.
Note: H represent digestion with HpaII/EcoRI；M represent digestion with Mspl/EcoRI； C and CC represent methylated.
表 3 超低温保存与对照的甲基化状态
Table 3 Patterns of DNA methylation in cryopreserva
表 2 超低温保存对五叶草莓基因组 DNA 甲基化水平的影响
Table 2 Effects of cryopreservation on the levels of genomic DNA methylation in F. pentapylla
注: 总扩增带数= I + II + III；总甲基化带数=II +III；完全甲基化比率=类型 III/总扩增带数；半甲基化比率=类型 II/总扩增带数；甲基化带比率=总
甲基化带数/总扩增带数。
Note: Tatol amplified bands=I+II+III； Tatol methylated bands=II+III；Fully methylated bands ratio=TypeIII/ Tatol amplified bands； Half methylated
bands ratio=TypeII/ Tatol amplified bands； Tatol methylated bands ratio=Tatol methylated bands/Tatol amplified bands.
对比
Comparison
未甲基化的 CCGG 位点
The CCGG loci of
non-methylated
半甲基化位点
Half methylated loci
完全甲基化位点
Fully methylated loci 总扩增带数
Tatol amplified
bands
总甲基化带数
Tatol methylated
bands
总甲基化比率
Tatol methylated
bands ratio/%类型Ⅰ
TypeⅠ
比率
Ratio%
类型Ⅱ
TypeⅡ
比率
Ratio%
类型Ⅲ
TypeⅢ
比率
Ratio%
CK
Controls
处理
Treatments
318
321
85.48
87.47
43
33
11.56
8.99
11
13
2.96
3.54
372
367
54
46
14.52
12.53
酶切
Digestion 甲基化状态变化 Changes of methylation status
对照与处理的差异
Diversity between the
controls and the treaments
带型
Band
pattemH M H M 处理前 Before treatment 处理后 After treatment
1
1
0
1
0
1
0
0
0
1
1
0
1
1
1
0
1
0
0
0
1
1
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
1
0
1
0
1
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGGCCGG
GGCCGGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
2
3
5
1
9
8
2
5
2
141
6
9
A1
A2
A3
A4
B1
B2
B3
B4
C
D1
D2
D3
朱文涛等: 五叶草莓超低温保存及遗传稳定性分析
化变化，类型Ⅱ表明 CCGG 位点发生了半甲基化，类
型 III 表明 CCGG 位点发生了全甲基化。 为了检测
五叶草莓经过超低温处理后 DNA 甲基化的模式，利
用不同的引物组合（表 1）对超低温处理样品及对照
组的基因组 DNA 进行 MSAP分析。 由表 2 可知，经
超低温处理后五叶草莓全基因组 DNA 胞嘧啶甲基
化水平降低，且全甲基化率高于半甲基化率。
本实验一共利用 12 种不同引物组合对五叶草
莓超低温保存前后的 DNA 双酶切产物进行选择性
扩增，并对扩增结果进行分析，发现扩增结果共出现
12 种带型（表 3），这些带型又分为多态性和单态性
2种。 多态性又有 3种状态即甲基化（A 型）、去甲基
化（B 型）以及不定类型（C 型），表明 CCGG 位点甲
基化状态在超低温处理之后发生不同的改变。 A 型
中的 A1 和 A2 为重新甲基化 （对照 H 和 M 泳道均
有条带， 而处理仅 H 或 M 泳道有条带），A3 和 A4
为超甲基化（对照仅 H 或 M 有一条带，而处理 H 和
M泳道均无带）。A 型表明超低温处理诱导五叶草莓
基因组 DNA 发生了甲基化水平增加的变化；B 型含
B1、B2、B3 和 B4，为去甲基化类型，甲基化状态与 A
型相反，表明超低温处理后基因组 DNA 发生了甲基
化水平下降的变化；C 型为不定类型，对照组与处理
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果 树 学 报 30 卷
表 4 超低温保存对五叶草莓基因组 DNA 甲基化状态的影响
Table 4 Effects of cryopreservation on the Patterns of genomic DNA methylation in F. pentapylla
对比
Comparison
甲基化带
Methylated
bands
总甲基化多态性带型
Tatol polymorphism bands
单态性带型
Monomorphism
bands
A 型
TypeA
比率
Ratio%
B 型
TypeB
比率
Ratio%
C 型
TypeC
比率
Ratio%
多态性带数
Polymorphism bands
比率
Ratio%
D 型
TypeD
比率
Ratio%
处理
Controls and treatments
193 11 5.70 24 12.43 2 1.04 37 19.17 156 80.83
注: 甲基化带数=A+B+C+D；多态性带数=A+B+C；多态性比率=A+B+C/甲基化带数；单态性比率=类型 D/甲基化带。
Note: Methylated bands= A+B+C+D； Polymorphism bands=A+B+C； Tatol polymorphism bands ratio=A+B+C/ Methylated Bands； Monomorphism
bands ratio=TypeD/Methylated Bands .
