全 文 ：第 41卷　第 5期 河 南 农 业 大 学 学 报 Vo .l 41　No. 5
2007年　　 10月 Journa l ofHenanA gricu lturalUnivers ity Oc.t 　 2007
收稿日期:2007 - 04 - 26
作者简介:张成婉(1982 -),男 , 江苏淮安人 ,硕士研究生 ,主要从事欧李种质保存研究;通讯作者:王子成.
文章编号:1000 - 2340(2007)05 -0516 - 03
欧李茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生
张成婉 ,王子成 ,何艳霞
(河南大学农业生物技术研究所 ,河南 开封 475001)
摘要:对欧李(Cerasus hum ilis)茎尖进行了玻璃化法超低温保存及植株再生研究 , 结果表明 , 预培养对欧李茎尖
超低温保存有一定的影响 ,茎尖在含有 0. 5 m g L -1 BA和 2M甘油的 B 5培养基上室温(25 ℃)下预培养 3 d
成活率最高;最佳预处理时间为 60% PVS2处理 10 ～ 20 m in, 玻璃化液(PVS2)处理时间为 0℃下 60 m in. 在优化
的保存条件下 , 植株再生率达 83. 9%,再生植株生长和分化正常.这是欧李超低温保存成功的首例报道.
关键词:欧李;超低温保存;玻璃化法
中图分类号:S 662. 3　　　　文献标识码:A
Cryopreservation of in Vitro Cerasus hum ilis Shoot-Tips by
V itrification Techn ique and ItsRegeneration
ZHANG Cheng-wan, WANG Zi-cheng, HE Yan-x ia
(Institute of Agricu ltural B io technology, Henan University, K aifeng 475001, China)
Abstract:A procedu re on cryopreservation o f shoot-tips ofCerasus hum ilis by vitrification w as studied.
The resu lt show s that pre-cu lture had effect on the regenera tion after cryopreserva tion. The highest re-
generation ra te w as gained by pre-cultu ring on the B 5 medium supplemented w ith 0. 5 mg L- 1 BA
and 2M G lycero l fo r 3 day s. The best pre-treatment w as that the shoo t-tips we re loaded in a so lu tion
containing 60% PVS2 for 10 ～ 20m in at room temperature, and the vitrifica tion treatmentw as that the
shoo t-tips we re incuba ted in PVS2 for 60 m in a t 0 ℃ prio r to a direct plunge in to liquid nitrogen
(LN). By the optim iza tion p rocedure, the surviva l rate of shoot-tips w as up to 83. 9% after 6 w eeks
and they g rew and differentiated no rmally. Th is is the first successfu l report of cryopreserva tion o f in
vitro Cerasus hum ilis.
Key words:Cerasus hum ilis;cryopreservation;v itrification
　　欧李为蔷薇科桃李属樱桃亚属植物 ,系中国所
特有的矮小灌木果树 ,其果实含钙高 ,且口感好 ,已
成为时尚的保健水果.但目前优质欧李品种的保存
仅采用一般的离体保存方法 ,由于一般的离体保存
需要不断的继代 ,易导致遗传变异的发生 ,而超低
温保存技术具有不用继代 ,可保持遗传稳定等优
点 ,被认为是目前唯一的长期保存植物种质的方
法.建立欧李的超低温保存体系 ,对于欧李种质的
长期保存具有重要的意义. 玻璃化法 (vitrification)
超低温保存具有设备简单 、易操作 、保存后再生率
高和重演性好等优点而倍受青睐 ,国内外已有很多
的成功报道 ,如柑桔 ,杏 ,魔芋等 [ 1 ～ 8] . 本试验采用
玻璃化法对欧李茎尖的超低温保存技术进行了探
讨 ,以期为栽培欧李遗传资源长期保存提供技术
支持.
1　材料与方法
1. 1　材料
试验材料全部取自栽种于开封地区的农大钙
果 4号.于 5月份从长势良好的新生枝上剪取长约
5 ～ 6 cm的茎段 (约含 2 ～ 3个芽 ),置于 75%的酒
DOI牶牨牥牣牨牰牬牬牭牤j牣cnki牣牨牥牥牥牠牪牫牬牥牣牪牥牥牱牣牥牭牣牥牨牱
第 5期 张成婉等:欧李茎尖玻璃化法超低温保存及植株再生 517　
精 30 s后 ,用 0. 1% HgC l2灭菌 5m in,无菌水冲洗
5 ～ 6次 ,在含 0. 6mg L -1 BA的 B 5初代培养基上
进行初代培养 , 15 ～ 20 d后使用附加 0. 5 mg L -1
BA的 B 5继代培养基上进行继代培养.
