全 文 ：中国农学通报 2013,29(30):159-165
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：国家自然科学基金“表观遗传调控菊花花期及其机制解析”(31171982)。
第一作者简介：李忠爱，女，1976年出生，试验师，博士研究生，主要从事植物表观遗传学方面研究。通信地址：475004河南省开封市金明大道河南
大学生命科学学院，E-mail：lizhongai@henu.edu.cn。
通讯作者：王子成，男，1974年出生，河南邓州人，副教授，硕士生导师，博士，主要从事植物生物技术与表观遗传学的研究。通信地址：475004河南省
开封市金明大道河南大学生命科学学院，E-mail：wzc@henu.edu.cn。
收稿日期：2012-11-28，修回日期：2013-01-22。
NaCl胁迫对留兰香基因组DNA及其甲基化的影响
李忠爱，郭强梨，王子成
（河南大学生命科学学院植物种质资源与遗传工程试验室，河南开封 475004）
摘 要：研究了NaCl处理对留兰香生长发育和生理生化反应的影响，以及对基因组DNA及其甲基化的
影响。将留兰香组培苗接种于添加了NaCl的MS培养基上（NaCl浓度分别为0，50、100、150 mmol/L），
用混合取样法，取同一生长时期植株嫩叶，提取植物基因组DNA，用AFLP，MSAP的方法进行相关的分
析。结果表明，NaCl处理20天后，随着盐浓度的升高，叶绿素的含量逐渐降低，MDA和脯氨酸含量逐渐
增大。AFLP分析表明，处理组与对照组之间未发现特异片段，基因组序列未发生变异。MSAP分析表
明，50 mmol/L NaCl处理会引起全基因组DNA的甲基化水平降低，而100、150 mmol/L NaCl则诱导了全
基因组DNA的甲基化水平升高；与对照相比，50、100、150 mmol/L NaCl处理后DNA甲基化和去甲基化
比率分别为4.35%、9.93%、12.46%和12.73%、13.12%、20.54%。NaCl可影响留兰香的生长发育，引起各
项生理生化指标的改变。NaCl虽然不造成留兰香基因序列的变异，但是可以引起其基因组DNA甲基
化水平的改变。低浓度的NaCl引起基因组DNA甲基化水平降低，高浓度的NaCl可引起基因组DNA
甲基化水平升高。
关键词：留兰香；DNA甲基化；NaCl；AFLP；MSAP
中图分类号：Q945.78 文献标志码：A 论文编号：2012-3871
The Effects of Genomic DNA and DNA Methylation of Menthae spicatae L. with Salt Stress
Li Zhong’ai, Guo Qiangli, Wang Zicheng
(College of Life Science, Henan University, Institute of Agricultural Biotechnology, Kaifeng Henan 475004)
Abstract: The influence of salinity on spearmint growth and physiological and biochemical reactions, and the
effects on genomic DNA and DNA methylation. Spearmint seedlings were grown on MS medium supplied with
NaCl (0, 50, 100 and 150 mmol/L, respectively) for 20 days. Genomic DNA was extracted from leaves. The
amplified fragment length polymorphisms (AFLP) and methylation sensitive amplification polymorphism
(MSAP) was used to study the genetic and epigenetic stability. The chlorophyll content was significantly
reduced, whereas the MDA and Pro content increased as the concentration of salt increased when the Menthae
spicatae L. seedlings were treated by NaCl for 20 days. AFLP technique did not detect any sequence variation;
this meant that there was no difference in the genomic DNA polymorphism existed. The level of DNA
methylation was reduced with concentrations of 50 mmol/L NaCl treatment and increased with concentrations
of 100 and 150 mmol/L NaCl treatment; the ratio of methylation and demethylation of genomic DNA of the
seedlings treated with 50, 100, and 150 mmol/L NaCl was 4.35% , 9.93% , 12.46% and 12.73% , 13.12% ,
20.54% , respectively. The growth and physiological and biochemical reactions of Menthae spicatae L. had
changed with NaCl treatment. Salt could not impact the genomic DNA sequence; however, it could result in the
variation of DNA methylation.
