全 文 ：第 32 卷 第 1 期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol． 32 No． 1
2012 年 2 月 JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITY Feb． 2012
收稿日期:2011 － 08 － 26
基金项目:国家林业局行业公益专项(201204311)资助;国家自然科学基金项目(31070543)资助;江苏省高校自然科学基金重点项目
(10KJA180018)资助。
第 1 作者:戴晓港(1984—) ，男，博士生。研究方向:林木遗传育种。E-mail:daixiaogang1@ yahoo. com. cn。
通信作者:李淑娴(1968—) ，女，硕士，副教授。研究方向:种子生理、植物品种分子鉴定。E-mail:shuxianli@ njfu. com. cn。
doi:10． 3969 / j． issn． 2095 － 1914． 2012． 01． 004
杞柳 AFLP反应体系的建立与引物筛选
戴晓港1 渠纪腾1 冯 凯1 张新叶2 李淑娴1
(1．南京林业大学森林遗传与生物技术省部共建重点实验室，江苏 南京 210037;2．湖北林业科学研究院，湖北 武汉 430079)
摘要:以杞柳 F1 群体为试验材料，采用改良的 CTAB法提取基因组 DNA，经过酶切、连接、预扩增和
选择性扩增，建立杞柳 AFLP的反应体系，筛选 EcoRI 和 MseI 各 16 条选择性扩增引物组成 256 对
引物组合。结果表明:320 ng基因组 DNA采用 5U EcoRI和MseI双酶切 6 h，20 ℃连接 12 h，连接产
物稀释 10 倍进行预扩增，预扩增产物稀释 15 倍进行选择性扩增，选择性扩增产物采用 ABI － 3130
检测，可获得条带清晰的指纹图;从 256 对引物组合中共筛选出 98 对多态性较高的引物组合。
关键词:杞柳;AFLP;引物筛选
中图分类号:S792. 12 文献标志码:A 文章编号:2095 － 1914(2012)01 － 0017 － 04
Establishment of AFLP Reaction System for
Salix integra and Primer Selection
DAI Xiao-gang1，QU Ji-teng1，FENG Kai1，ZHANG Xin-ye2，LI Shu-xian1
(1． Key Lab of Forest Genetics and Biotechnology，Nanjing Forestry University，Nanjing Jiangsu 210037，China;
2． Hubei Forestry Academy，Wuhan Hubei 430079，China)
Abstract:Taking Salix integra F1 progeny as experimental material，the genomic DNA was extracted from the
leaves by modified CTAB extraction method． Subsequently，the optimized AFLP experimental protocol was estab-
lished through enzyme incision，conjunction，pre-amplification and selective amplification． 256 pairs of primer
combinations were composed with 16 EcoRI and 16 MseI selective amplification primers respectively． The results
showed that clear and repeatable gel profiles could be obtained under the reaction protocol as:320 ng genomic DNA
was digested at 37℃ for 6 hours by 5U of EcoRI and 5U MseI，then conjugated at 20℃ for 12 hours，the ligation
products were 10 times diluted，and used as the template for pre-amplification． After pre-amplification，the prod-
ucts were diluted for 15 times，then used as templates for selective amplification． The selective amplification prod-
ucts were detected by ABI － 3130 electrophoresis and the clear and repeatable gel profiles were obtained． 98 pairs
