全 文 : 第36卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版) Vol.36 No.3
2015年5月 Journal of Jishou University(Natural Science Edition) May 2015
文章编号:1007-2985(2015)03-0090-04
峨嵋双蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用
*
周罗琴,田宏现
(吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首416000)
摘 要:研究峨嵋双蝴蝶植物水提物的抗五步蛇毒作用.建立小鼠五步蛇毒中毒模型,观察小鼠的中毒表现,并统计小
鼠的死亡率,比较小鼠组织出血、组织坏死及组织溃疡状况.结果发现,峨嵋双蝴蝶植物水提物给药组动物的死亡率较模型
组的明显下降,局部和全身症状较轻,而且随着剂量的增加症状显著减轻,尤其是对于组织的保护作用比较明显.峨嵋双蝴
蝶植物水提物具有抗五步蛇毒作用,能降低蛇毒毒性.
关键词:双蝴蝶提取液;五步蛇;抗毒性;保护率
中图分类号:R996.3 文献标志码:B DOI:10.3969/j.cnki.jdxb.2015.03.019
五步蛇又称尖吻蝮、蕲蛇等,是中国重要10大毒蛇之一.五步蛇个体大,毒液多,其蛇毒中含有纤溶
酶、凝血酶样酶、蛋白水解酶、出血因子等20余种蛋白质,会导致伤后发病急剧,变化迅速,对血液及循环
系统破坏尤为明显,属于循环毒,易造成广泛出血、溶血和组织坏死,如不及时救治,容易造成伤肢致残,甚
至危及生命[1-4].现在治疗五步蛇毒的药相继问世,除常规抗五步蛇毒血清和季德胜蛇药外,还有蛇伤1号
合剂[5]、青龙蛇药[6]、A草蛇药片[7]等以中草药为主的单方及验方.传统中药治疗蛇伤历史悠久,积累了丰
富的经验,对提高人体的抗蛇毒能力、泄毒排毒、消除中毒症状、减少组织损伤具有独到的功效.常用治疗
蛇毒的中草药通常有清热解毒、通腑泄火、凉血止血等功能,具抗菌消炎、改善微循环等作用,如黄莲、半支
莲、丹皮、丹参、三七粉、地耳草、地胆头、岗梅根、半夏、天南星等[8-10].
笔者对峨嵋双蝴蝶(Tripterospemum cordatum)植物提取液对抗五步蛇毒的作用进行了研究.峨嵋双
蝴蝶,双蝴蝶属,别名肺形草、黄金钱,属于龙胆科多年生常绿缠绕草本.全球大约17种,中国有15种,其
中中国台湾分布2种,它们都具有相似的形态和利用价值,主要分布于湖南省、湖北省、重庆市、四川省、贵
州省、云南省等地区.中医书记载,峨嵋双蝴蝶性寒、味甘辛,具有润肺止血、清热利尿、解毒、消肿等功
能[11].有相关实验研究[12]表明,从Tripterospemum 中提取的Terahydoxy xanthone(THXS)对鼠科动物
的白血病毒的反转录具有强烈的抑制作用;也有台湾学者[13]实验证明,Tripterospemum Lanceolatum 中
的Norathyrial对循环系统和神经系统的炎症有明显的抑制功能;体外实验[14]也证明它有较好的抑菌活
性;还有文献[15]记载它作为治疗蛇伤的中草药.
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1仪器 KQ-500DB型数控超声波清洗器,购于昆山市超声仪器有限公司;RE52-99蒸发器,购于上海
* 收稿日期:2015-01-17
作者简介:周罗琴(1987—),女,湖南邵阳人,吉首大学生物资源与环境科学学院硕士研究生,主要
从事植物学研究
通信作者:田宏现(1953—),男,湖南保靖人,吉首大学生物资源与环境科学学院教授,博士,主要从
事微生物学和林业生物技术研究.
市亚荣生化仪器厂;SHB-III循环水式多用真空泵,购于郑州市长城科工贸有限公司;MDF-V2086S低温
冷冻干燥机,由军事医学科学院实验仪器厂研制,由北京市四环科学仪器厂提供.