Key words: Menthae spicatae L.; DNA methylation; NaCl; AFLP; MSAP
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0 引言
留兰香(Menthae spicatae L.)，又名绿薄荷，对环境
条件的适应性较强，喜欢温暖湿润和阳光充足的环境，
在中国的江苏、贵州和四川等地比较常见。留兰香在
医药行业、食品工业、日用化工及农业生态保护等领
域具有十分广泛的使用价值[1]。
DNA甲基化 (DNA methylation)是一种重要的
DNA修饰途径，其主要形式是 5胞嘧啶甲基化。
DNA甲基化对基因的表达有重要的调控作用，其水
平的高低会直接对植物表型的变化产生影响 [2]。一
些表观方面的变异，可稳定地遗传[3-5]，植物的花期和
株高 [6]、植物对疾病的抗性 [7]和作物的产量 [8]等性状
也可能受到DNA甲基化多态性的影响，在育种原料
的选择方面有重要的作用。
扩增片段长度多态性(amplified fragment length
polymorphism，AFLP)是基于 PCR技术扩增基因组
DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切
割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序
列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限
制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一
种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，
具有RFLP技术的可靠性和 PCR技术的高效性。由
于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，
而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过
引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为
一种分子标记。AFLP近年来广泛的应用于分析同
一种或属间的不同品种的差异性及亲缘关系。
甲基化敏感扩增多态性 (methylation sensitive
amplification polymorphism，MSAP)是在AFLP技术
的基础上建立起来的，用对甲基化敏感的MspⅠ和
HapⅡ代替AFLP分子标记中的高频酶MseⅠ，可用来
分析基因组DNA的甲基化变化。
Shasany等[9]用AFLP的方法分析了薄荷属的各物
种之间的亲缘关系。但是薄荷属的MSAP分析还没有
人做过。近年来，许多研究表明植物在逆境条件下，基
因组DNA会发生甲基化改变[10]。盐碱胁迫对人类的
生活和生产造成了很大的威胁，特别是制约了农业
生产，因此如何使植物产生一定的抗盐碱能力是人
类迫切需要解决的问题之一。近年来，科研人员在
植物的耐盐碱胁迫方面做出了很大的努力，并取得
了一定的成果 [11-12]。其中，盐胁迫通过改变植物
DNA甲基化，使植物对盐碱土地产生一定的适应
性，是近年来的一个热点。
本研究以留兰香为材料，对其试管苗的茎段进行
盐胁迫，观察其生长发育并采用AFLP、MSAP检测处
理前后材料的基因组DNA变异情况及基因组DNA甲
基化水平变化情况，为从分子方面探讨NaCl对植物表
观遗传的影响提供新的试验依据。
1 材料和方法
1.1 材料
以河南大学植物种质资源与遗传工程试验室提供
的留兰香幼苗为试验材料，选用继代培养基MS+
0.2 mg/L 6-BA + 0.02 mg/L NAA进行增殖培养，pH
5.8，培养温度(25±2)℃，光照时间 12 h/d。光照强度
30 μmol/(m2·s)，相对湿度70%。
1.2 方法
1.2.1 NaCl胁迫的处理方法 无菌条件下，将留兰香
茎段接种到 0、50、100、150 mmol/L的NaCl处理培养
基上，连续处理20天。
1.2.2 生长及生理生化指标的测定方法 用直尺进行茎