of primer combinations that yielded high polymorphic bands were selected from the 256 pairs of AFLP primer combi-
nations for AFLP analysis of S． integra．
Key words:Salix integra;AFLP;primer selection
扩增片段长度多态性(amplified fragment length
polymorphism，AFLP)技术是由 Vos 等［1］发展起来
的一种分子标记技术。该技术结合了 RFLP 和
RAPD技术的优点，不需要预先知道被研究物种基
因组 DNA序列信息［2］，而且具有稳定性好、DNA 用
量少、灵敏度高、谱带清晰等特点，现已被广泛应用
于物种多样性研究、物种进化分析［3］、品种鉴定［4］、
遗传图谱构建［5］、基因定位及分子标记辅助育种［6］
等多个方面。
杞柳(Salix integra Thunb．)为杨柳科柳属多年
生落叶灌木，主要分布于北半球的温带地区，在我
国主要分布于东三省，河北及山东省［7］。其发达的
根系主要集中在 30 cm 以内的土层中，是一种优良
的水土保持、防风固沙树种。杞柳枝条柔软、韧性
强，也是编织工艺品的主要材料。杞柳生长速度
快、产量高、耐干旱贫瘠、适应性强，是作为潜在的
可再生能源而被广泛应用［8］。木本植物模式树种
杨树的生殖周期较长，一般为 7 ～ 8 a，而杞柳 1 ～ 2 a
就可以开花［8］，因此，可以开发杞柳作为木本植物
研究的模式树种。目前，国内外针对柳树的研究主
要有遗传图谱构建［5］、与生长有关的数量性状位点
的定位［9］和抗性育种［10 － 11］等方面。本研究拟建立
杞柳 AFLP分析技术体系，为解决目前柳树在遗传
多样性、物理图谱构建、基因定位以及性别鉴定等
方面的问题打下基础。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
以杞柳亲本和 F1 杂交群体为试验材料，亲本于
2009 年 12 月采自江苏省新沂市，F1 代为 2010 年 3
月杂交得到的群体，共 700 株，现种植在南京林业大
学树木园。
1. 2 DNA提取及检测
基因组 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法［12］。
取 2 个亲本及 F1 代所有个体 3 ～ 5 片幼嫩叶片于 2
mL的冻存管中，加入 400 μL DNA提取液、10 μL 10
mg /mL的 RNase 和直径 0. 4 mm 的不锈钢钢珠 2
颗，将冻存管用封口膜密封，用磨样器 30 Hz 震荡 3
min。在 65 ℃的干式加热器中保温 15 min，然后加
入 400 μL 2% SDS 溶液，混匀后在 65 ℃下保温 15
min，在此期间轻轻晃动离心管数次。取出后加入
130 μL 5 mol /L 醋酸钾，混匀后放置冰上冷却 30
min。之后加入 800 μL氯仿∶异戊醇(24∶1) ，混匀后
在转速为 12 000 r /min下离心 10 min。取上清液至
2 mL新离心管中，加入等体积预冷的异丙醇 1 mL，
缓慢摇匀，在 － 20 ℃下沉淀 30 min。再在转速为
12 000 r /min下离心 10 min 沉淀 DNA，去上清液用
500 μL 70%乙醇洗涤 2 次，500 μL 无水乙醇洗涤 1
次，离心去上清液。最后在室内自然干燥后用 300
μL 1 × TE溶解。
取 5 μL DNA加入 3 μL 溴酚蓝，于 1%的琼脂
糖凝胶中水平电泳 30 min，电压 80 V。取 2 μL DNA
用 ND － 2000 测定浓度，根据 A260 /280的比值判断
DNA纯度。对符合要求的 DNA样品用 1 × TE 稀释
到 40 ng /μL，在 － 20 ℃下保存备用。
1. 3 酶切及连接
采用双酶切，内切酶 EcoRI和MseI购自 NEB公
司。酶切体系为 20 μL，内切酶 EcoRI 和 MseI 各 5
U，37 ℃酶切 6 h后 65 ℃保温 20 min使酶失活。
T4 连接酶购自 NEB 公司，连接反应体系为
20 μL。接头序列参照 Vos［1］ 的方法，5 μmol /L
EcoRI接头 1 μL，50 μmol /L MseI接头 1 μL，T4 连接
酶 10 U，10 × T4 连接酶缓冲液 2 μL，酶切的 DNA 10
μL，双蒸水 4. 75 μL。在 PCR仪上 20 ℃连接过夜。
1. 4 预扩增及产物检测
将连接产物用双蒸水稀释 10 倍用于预扩增。
预扩增引物序列参照 Vos［1］的方法，EcoRI引物不加
选择性碱基，而 MseI引物加一个选择性碱基 C。预
扩增采用 25 μL反应体系:3 μL 稀释后的酶切连接
产物，2. 5 μL 10 × Ex Taq Buffer，0. 2μL 5 U /μL 的
Ex Taq 酶，1. 2 μL 25 mmol /L Mg2 +，0. 5 μL 10
mmol /L dNTP，0. 2 μL 10 μmol /L EcoRI 引 物，
1. 2 μL 10 μmol /L MseI引物，0. 25 μL 10 mg /mL 的
BSA，双蒸水 16. 35 μL。预扩增的程序为:94 ℃