1.1.2实验动物 清洁级BACB/C小白鼠数只,雌雄兼用,体重18~23g,由广州市中山大学实验室动物
中心提供;KM种小鼠,体重18~22g,购于中南大学湘雅医院实验动物中心.
1.1.3实验植物及药物 峨嵋双蝴蝶采集于湖南省怀化市中方县.取全草洗净,自然阴干;称干重536g浸
泡于6 500mL水中24h,通过低温(60℃)超声波抽提2h,过滤.滤渣加入1 250mL水第2次抽提,过滤
后再收集滤渣加入1 000mL水和800mL水重复抽提第3、第4次,第2到第4次抽提时间分别为1h.最
后共收集滤液6 500mL,合并滤液通过蒸发器浓缩至600mL.将得到的浓缩液用低温冷冻干燥机干燥,得
浸膏粉末113g,放置冰箱中保存备用(临用前加蒸馏水稀释至所需实验质量分数).
1.1.4蛇毒 纯化干粉,购于广州市养蛇场.
1.2实验方法
1.2.1峨嵋双蝴蝶水提物动物急性毒性实验 因预实验发现该药物毒性过低,LD50无法测出,故进行最大
耐受量实验.小鼠口服灌胃最大耐受量实验:选用18~22g健康KM 种小鼠40只,雌雄各半,随机抽取,
均匀分组,给药组与对照组各20只,分笼饲养2d,实验前16h禁食.给药组按一次性灌胃给药,所配制的
药液每毫升含峨嵋双蝴蝶水提物0.55g(最大溶解度),小鼠灌胃容积为0.04mL/g(最大容积),小鼠给药
量为峨嵋双蝴蝶水提物22.0mg/g,合生药为7 9.3mg/g.对照组给等量的生理盐水0.04mL/g,观察7
d.结果给药组与对照组均未见异常,12h内健在,72h后处死解剖尸体验心、肺、肝、脾、肾等脏器,肉眼未
见异常.结论:小鼠灌胃给药峨嵋双蝴蝶水提浸膏粉的最大耐受量(MTD)为22.0mg/g,合生药为7
9.3mg/g,相当于人临床用量的165倍.
1.2.2五步蛇毒致死剂量和时间的确定 为了节省实验动物,用序贯法(上下法)计算LD50,缺点是动
物必须逐个进行实验,下一只动物用药剂量又决定于上一只动物的反应情况,实验时间较长,而它适合急
性致死药物的动物实验.选用10只18~22g健康小白鼠,雌雄各半,随机抽取.分别配制好4种不同质量
分数的五步蛇毒生理盐水注射液,通过预试验确定剂量分组,在本实验中即为2.5,2,1.5,1μg/g这4种.
实验先从较大剂量开始,第1只动物用五步蛇毒生理盐水注射后,如果发生死亡,在表中以“+”记录,下一
只动物就降低一级剂量注射;相反,如果动物存活,在表中以“-”记录,下一只动物就用高一级的剂量;依
此类推.最后1只动物虽未进行实验,但在表格内仍占位置,以“×”符号表示.本方法所用动物总数∑n
也应事先定好,一般∑n=10即可获得满意的结果.实验结果如表1所示,其中:D为蛇毒致死剂量实验
组;S(safe)为存活数;F(fatal)为死亡数;n(number)为剂量组的动物数;X=log D,即剂量的对数.
表1 五步蛇毒半数致死剂量(LD50)的实验
D/(μg·g
-1) X 实验结果 S F n nX
2.5 0.397 9 (+) 0 1 0 0
2 0.301 0 + + + + 0 4 4 1.204
1.5 0.176 0 - + - - × 3 1 5 0.88
1 0 - 1 0 1 0
设C=∑∑
n
i
(nX),则C=2.084.根据LD50=log-1(C/∑n),得LD50=log-1(2.084/10)=1.6.即
五步蛇毒皮下注射对小白鼠的半数致死量LD50为1.6μg/g.