1. 2　方法
1. 2. 1　超低温保存方法　采用玻璃化法进行超低
温保存.取继代 30 d左右的欧李试管苗 ,截取 2 ～ 3
cm长的带顶芽的茎段 ,置于预培养基 (继代培养
基中附加 2M甘油)中进行预培养 1 ～ 7 d,然后剥
取 1. 5 ～ 2. 0 mm长的绿色茎尖置于 1. 8 mL的冷
冻管中 ,加入预处理液 (40% 0. 15 mo l L - 1蔗糖
液体培养基 +60% PVS2(植物玻璃化溶液 2)溶
液 [ 9] )在室温 25 ℃下进行处理 ,然后吸出预处理
液加入 PVS2(甘油 300 g L- 1 +乙二醇 150 g
L
- 1 +DMSO 150 g L -1 ,以含 0. 4mo l L -1蔗糖
的 B 5液体培养基配制 )并置于 0 ℃冰水浴中处
理 ,然后迅速投入到液氮中进行保存 [ 1] . 以上每个
步骤重复 3次 ,每次处理 2管 , 每管 10个芽.
1. 2. 2　化冻 、洗涤与再生　保存至少 24 h后 ,从
液氮中迅速取出冷冻管 ,在 40 ℃水浴中迅速化冻 ,
除去保护液 ,用洗涤液 (含 1. 2mo l L -1蔗糖的MS
培养基 )洗涤 4次 ,每次 10 m in.取出茎尖 ,用无菌
滤纸吸去残留在其表面上的洗涤液 ,接种到继代培
养基上 ,暗培养 3 d后转移到正常的光下进行培
养. 3周后统计再生率 (%) =(保存后恢复绿色
的芽数 /总芽数)×100%.
2　结果与分析
2. 1　预培养时间对超低温保存前茎尖的存活率的
影响
随着预培养时间的延长 ,用于超低温保存的茎
尖部分表现出枯黄 , 从而降低了材料的使用率.其
原因可能是由于随着预培养时间的延长 ,甘油渗透
到植物细胞内 ,对细胞正常的生理代谢产生了不利
的影响 ,从而使茎尖发生枯黄. 把枯黄的茎段直接
接种到附加 0. 5mg L -1 BA的 B 5培养基上进行
培养 ,这些茎段不能存活.因而不能用于超低温保
存.图 1表明 ,枯黄茎尖的发生率随时间延长 ,有不
断增加的趋势 ,到 7 d后 ,茎尖存活率已低于 50%.
2. 2　预培养时间对超低温保存后茎尖再生率的
影响
在选用预培养后仍存活的材料进行试验 ,结果
表明 ,未进行预培养的对照组材料超低温保存后再
生率仅为 23. 5%,而在经过 1 d的预培养后 ,超低
温保存后再生率可提高到 55. 7%,在预培养第 3 d
时 ,材料的再生率达到最高为 83. 9%. 从第 4 ～ 7 d
材料的超低温保存后的再生率没有明显的差异
(图 2).其原因可能由于茎尖预培养基中进行预培
养时甘油进入茎尖细胞内同时吸收细胞内水分 ,这
样增加细胞内的渗透压同时降低冰点 ,从而起到保
护作用提高存活率. 综合考虑 ,预培养时间应以 3 d
为好 , 这与前人在柑桔上的预培养时间有相似
之处 [ 1] .
图 1　预培养时间对超低温保存前茎尖的存活率的影响
F ig. 1　Effec t of d ifferen t tim e of pre-cu lture on the
surv iva l rate of shoot-tip s before cryopre servation
图 2　预培养时间对超低温保存后茎尖再生率的影响
Fig. 2　Effect of pre-cu lture tim e on the regenera tion
rate of cryopre served shoot-t ips
2. 3　预处理时间对超低温保存后茎尖成活率的
影响
图 3结果表明 ,预培养 3 d后的茎段 , 剥取茎
尖后放在 60% PVS2中处理 10m in, 然后在 0℃用
PVS2处理 60 m in,时再生率高达 83. 9%;处理 40
m in时 , 再生率降为 77. 5%,而处理 50 m in,再生
率下降为 50. 8%. 因此 ,欧李茎尖以在 60% PVS2
溶液中处理 10m in效果比较好.
518　 河　南　农　业　大　学　学　报 第 41卷
图 3　60% PVS2预处理对超低温保存后茎尖再生率的影响
F ig. 3　Effec t of d ifferen t pre trea tm ent tim e w ith 60%
PVS2 on regenerat ion rate
2. 4　PVS2处理时间对超低温保存结果的影响
把预培养 3 d,经 60% PVS2预处理 20 m in后
的茎尖 ,再于 0℃下用 PVS2处理 ,使组织进一步脱
水 , 这是超低温保存最关键的步骤之一.图 4结果
表明 , 未经处理的 , 再生率仅为 13. 5%;处理 60
m in的再生率达最高 , 达到 83. 9%;随着处理时间
延长 , 一部分冰冻保护剂渗透到材料内 , DMSO等
对材料造成伤害 ,再生率又迅速下降 , 80 m in时为
53. 5%(图 4).用 PVS2处理使茎尖内组织进一步
脱水 , 一些易形成玻璃化状态的分子 (DMSO , EG ,
G ly)很快进入到茎尖组织 , 一旦快速冷冻 , 茎尖
组织可以迅速形成玻璃化状态 ,避免冰晶的形成 ,
从而提高保存后的成活率和再生率.