2 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，20 个循环;
72 ℃ 延伸 20 min;4 ℃ 保温。反应结束后取 5 μL
预扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 5 选择性扩增及产物检测
将预扩增产物用双蒸水稀释 15 倍用于选择性
扩增。选择性扩增采用 15 μL 反应体系:3 μL 稀释
后的预扩增产物，0. 3 μL 去离子甲酰胺，1. 5 μL
10 × Ex Taq Buffer，0. 2 μL 5 U /μL的 Ex Taq酶，1. 2
μL 25 mmol /L Mg2 +，0. 3 μL 10 mmol /L dNTP，0. 3
μL 10 μmol /L EcoRI 引物，1 μL 10 μmol /L MseI 引
物，0. 15 μL 10 mg /mL 的 BSA，双蒸水 7. 05 μL。
MseI引物用 FAM 或 HEX 荧光标记。扩增程序为:
94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，13 个
循环，每个循环结束后退火温度降低 0. 7℃;94 ℃
30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，23 个循环;72 ℃ 延伸
20 min;4 ℃ 保温。反应结束后取 1 μL 扩增产物加
入到 9 μL的 Loading Buffer(90%去离子甲酰胺、9%
内标 500ROX)中，94 ℃变性 5 min，迅速取出放冰
上冷却，然后用 ABI － 3130 检测。
1. 6 多态性引物的筛选
用 16 条 EcoRI 和 16 条 MseI 选择性扩增引物
81 西 南 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
组成 256 对引物组合，对 2 个亲本及随机挑选 6 个
子代的 DNA 进行选择性扩增，扩增产物用 ABI －
3130 检测。
2 结果与分析
2. 1 基因组 DNA质量
由于 AFLP技术体系对 DNA 的质量要求较高，
为了获得高质量的杞柳基因组 DNA，采用了改良的
CTAB法。纯化后 DNA成无色透明状，加入 300 μL
1 × TE溶解后用微量核酸蛋白检测仪测定其浓度及
纯度，95% 以上 DNA 的 OD260 /OD280 比值均为
1. 75 ～1. 85;取 3 μL DNA经 1%琼脂糖凝胶电泳检
测，结果显示，所提取的 DNA纯度较高且没有降解，
无 RNA污染，胶孔无蛋白质、多糖等杂质残留，达到
了 AFLP分析的要求(图 1)。
2. 2 酶切及连接
采用限制性内切酶 EcoRI 和 MseI 对基因组
DNA进行双酶切，酶切产物用 1%的琼脂糖凝胶电
泳检测，结果如图 2。经过 6 h 酶切后，DNA 片段主
要在 200 ～ 1 200 bp，且呈弥散状，说明基因组 DNA
酶切较完全。由于酶切时间过长会降低内切酶
EcoRI和 MseI 的特异性，因此确定最佳酶切时间为
6 h。
2. 3 预扩增
预扩增是为选择性扩增提供大量的模板，同时
通过 PCR对模板起到选择性纯化的作用，以使选择
性扩增能产生清晰、稳定、易重复的条带。同时预
扩增在试验过程中起着上下衔接的作用，如果连接
不成功，则预扩增检测不到产物。本试验采用 1%
琼脂糖凝胶电泳检测预扩增反应的结果，图 3 显示
预扩增产物大小为 200 ～ 1 200 bp，并呈均一的弥散
状，说明 DNA 连接、预扩增成功，可进行下一步
试验。
2. 4 选择性扩增及多态性引物筛选
将预扩增产物稀释 15 倍进行选择性扩增，扩增
产物用 ABI － 3130 检测。虽然选择性扩增对模板
的浓度不敏感，但是模板 DNA 浓度过大，电泳条带
粗，影响分辨率;而稀释倍数太高，条带信号太弱，
且条带较少。图 4 是预扩增产物稀释 15 倍经引物
组合 M － ccg，E － ac选择性扩增的结果。
为了获取更多可利用引物的组合，本试验采用
了 2 个亲本及随机挑选 F1 代 6 个个体的 DNA，对
256 个引物组合进行多态性筛选，最后共获得了 98
对多态性高的引物组合，各引物组合多态性条带数
目见表 1。
3 讨 论
高质量的 DNA 是 AFLP 成功的关键，使用 DNA
试剂盒虽然能得到高质量的 DNA，但是价格昂
贵［1］。DNA 质量主要受酚类、多糖、单宁等物质的
影响，这些物质的存在不仅影响酶切效果，还会影
响 PCR反应中 Taq 酶的活性。酚类、多糖、单宁等
物质在植物不同组织及生长时期的含量不同，一般
幼嫩组织中这些物质含量较少，因此可采用杞柳新
91第 1 期 戴晓港等:杞柳 AFLP反应体系的建立与引物筛选
萌发出来的幼嫩叶片进行 DNA 的提取。本试验采
用了改良的 CTAB法提取 DNA，且在提取液中直接
加入了 RNase，减少了一步氯仿与异戊醇的抽提过
程，结果同样能得到高质量的 DNA。
表 1 256 对引物组合筛选结果
引物 E － ac E － ag E － at E － aa E － cc E － ca E － ct E － ga E － gc E － gg E － gt E － ta E － tc E － tg E － tt