段长度的测量，结果取平均值。叶绿素含量的测定采
用乙醇法[13]；丙二醛(MDA)的测定采用硫代巴比妥酸
法[13]；脯氨酸(Pro)的测定采用酸性茚三酮法[13]。
1.2.3 留兰香基因组DNA的提取方法 采用CTAB法
提取DNA，参考Micheli等[14]的方法。
1.2.4 AFLP分析 AFLP分析参照Hao等[15]的方法，略
作改动：①选用 DNA双酶切体系：20 μL体系含
200 ng DNA、3 U EcoRⅠ和 3 U MseⅠ，37℃酶切 3 h，
然后 65℃保温 2.5 h；②连接：EcoRⅠ接头，MseⅠ接
头，T4连接酶，25℃连接 2.5 h；③预扩：引物为 E-A、
M-C；④选扩；⑤选扩产物94℃变性5 min后上样于6%
PAGE，恒功率55 W电泳2.5 h，固定、银染漂洗与显色
后拍照并分析结果。
1.2.5 MSAP分析 MSAP分析参照Cervera等[16]和李雪
林等[17]的方法，并略作改动。与上述AFLP方法类似，
其中内切酶组合为EcoRⅠ/HapⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ。
接头为EcoRⅠ接头和H-M接头，预扩引物为E-A和
HapII-MspⅠ。
2 结果与分析
2.1 NaCl胁迫对留兰香生长发育的影响
2.1.1 NaCl胁迫对留兰香形态特征的影响 盐处理 20
天后，随着浓度的增大，留兰香生长状况逐渐变差（图
1），150 mmol/L的处理组中已有植株死亡现象。由此
可知，随着盐浓度的增加，留兰香的盐胁迫程度逐渐增
大。
2.1.2 NaCl胁迫对留兰香茎段生长的影响 不同浓度
的NaCl对留兰香茎段生长的影响见图 2。盐浓度越
高，留兰香茎段生长受抑制的程度越严重。特别是
·· 160
李忠爱等：NaCl胁迫对留兰香基因组DNA及其甲基化的影响
150 mmol/L处理组的茎段，至处理结束，茎段基本没
有生长，且有些茎段出现干枯现象，甚至是死亡。由此
推测，高浓度的Na+对细胞有毒害作用，进而导致植株
的死亡。
2.2 NaCl胁迫对留兰香生理指标的影响
2.2.1 NaCl胁迫对留兰香叶绿素含量的影响 叶绿素
是绿色植物进行光合作用的主要色素，逆境胁迫会导
致植物叶片中叶绿素的破坏与降解，进而降低植物的
光合作用效率，使植物长势减缓、生物量降低[18-19]。图
3表明，处理组叶片的叶绿素含量均低于对照，说明
NaCl胁迫影响了叶绿素的合成。
2.2.2 NaCl胁迫对留兰香丙二醛(MDA)含量的影响
在逆境胁迫下，生物膜中的不饱和脂肪酸与自由基发
生过氧化反应，该反应的终产物之一是MDA，它能反
映膜脂过氧化反应的程度，因此MDA的含量反映了
植物遭受胁迫的程度[20]。图 4显示，随着盐浓度的升
高，MDA的含量呈上升趋势，说明膜脂过氧化的程度
增加。
2.2.3 NaCl胁迫对留兰香脯氨酸(Pro)含量的影响 细
胞中Pro的增加对植物适应高盐造成的渗透胁迫有重
要意义[21-22]。图5显示，脯氨酸的含量随着盐浓度的升
高而增加，说明盐胁迫刺激了脯氨酸的合成。
2.3 NaCl胁迫下留兰香基因组的AFLP分析
提取处理组和对照组叶片的DNA进行AFLP检
测。利用AFLP分析的 8对引物共扩增出 544条可统
计的条带。如图 6所示，这些条带中未出现多态性位
点，说明处理组与对照组之间的基因组序列保持一致，
图1 NaCl胁迫对留兰香形态特征的影响
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0 100 150 200NaCl浓度/(mmol/L)
茎
段
长
度
/cm
图2 NaCl胁迫对留兰香茎段生长的影响
0
1
2
3
4
5
6
0 50 100 150NaCl浓度/(mmol/L)
叶
绿
素
含
量
/(g/
g)
叶绿素a
叶绿素b
叶绿素c
图3 NaCl胁迫对留兰香叶绿素含量的影响
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 50 100 150
NaCl浓度/(mmol/L)
丙
二
醛
含
量
/mo
l
图4 NaCl胁迫对留兰香MDA含量的影响
·· 161
