全 文 ：用酶标试纸检测青菜叶片内的
长叶车前花叶病毒
朱培坤 陆妙康 王鸣政
(复旦大学生物系 )
将免疫酶标抗体溶液 ,湿润醋酸纤维薄膜 , 待凉干后冰箱保存备用 . 用上述薄膜紧贴于一
定方式处理过的器官 、 组织表面进行孵育 , 然后用酶底物显色的方法就能检测这些器官 、 组织
内的相关抗原 , 作者称这种含有酶标记抗体的薄膜为酶标试纸 . 免疫酶标技术以往使用的是
溶液状态的酶标记抗体 , 不便携带保存 , 也不便对大面积的器官 、 组织进行检测 . 运用酶标试
纸检测植物叶器官内的病毒 ,携带方便 、使用简单 、 结果可靠 ,并且能从整片叶的范围内了解病
毒的分布概况 .
材 料 与 方 法
1
. 长叶车前花叶病毒及其抗血清的制备 .l[J
2
. 辣根过氧化物酶标记抗体的制备 L代
3
. 酶标试纸的制备 : 将制备好的酶标记抗体溶液 ,用等量生理盐水稀释 ,滴在醋酸纤维薄
膜 (上海市湖南化剂室产品 )上 , 让薄膜全面湿润后 ,凉干 ,存放 4℃ 冰箱保存 .
4
. 叠氮钠抑制剂的配制 : 16 外N a N 3 溶液2[] .
5
. 将温室生长 2一 3周的青菜 , 人工磨擦接种长叶车前花叶病毒 , 约 5 天后采摘接种叶片 .
同时采摘青菜健叶以作对照 . 将上述整张健 、 病叶片分别浸人丙酮一氯仿混合液 (丙酮 : 氯仿
为 1 : l) 里 1一 2 小时 , 然后在丙酮里浸 4一 5 小时或过夜 , 以达到固定组织内病毒 , 去除叶表面
蜡质层和叶片色素的 目的 .
上述经丙酮处理之叶片 , 浸人 16 外N a N 3 溶液中抑制过夜 , 次 日滴加 D A B一 4 H cl ( 3 , 3 ,一二
胺基联苯胺四盐酸 , 简称 D A B一4H C I , 7 5 m g D A B一 4 H C I 溶于 1 0 0 lnI p H 7 . 6 , o . o 5M 的 T r i。
H CI 缓冲液中 )和 H ZO Z( 0 . 3多 ) , 当叶片不显示棕褐色表明内源过氧化物酶已被抑制 , 否则需
继续处理 . 上违健 、 病叶片充分洗涤去除 N a N : 后平铺在玻片上 , 让水滴尽 ,但保持叶片湿润 ,
然后将与该叶片大小相仿的酶标试纸紧贴在叶面上 , 贴时防止气泡 , 务必吻合紧密 . 然后在
湿保温 ( 3 7℃ ) 下孵育 3一 4 小时或室温过夜 . 孵育毕 , 取下酶标试纸将其妥善保存 , 如补充酶
标抗体后可留待再用 . 将经酶标试纸处理的健 、 病叶片分别在 P BS 一 T~ n 20 中浸洗去尽游离酶后 ,取出叶片平放在玻片上 ,滴加底物 D A -B 4 H cl 和 H 2 0 2 反应 .
结 果 与 讨 论
经酶标试纸敷贴之健叶 , 滴加底物不显色 (图 1一 l ) ; 而病叶出现棕褐色阳性反应 , 叶片组
本文 1 9 8 1 年 8 月 n 日收到 .
科 学 通 报 1 9 8 2 年
织许多区域被染上棕褐色 , 颜色有深有浅 , 色斑有大有小 、 有疏有密 (图 l 一2 ) . 从青菜病叶片
染色区域来看 ,近叶尖边缘区域棕褐色斑块较多 , 反映了长叶车前花叶病毒感染青菜后 , 较多
地集中在该处 .
酶标试纸制备后 , 尽量存放在冰箱里 . 如无冰箱 ,存放
干燥阴凉处妥善保存也可 . 在夏季高温季节 , 将酶标试纸
室温存放一月后 , 仍不失使用效果 . 但冰箱保存者 ,使用效
果较好 . 经酶标试纸显色的病叶片 , 干贴于玻片上可长期
保存 .
用 N a N , 抑制剂充分抑制叶片内源过氧化物酶 ,另外 ,
经酶标试纸敷贴后的叶片 , 要充分洗涤去尽游离酶是防止
假阳性的前提 . 只要做到上述两点 ,检测结果就非常可靠 .
尤其要注意在用酶标试纸检测前 , 需将经 N a姚 抑制剂处
理过的叶片进行抑制效果检验 . 如对底物不再显色 , 就不
需继续抑制处理 . 虽然用氰化物能抑制器官 、 组织内源过
氧化物酶 ,但它的毒性极强 ,使用极为危险 , 不便普及推广 .
而用叠氮化钠 , 比较而言相对安全 . 本试验所用 N a N3 浓
度比以往报道的增高一倍 , 抑制作用时间延长 .l[ 2 ] , 这对于
去除整张叶片器官内源过氧化物酶的干扰 , 保障检测结果
可靠是必要的 . 但对病毒抗原性无影响 .
图 l 酶标试纸检测青菜叶片内的
长叶车前花叶病毒
1
. 青菜健叶片经酶标试纸敷贴后 , 滴加
底物不显色 :
2
. 青菜病叶片 (长叶车前花叶病毒 )经同
样处理 , 显示棕褐色反应 , 不同深浅的棕
褐色斑块 ,反映病毒在叶片内的分布
在制备酶标试纸时 ,醋酸纤维薄膜起着载体的作用 . 我们使用的是商品醋酸纤维薄膜 , 厚
度为 1 d0 m m . 如制备厚度更小的醋酸纤维薄膜 , 估计能进一步节省酶标抗体的使用 . 或者寻
找比醋酸纤维薄膜更为优良的载体 ,势必能使酶标试纸的质量提高 . 这些均值得进一步研究 .
青菜叶片接种长叶车前花叶病毒约 , 天后的材料 , 肉眼无法判断叶片带毒否 ,因为症状不
明显 . 但是用酶标试纸能检测出叶片是否带毒 , 与一般使用的血清学诊断技术相比较 , 酶标试
纸还是灵敏的 .
如果制备了抗抗体的酶标试纸 , 那么不论何种抗原 , 只要通过产生第一抗体的动物免疫
的 , 就能将这种酶标试纸更广泛地使用 . 因此作者认为有条件的生物化学制品企业 , 可将酶标
试纸作为商品进行生产 , 从而可以使酶标试纸检测技术 , 广泛地使用于动植物检疫 、 医疗化验
以及有关的科研部门 .
{; }
参 考
朱培坤等 ,复旦学报 , 20 ( 19 8 1) , 19 2一 19 5 .
朱培坤 , 上海农业科技 , 142 ( 1 9 8 0) , 17一 5 .
文 献
第 4 期