组中 DNA 甲基化程度的差异无法确定。单态性即对
照与处理之间有相同的带型 （D 型），表明低温处理
后 CCGG 位点的甲基化状态没发生变化。 其中，D1
型为未甲基化，D2 和 D3 为半甲基化。 处理与对照
的甲基化模式带型 A、B、C 和 D 及相应的位点数见
表 3。
由表 4 可知， 超低温处理的五叶草莓基因组
DNA 甲基化（A 型）位点数为 11，占总甲基化多态性
扩增位点数的 5.70%；去甲基化（B 型）位点数为 24，
占总甲基化多态性扩增位点数的 12.43%。与对照相
比， 超低温处理后的总甲基化多态性为 19.17%，甲
基化状态未发生变化（D 型）的比率为 80.83%。
由此推测， 经超低温处理后五叶草莓基因组
DNA 的甲基化与对照相比发生了变化，总甲基化比
率降低；在扩增的甲基化位点中，去甲基化的位点数
高于发生甲基化的位点数，同时基因组 DNA 甲基化
多态性也随之增加。
3 讨 论
研究首次利用玻璃化法对五叶草莓材料进行了
超低温保存试验，经研究发现：低温锻炼 3 周，能明
显提高五叶草莓茎尖超低温保存的存活率； 固体预
培养基中加入甘油对五叶草莓的成活率影响非常
大，去除甘油后五叶草莓的成活率明显提高，固体预
培养 3 d，能明显提高成活率；液体预处理时间为 30
min 时， 对五叶草莓的超低温保存最为有利； PVS2
处理是超低温保存过程中的关键步骤， 缺少或处理
时间不当对保存后茎尖成活率存在显著影响。 试验
中发现，PVS2处理时间并不是越长越好， 当处理时
间为 60 min 时存活率达到最高。 同时发现，液氮冻
存时间对超低温保存五叶草莓的存活率并无显著影
响，成活率并未产生太大变化，郝玉金等 [11]、李俊慧
等 [19]的研究相符，说明超低温保存技术可以作为五
叶草莓种质资源保存的可靠技术。
AFLP 技术是检测 DNA 多态性常用的技术，本
实验采用 14对引物共扩增出可统计条带 526 条带，
没有出现多态性位点， 说明对照与超低温处理样品
之间基因组序列保持一致，这与 Turner 等[10]、郝玉金
等 [11]的研究结果相似，说明玻璃化法超低温保存技
术可以作为五叶草莓种质资源保存的有效手段。
MSAP 技术是分析基因组甲基化多态性的一项
常规技术，本实验数据显示，超低温处理对五叶草莓
的甲基化有一定程度的影响，与对照相比，甲基化水
平发生了变化，DNA 甲基化位点数占总甲基化多态
性扩增位点数的 5.70%； 去甲基化位点数占总甲基
化多态性扩增位点数的 12.43%。结果表明玻璃化法
超低温保存成活的五叶草莓甲基化水平降低了
6.73%，这与木瓜 [15]、蛇麻草（Humuluslupulus） [16]、拟
南芥[17]等植物超低温保存后的甲基化变化趋势相类
似。 这种变化趋势可能是植物对超低温保存这种逆
境处理的一种遗传适应，其内在机制目前未明，需要
进一步的深入探讨。
4 结 论
玻璃化法超低温技术作为一种有效的植物种质
资源超低温保存方法， 可以用于五叶草莓种质资源
的保存， 这样不仅使其保存后的成活率达到了一个
比较高的水平， 且超低保存前后五叶草莓基因组
DNA 多态性并无发生变化。 但是研究表明超低保存
前后的五叶草莓基因组 DNA 甲基化水平发生了一
定的变化， 因此我们需要深入研究甲基化水平的变
化对五叶草莓在生理生化方面带来的影响。
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