图 4　PVS2处理时间对再生率的影响
Fig. 4　E ffect of d ifferent trea tm en t tim e w ith
PVS
2
on regenerat ion rate
2. 5　超低温保存后材料的形态发生与植株再生
解冻后 , 将茎尖接种到继代培养基上 ,开始 ,
茎尖保持绿色 (图 5 - B),但 3 ～ 4 d茎尖绿色褪
去 , 7 ～ 10 d后成活的茎尖绿色开始恢复. 所有的
成活茎尖都不经过愈伤组织阶段 ,而是直接生长并
长成无根苗 (图 5 -C).经过保存后再生的芽苗在
形态上与对照没有明显差异 (图 5 -D)且生长速
度也差异不大(图 5 -A).
A. 欧李初代培养产生的芽;B. 解冻后的欧李茎尖;C. 恢复生长
3周后的欧李茎尖;D. 恢复生长 6周后的欧李茎尖产生的丛生芽
A. Th e germ ination of th e buds of Cerasu s hum ilis du ring the p rim ary
cu lture;B. The shoot-tips after th aw ed;C. Th ree w eek s recovery
shoot-tips;D. S ix w eek s recovery shoot-tips.
图 5　欧李超低温保存后植株再生过程
F ig. 5　The p lan t regeneration process ofCerasus
hum ilis after cryopreservation
3　小结
综合以上结果 ,我们成功地对欧李茎尖进行了
超低温保存 ,比较适宜的保存程序为:2 ～ 3 cm长
的茎段 , 在含有 2M预培养培养基上预培养 3 d ,
然后剥取 1. 5 ～ 2. 0 mm 长的茎尖 , 先在室温下用
60% PVS2溶液预处理 10 m in , 再在 0 ℃用 PVS2
处理 60 m in , 迅速投入到液氮中. 保存 24 h后 ,
在 40℃水浴中化冻 , 洗涤 4 ～ 5次后接种到继代
培养基上 ,再生率为 83. 9%.
欧李在经过玻璃化法超低温保存后 ,茎尖全部
都可以直接成苗 ,没有形成愈伤组织. 从形态上来
说 ,与没有经过超低温保存的没有明显的差异.而
在超低温过程中对于材料产生的伤害则有必要从
细胞的超微结构上对其进行探讨. 同时 ,材料在经
过超低温保存的一系列的程序后 ,材料的遗传物质
是否发生了变异及在哪个步骤中发生了变异也是
需要进一步研究的问题.另外 ,研究发现包埋干燥
法超低温保存后的苹果茎尖再生过程不用生根培
养基即可直接生根 [ 10] ,即超低温保存能够促进材
料的再生 ,但在本研究中未发现这种现象 ,这可能
是由于基因型不同造成的 ,也可能是由于超低温保
(下转第 521页 )
第 5期 韩海彪等:臭氧处理对灵武长枣品质的影响 521　
去商品价值 ,硬果率和商品果率可直接反映灵武长
枣贮藏效果.由表 1可知 ,臭氧处理贮藏 90 d时 ,
处理 4的硬果率为 50%,好果率为 95. 3%,明显好
于其他处理.
表 1　贮藏 90 d灵武长枣商品果率和硬果率
Tab le 1　The percen t age of accepted and hard fru it of
L ingwu long ju jube after 90 days storage %
指标
Ind ex
处理 Treatm en t
1 2 3 4 5 6
硬果率
Percen t age of accepted fru it
8. 5 43. 2 20 50 36. 6 10. 3
商品果率
Percen t age of hard f ru it
75. 2 88. 2 86. 6 95. 3 87. 8 76. 4
3　小结
质量浓度为 100 μg L - 1的臭氧处理能延缓
灵武长枣可滴定酸的消耗 ,减缓还原糖含量的下降
速率 ,贮藏 90 d时的硬果率与商品果率均最高质
量;浓度为 50, 100 μg L -1的臭氧处理均能使 VC
含量维持在较高的水平. 因此 ,对灵武长枣的臭氧
处理以 100 μg L -1为佳.
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(责任编辑:蒋媛媛 )
(上接 518页 )
存方法不同 ,这还也需要做进一步的研究.
应该指出的是 ,由于试验所取材料全部取自欧
李的一个栽培品系 ,所建立起的超低温保存技术在
其它基因型欧李上是否能够成功应用 ,还需要进一
步研究.
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(责任编辑:丁　丽 )