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盐胁迫未诱导本方法可以检测到的遗传变异。
2.4 NaCl胁迫下留兰香基因组的MSAP分析
2.4.1 NaCl胁迫引起的DNA甲基化水平的变化 处理
组和对照组的 DNA经 HpaⅡ/EcoRⅠ (H)和MspⅠ/
EcoRⅠ(M)酶切后的产物有4种类型，但是，在聚丙烯
酰胺凝胶电泳分析胶上只能检测出 3种类型 [17]。其
中，类型Ⅰ表明CCGG位点没有发生甲基化变化（如
图 7中 a所示），类型Ⅱ表明CCGG位点发生了半甲基
化（如图 7中 b所示），类型Ⅲ表明CCGG位点发生了
全甲基化（如图7中c所示）。
本试验利用 16对引物组合，共扩增出 1456条带，
带型分布如表 1所示。低浓度(50 mmol/L)的NaCl能
导致留兰香基因组DNA胞嘧啶甲基化水平的降低，而
高浓度的 NaCl则会引起该水平的升高。另外，在
50 mmol/L盐胁迫下，留兰香全基因组CCGG发生半
甲基化和全甲基化的比率基本相等，在100 mmol/L盐
胁迫下，以双链半甲基化为主，而在 150 mmol/L盐胁
迫下，则以双链全甲基化为主。
2.4.2 NaCl胁迫引起的DNA甲基化状态的变化 用16
对引物组合进行选择性扩增，带型分布如表 2所示。
表 3表明，与对照相比，50、100、150 mmol/L处理组的
留兰香全基因组DNA甲基化（A型）位点数分别为 14
(4.35%)、28(9.93%)和 37(12.46%)；DNA去甲基化（B
型）位点数分别为 41(2.73% )、37(13.12% )和 61
(20.54%)。另外，50、100、150 mmol/L处理组的留兰香
全基因组DNA总甲基化多态性比率分别为 17.08%、
23.05%和33.00%，甲基化模式未发生变化（D型）比率
0
5
10
15
20
25
0 100 150 200NaCl浓度/(mmol/L)
脯
氨
酸
含
量
/(g/
mL)
图5 NaCl胁迫对留兰香Pro含量的影响
0 mmol/L50 mmol/L 100 mmol/L 150 mmol/L
图6 部分NaCl胁迫下基因组AFLP
电泳谱带（截取的部分电泳图）
OH 50H 100HOM 50M 100M 150H150M
H表示用EcoR I/Hap II双酶切形成的谱带，
M表示用EcoR I/Msp I双酶切形成的谱带
图7 部分NaCl胁迫下基因组MSAP
电泳谱带（截取的部分电泳图）
NaCl浓度
CK
50 mmol/L
100 mmol/L
150 mmol/L
类型 I
条带数
304
336
290
316
比率/%
87.61
91.80
79.89
83.16
类型 II
条带数
28
15
63
20
比率/%
8.07
4.10
17.36
5.26
类型 III
条带数
15
15
10
44
比率/%
4.32
4.10
2.75
11.58
总扩增条
带数 a
347
366
363
380
总甲基化条
带数 b
43
30
73
64
甲基化条带
比率/%
12.39
8.20
20.11
16.84
表1 不同浓度NaCl处理对留兰香基因组DNA甲基化水平的影响
注：a总扩增条带数=I+II+III；b总甲基化条带数=II+III；甲基化条带比率=总甲基化条带数/总扩增条带数。
·· 162
李忠爱等：NaCl胁迫对留兰香基因组DNA及其甲基化的影响
分别为82.92%、76.95%和67.00%。由此可知，NaCl胁
迫后，留兰香全基因组DNA的甲基化水平升高；在扩
增的甲基化位点中，NaCl胁迫诱导的去甲基化位点数
高于发生甲基化的位点数（图 8）。同时，留兰香基因
组DNA甲基化的多态性也随之增加，表明留兰香全基
因组DNA的甲基化和去甲基化之比会随着NaCl浓度
酶切 a
H
0
0
0
1
1
1
0
1
0
1
1
0
M
0
0
1
0
1
1
1
0
1
1
0
1
H
0
1
1
1
1
0
0
0
1
1
1
0
M
1
1
1
1
0
1
0
0
0
1
0
1
甲基化状态变化
处理前
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC CCGG
CCGG
GGCC
处理后