根据致死剂量实验结果,选择健康的BACB/C小白鼠数只,体重为18~22g,雌雄各半,随机抽取分
组.按1.6μg/g蛇毒质量分数加3mL的生理盐水(0.32g/L)配成注射液注射小鼠(0.1mL/只).实验结
果表明,注射蛇毒后能使动物致死时间控制在6h左右,符合本实验时间规定要求(3~8h),因此确定为本
实验的注射质量分数.
1.2.3小白鼠中毒模型建立 将BACB/C小白鼠随机分配为峨嵋双蝴蝶植物水提物低、中、高剂量组及空白
组、模型组(五步蛇毒中毒损伤组),各组小白鼠15只.峨嵋双蝴蝶植物水提物低、中、高剂量组给予峨眉双蝴
蝶植物水提浸膏(分别为成人用量的1.5,3,5倍),空白组和模型组给予相同剂量的生理盐水.以上各组动物
均在实验前禁水16h,各实验组按每只0.5mL的剂量灌胃,连续7d给药,每日给药1次.除空白组外,各组
小鼠均于末次给药后1h,于每只腹腔注射五步蛇毒100μg,建立小鼠五步蛇毒中毒模型.
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1.2.4小白鼠中毒表现观察 注射蛇毒后由实验人员轮流24h观察,记录各组动物各个时间段内的局部
症状以及呼吸、食欲、活动等全身状况,以动物的死亡数累计各组的实验结果.计算各组动物死亡率和保护
率(模型组死亡率-给药组死亡率=保护率).按死亡率的百分率显著性检测进行统计分析[16].24h后解
剖各实验组小鼠,观察其组织出血量,组织坏死面积以及溃疡发生面积,各指标程度的轻重用“+”的个数
表示,越多表示程度越重.
1.2.5数据处理 采用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(x-±s)表示,行双侧检
验,检验水准α=0.05.组间多重数据比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义.
2 结果与讨论
2.1中毒表现
除空白组外,各组小鼠从注射五步蛇毒数分钟后,注射部位充血开始,表现为呼吸急促,眼睛瞳孔缩
小,全身缩成一团,行动缓慢,并均有不同程度的嗜睡、懒动等症状.这些症状模型组动物表现得更为明显,
该组死亡10只,死亡动物都有肛门出血等现象.各剂量组注毒后也出现一些死亡,但并发症状比模型组所
表现的程度轻.3h后可以看到注射部位充血严重,局部皮肤均出现紫绀、溃烂如烫伤样.
2.2死亡率和保护率
由表2可以看出,各剂量组都表现了不同
程度的保护情况,尤其是高剂量组的峨嵋双蝴蝶
浸膏溶液对五步蛇毒抗性明显,保护率高达
60%,死亡率明显降低.这说明高剂量的峨嵋双
蝴蝶浸膏溶液具有较强的抗五步蛇毒性的作用.
表2 不同剂量药物对中毒小鼠的保护情况
组别 动物数 死亡数 存活数 死亡率/% 保护率/%
模型组 15 10 5 67
低剂量 15 8 7 53 14
中剂量 15 4 9 26 41
高剂量 15 1 14 7 60
2.3组织坏死对比
动物中毒死亡后,将各剂量组和模型组动物取样解剖,与正常健康小鼠(空白组)解剖做对比实验.健
康小鼠血液鲜红、血流正常,肝、肾、脾等内脏无充血等异常现象.而中毒小鼠局部注射部位溃烂,出现结痂
表3 局部注射蛇毒后各组织中毒程度对比
组别 出血程度 坏死程度 溃疡
空白组 — — —
模型组 + ++++ ++++
低剂量组 ++ +++ +++
中剂量组 +++ ++ ++
高剂量组 ++++ + +
注 以上表现程度轻重由“+”多少来表示.
并形成血肿块,解剖脏器均有不同程度的充血,血液
呈黯红,血流缓慢,严重的情况肉眼可见肝脏坏死.