M － cgt 7 5 11 9 7 12 13 6 10
M － ctt 5 6
M － cca 7 7 9 6
M － cac 10 7 6 7 11 9 8 6
M － cat 7 8 7
M － ctg 10 5 6 20 7 9
M － cct 6 6 6 6 7 8 7 18 7
M － cag 8 7 5 5 5
M － ctc 10 7 8 9 5 7 8 5 9 6
M － cga 5 9 5 6 9 6 5 5 6
M － cta
M － ccg 7 8 10 5 5 5 5 7 7 9
M － cgc 8 11 8 5 5 5 9 6
M － cgg 7 7 9 6 6
M － ccc 7 6 5 5 11 10 10 10
M － caa
AFLP的准确性主要取决于 DNA酶切的彻底性
和接头连接的充分性，当 DNA酶切不完全时反映的
并不是真实的多态性［13］，酶切时间过长会产生
“星”活性而降低酶切特异性［14］，因此，要掌握好酶
切时间。作者采用 EcoRI 和 MseI 各 5 U，37 ℃酶切
320 ng的基因组 DNA 6 h则得到较好的结果。
用于扩增的产物用量会直接影响扩增的严谨度
和效率，虽然 AFLP 对模板的浓度不太敏感［1］，但是
模板浓度过高会产生非特异性扩增，稀释倍数过大，
会使谱带减少，因此合适的模板浓度尤其重要［13］。
本研究将连接产物稀释 10 倍用于预扩增，预扩增产
物稀释 15倍用于选择性扩增，再经 ABI －3130 检测，
所得到的电泳条带清晰，分辨率也比较高。
引物选择性碱基的数目对 AFLP谱带有很大影
响，选择碱基的数目一般不超过 3 个，当引物具有 1
个或 2 个选择碱基时，引物的特异选择性较好。当
选择性碱基超过 3 个后，随着引物选择碱基的增加，
引物与模板的错配频率也相应增加，扩增特异性下
降［1］。另外，选择性碱基的多少还与基因组的大小
有关，对于复杂基因组植物，选择性碱基增加到 4 个
时则能得到条带清晰、分辨率高的图谱［15］。杞柳基
因组大小和杨树相当，约为(485 ± 10)Mb［16］，用
AFLP 技术绘制杞柳物理图谱时可以采用 E +
2 /M +2的引物组合。
随着分子生物学研究的发展，PCR 已成为一门
相当成熟的常规技术，而 Taq 酶的合理选择是 PCR
成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种 Taq
酶，能够满足多方面的试验需要。国产普通 Taq 酶
的价格较低，一般为 0. 1 ～ 0. 2 元 /U，作者起初采用
了这种 Taq酶，所得到的图谱条带模糊，且 1 000 bp
以下的条带较弱，因此需要采用较高质量的 Taq酶。
［参 考 文 献］
［1］ Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al． AFLP:a new tech-
nique for DNA fingerprinting［J］． Nucleic Acids Re-
search，1995，23(21) :4407 － 4414．
［2］ Mueller U G，Wolfenbarger L L． AFLP genotyping and
fingerprinting［J］． Trends in Ecology ＆ Evolution:Per-
sonal Edition，1999，14(10) :389 － 394．
［3］ Berlin S，Lagercrantz U，von Arnold S，et al． High-den-
sity linkage mapping and evolution of paralogs and or-
thologs in Salix and Populus［J］． BMC Genomics，2010，
11:129．
［4］ 姜岳忠，董玉峰，马玲，等． 山东省主栽杨树品种的
AFLP分析与鉴定［J］． 山东农业大学学报:自然科学
版，2010，41(1) :17 － 22．
［5］ Ronnberg-Wastljung A C，Tsarouhas V，Semerikov V，et
al． A genetic linkage map of a tetraploid Salix vzmznalzs
× S． dasyclados hybrid based on AFLP markers［J］． For-
est Genetics，2003，10(3) :185 － 194．
(下转第 24 页)
02 西 南 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
据王翔等［9］试验研究，用 24. 0% 乙氧氟草醚
EC 20 mL /667 m2 对红叶石楠(Photinia serrulata)容
器苗移栽(育苗)后进行杂草喷施除治是比较适宜
的;因此，用 24. 0%乙氧氟草醚 EC除治红花檵木容
器苗的杂草，在红花檵木容器苗移栽(育苗)前对基
质土喷药的药效是否好于移栽(育苗)后以及每 667
m2 喷施 24%乙氧氟草醚 EC 多少剂量能达到药效
最佳［10 － 11］，还有待于进一步比较试验研究。
［参 考 文 献］
［1］ 桑贤强．彩色苗木红花檵木的培育［J］．特种经济动植