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CCGG
GGCC
差异数量
CK-50
8
8
24
1
0
2
4
8
0
264
3
0
CK-100
25
5
4
3
2
14
4
8
0
194
2
21
CK-150
8
26
24
3
16
8
4
9
0
196
2
1
带型 b
B3
B4
B1
B2
A2
A1
A3
A4
C
D1
D2
D3
表2 处理组与对照组的甲基化状态
注：aH和M分别代表HpaII/EcoRI和Mspl/EcoRI酶切；C和CC表示甲基化的胞嘧啶；b1：有带，0：无带。CK-50、CK-100、CK-150分别表示处理组
对照组相比，甲基化位点的差异变化。
NaCl
浓度
CK-50
CK-100
CK-150
甲基化
带 a
322
282
297
多态性带型
A型
条带数
14
28
37
比率/%
4.35
9.93
12.46
B型
条带数
41
37
61
比率/%
12.73
13.12
20.54
C型
条带数
0
0
0
比率/%
0
0
0
总带数 b
55
65
98
比率/%
17.08
23.05
33.00
单态性带型
D型
267
217
199
比率/%
82.92
76.95
67.00
表3 NaCl处理对留兰香基因组DNA甲基化状态的影响
注：a甲基化带数=A+B+C+D；b多态性带数=A+B+C；多态性比率=类型A+B+C/总甲基化带数；单态性比率=类型D/总甲基化带数。CK-50、
CK-100、CK-150分别表示处理组与对照组相比，甲基化位点的差异变化。
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的增加而升高。
3 结论与讨论
研究表明，植物的抗胁迫能力与DNA的甲基化有
着密切的关系[23]。用盐处理玉米后，共有25个DNA甲
基化位点在其根和叶中发生了变异，这些位点跟众多
基因的表达密切相关[24]。用盐处理耐盐小麦品种和盐
敏感小麦品种后，前者甲基化的程度明显高于后者[25]。
在本试验设置的4个浓度中，随着NaCl浓度的升
高，留兰香茎段生长逐渐减慢，叶绿素的含量逐渐降
低，MDA和脯氨酸的含量逐渐增大，其变化趋势与前
人的研究结果一致[26-28]。这些结果表明，盐胁迫对留兰
香造成了伤害，影响了留兰香的正常生理生化反应。
AFLP分析表明，处理组和对照组之间并未发现
特异条带，说明留兰香材料在DNA序列上没有发生改
变，这与前人的研究结果相一致 [29-31]。MSAP分析表
明，50 mmol/L NaCl处理会引起留兰香全基因组DNA
的甲基化水平降低，而 100、150 mmol/L NaCl则诱导
了留兰香全基因组DNA的甲基化水平升高。另外，随
着盐浓度的升高，留兰香全基因组甲基化和去甲基化
的比率均呈上升趋势，甲基化多态性也随之增加，但是
同一浓度下，去甲基化比率要比甲基化比率高，这与棉
花上的研究结果相一致[17]，与重金属胁迫下苜蓿上的
研究结果也一致[32]。这说明甲基化减少可能是植物适
应逆境胁迫的一种普遍机制，其内在的信号通路及机
制还需要进一步的深入研究。
这是首次对薄荷类植物进行逆境条件下表观遗传
分析。留兰香是一种常用的药用植物，也是一种工业
香精原料。其表观遗传的改变，会不会引起其药效或
香味的变化？下一步可对药用和香料的主要成份进行
分析。本试验不足之处在于只对第一代进行了研究，
以后可以对子代进行进一步的研究。另外，以后的研
究中，还可以回收特异条带，进行功能分析，并与基因
差异表达情况进行联合分析。
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0
5
10
15
20
25
50 100 150NaCl浓度/(mmol/L)
比
率
/%
甲基化
去甲基化
图8 NaCl胁迫引起的留兰香基因组DNA
甲基化和去甲基化的变化趋势
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李忠爱等：NaCl胁迫对留兰香基因组DNA及其甲基化的影响
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