解剖前后还对各剂量组和模型组的中毒状况作了对
比,观察各组小鼠的中毒情况,并做详细记录.表3
示出以各组注毒后所出现的局部肌肉组织的出血、
坏死和溃疡情况为例,不同质量分数的峨眉双蝴蝶
植物水提浸膏对抗五步蛇毒的结果.
由表3可知,模型组中毒动物出血很少,原因是组织充血开始,局部皮肤有瘀斑,出现不同程度的坏
死、溃烂,血液流动缓慢;而各剂量组随着药物质量分数的提高,中毒程度呈减轻趋势.特别是高剂量组受
药物保护后,对中毒小鼠的组织坏死与溃疡情况保护明显,血液外流速度与健康小鼠无异常.这说明峨嵋
双蝴蝶浸膏溶液具有抗五步蛇毒之功效,并对组织坏死有明显保护作用.
3 结语
在中国,用中草药治疗蛇伤的历史悠久.例如民间收集了一些具有抗蛇毒作用明显的中草药单方、验
方,如广东蛇药、广西蛇药、群生蛇药、熊山蛇药、毛萝藦注射液、A草蛇药片等[17],这些药方材料易得,疗
效显著.本实验提取天然植物峨眉双蝴蝶其有效成分制成浸膏,配成不同质量分数的药剂溶液进行对抗五
步蛇毒实验.结果表明,峨眉双蝴蝶浸膏溶液能明显改善蛇毒中毒症状,并随着浸膏溶液质量分数的增加,
中毒组织症状呈减轻趋势,尤其是以成人剂量的5倍给药,可降低五步蛇毒中毒小白鼠的死亡率,说明峨
眉双蝴蝶浸膏溶液对中五步蛇毒的动物具有明显的保护作用.
从本实验来看,峨眉双蝴蝶植物水提物具有缓解蛇毒扩散、控制病情发展、提高疗效的作用,但是它对
抗蛇毒的具体化学成分还不清楚,有待进一步研究.双蝴蝶属植物中除齐墩果酸和芒果甙外,有资料表明
还有2种酸类物质(oleanolic acid和norathyriol).对峨嵋双蝴蝶的分析表明,其齐墩果酸的质量分数达1
.51mg/g[18].然而,近几年来,对民间具有抗蛇毒作用的中草药进行研究的结果表明:抗蛇毒有效成分为
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有机酸,并且药理实验证明有机酸钾钠盐的保护作用要比游离的有机酸强.因此,可以认为此类植物与其
他中草蛇药一样富含多种有机酸,当然也并不是所有的功能都由有机酸来体现,其他成分如糖、黄酮甙等
同样能增强有机酸的保护作用.另外,除了有机酸,药物中的无机成分也起到协同作用,因为单一组分的抗
蛇毒效果远不如与其他成分协同之下所起作用显著[19],因此峨眉双蝴蝶抗蛇毒的有效成分量效关系及与
其他成分协同作用的解毒机理有待进一步研究.
参考文献:
[1]李清平,周文忠,刘治昆.五步蛇咬伤临床研究进展[J].蛇志,2012,24(1):58-60.
[2]苏煌财,许云禄,林玉仙.液相色谱分离纯化五步蛇毒凝血酶样酶[J].药品评价,2014,11(24):29-31.
[3]WANG Shasha,XU Xiaolong,GAO Shang,et al.Purification and Partial Characterization of a Novel Fibrinogenase from
the Venom of Deinagkistrodon Acutus:Inhibition of Platelet Aggregation[J].Protein Expression and Purification,2014,
99:99-105.
[4]TANG Songshan,WANG Xiaohua,ZHANG Juanhui,et al.Biochemical Properties and Comparative Pharmacology of a Coagulant
fromDeinagkistrodon Acutus Snake Venom[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2013,49(1):90-98.
[5]熊 广,曾仲意,陈彩凤,等.蛇伤一号合剂治疗五步蛇咬伤临床观察[J].蛇志,2004,16(1):21-22.