物，2010，13(9) :28．
［2］ 王枝荣．中国农田杂草原色图谱［M］．北京:中国农业
出版社，1990:296 － 344．
［3］ 陈树文，苏少范．农田杂草识别与防除新技术［M］．北
京:中国农业出版社，2007:2 － 8．
［4］ 刘乾开，朱国念． 新编农药施用手册［M］． 上海:上海
科学技术出版社，1999:412 － 413．
［5］ 季卫东，徐炳林，周良义，等． 24%乙氧氟草醚 EC 防除
水稻移栽田杂草效果［J］． 安徽农业科学，2006，34
(12) :2768，2796．
［6］ 郭良芝，郭青云，辛存岳，等． 10． 8%高效氟吡甲禾灵
EC防除春油菜田野燕麦试验研究［J］． 现代农药，
2007，31(1) :51 － 52，56．
［7］ 楼曼庆，王国荣，应金耀，等． 几种除草剂土壤处理对
红花檵木的安全性和除草效果试验［J］． 浙江农业科
学，2005(2) :64 － 65．
［8］ 蒋柏生，李洁荣，蒋巧媛．园林苗圃除草试验［J］．林业
科技开发，2008，22(5) :104 － 106．
［9］ 王翔，周新生． 4 种药剂除治红叶石楠容器苗杂草药效
试验［J］．中国林副特产，2010(5) :33 － 35．
［10］ 中国杂草化学防除大全编委会． 农田杂草化学防除
大全［M］． 上海:上海科学技术文献出版社，
1992:750．
［11］ 苏少泉．除草剂作用靶标与新品种创制［M］． 北京:
化学工业出版社，2001:241 － 242．
(责任编辑 张 坤)
(上接第 20 页)
［6］ Hanley S，Pei M，Powers S，et al． Genetic mapping of
rust resistance loci in biomass willow［J］． Tree Genetics
＆ Genomes，2011，7(3) :597 － 608．
［7］ 王站，方振富． 中国植物志:第二十卷·第二分册
［M］．北京:科学出版社，1984．
［8］ Gullberg U． Towards making willows pilot species for cop-
picing production［J］． The Forestry Chronicle，1993，69
(6) :721 － 726．
［9］ Tsarouhas V，Gullberg U，Lagercrantz U． An AFLP and
RFLP linkage map and quantitative trait locus (QTL)a-
nalysis of growth traits in Salix［J］． Theoretical and Ap-
plied Genetics，2002，105(2 /3) :277 － 288．
［10］ Tsarouhas V，Gullberg U，Lagercrantz U． Mapping of
quantitative trait loci (QTLs)affecting autumn freezing
resistance and phenology in Salix［J］． Theoretical and
Applied Genetics，2004，108(7) :1335 － 1342．
［11］ Rnnberg-Wstljung A C，Glynn C，Weih M． QTL ana-
lyses of drought tolerance and growth for a Salix dasycla-
dos × Salix viminalis hybrid in contrasting water regimes
［J］． Theoretical and Applied Genetics，2005，110
(3) :537 － 549．
［12］ Doyle J J，Domle J L． A rapid DNA isolation method for
small quantities of fresh tissues［J］． Phytochemistry
Bull，1987，19:11 － 15．
［13］ 尹佟明，黄敏仁． AFLP分子标记及其在植物育种上的
应用［J］．生物工程进展，1997，17(1) :6 － 12．
［14］ 陈璇，胡尊红，郭鸿彦，等． 大麻基因组 DNA 提取及
AFLP体系的建立［J］． 分子植物育种，2010，8(3) :
619 － 625．
［15］ Li S X，Chen Z Y，Shen Y B，et al． A study on AFLP
fingerprinting for seeds identification in Pinus spp．［J］．
Journal of Nanjing Forestry University:Natural Sciences
Edition，2003，27(3) :1 － 6．
［16］ Tuskan G A，Difazio S，Jansson S，et al． The genome of
black cottonwood，Populus trichocarpa (Torr． Gray)
［J］． Science，2006，313(5793) :1596 － 1604．
(责任编辑 张 坤)
42 西 南 林 业 大 学 学 报 第 32 卷