[6]邱光泽,黄道斋,丁惠堂,等.青龙蛇药对眼镜蛇毒中毒动物的保护实验及临床药理[J].蛇志,1989,1(4):27-28.
[7]吕宗友,李州朝.A草蛇药抗蛇毒动物实验[J].医学临床研究,1986,27(6):16-17.
[8]周建平,周小苹,邹荣生.196例五步蛇咬伤中毒的观察与护理[J].安徽中医临床杂志,2003,15(2):149-150.
[9]蒋三元,唐荣德,张健民,等.10种广东本地清热解毒中草药体外抗蛇毒作用的实验研究[J].蛇志,2011,23(1):1-3.
[10]田莎莎,李伟平,沈嫣婧,等.半夏、天南星和滴水珠抗五步蛇毒中毒作用的研究[J].中药药理与临床,2013,29(3):136-138.
[11]舒普荣.中草药彩色图谱与验方[M].南昌:江西科学技术出版社,2000:392.
[12]CHANG CHUANG-CHANG,LIN CHUN-NAN,LIN JUNG-YAW.Inhibition of Moloney Murine Leukemia Virus Re-
verse Transcriptase Activity by Tetrahydoxy Xanthones Isolated from the Chinese Herb,Tripterospemum Lanceolatum
[J].Antiviral Res.,1992(2):119-127.
[13]WANG JIH-PYANG,LIN CHUN-NAN,TENG CHE-MING.Effect of Norathyriol,Isolated from Tripterospermum
Lanceolatum,on A23187-Induced Pleurisy and Analgesia in Mice[J].Archives of Pharmacology,1994,350(1):90-95.
[14]周罗琴,田宏现.峨嵋双蝴蝶提取物抑菌作用研究[J].中国农学通报,2015,31(7):154-158.
[15]肖贵苹.毒蛇咬伤后的疗法[J].农村百事通,1999(8):45.
[16]杜方麓,田文艺,田育望,等.毛萝藦中各部位对眼镜蛇毒中毒小鼠的保护作用研究[J].湖南中医学报,1994,14(3):51-52.
[17]刘法锦,金幼兰,黄元萍.近年来具有抗蛇毒作用的中草药研究概况[J].中草药,1989,20(5):44-46.
[18]敖 琼,田宏现,杨宏健,等.RP-HPLC法测定峨嵋双蝴蝶中齐墩果酸的含量[J].中国医药导刊,2012,14(1):165-166.
[19]梁 彬.广东蛇药水溶性有效成分的组合与其协同作用的研究[J].中药通报,1985(8):42-44.
Antitoxic Effect of Extracts of Tripterospemum Cordatum Against
Deinagkistrodon Acutus Snake Venom
ZHOU Luoqin,TIAN Hongxian
(Colege of Biology &Environmental Science,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)
Abstract:The antitoxic efect of Tripterospemum cordatum aqueous extracts against Deinagkistrodon acutus
snake venom is researched.The BACA/C mice were divided into five group according to the dosage of Triptero-
spemum cordatum aqueous extracts applied:low dosage,middle dosage,high dosage,blank group and model
group,each group of health conditions being observed after 7-days intra-gastric administration.For the last time
of administration,each group was intraperitonealy injected with Agkistrodon acutus snake venom after one hour
later,then the mice’s poisoning performance was observed and the death rate was calculated,and each group of
mice’s tissue bleeding,death and ulceration compared.The results showed that the aqueous extract of Triptero-
spemum cordatum at the low dosage,middle dosage and high dosage al reduced the mortality caused by Agkistr-
odon acutus snake venom poisoning and relieved some symptoms;with the increase of the dosage the symptoms
decreased significantly,and the protection effect on the tissue was especialy apparent.It can be concluded
that the aqueous extract of Tripterospemum cordatum has antitoxic effect against Agkistrodon acutus
snake venom and decrease the toxicity.
Key words:extracts of Tripterospemum;Deinagkistrodon acutus;antitoxic;protective rate (责任编辑 向阳洁)
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