全 文 ：第 13卷 第 1期
18 9 3年 3月
植 物 病 理 学 报
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1
1 98 3
长叶车前花叶病毒在青菜叶片
叶柄内的免疫酶标定位
朱培坤 陆妙康 朱孔生 王鸣歧
( 复旦大学生物系
王 美 琪
( 中国科学院上海植物生理研究所 )
摘 要
系统感染长叶车前花叶病毒的青菜叶片叶柄分别作冰冻切片 , 运 用免疫酶
标技术对叶片叶柄内的病毒进行显色定位 。 观察到病毒与酶标杭体结合而显色
的现象广泛地存在于叶片的叶肉细胞内和叶柄的薄壁细胞内 , 在维管束周围的
薄壁细胞和木质部与韧皮部之 间的形成层细胞中尤甚。 对叶片内的病毒作免疫
荧光定位 , 荧光显色部位基本上与酶标显色部位一 致 。 健叶片叶柄均不显色 。
撕取青菜叶片表皮和心叶烟叶片表皮 , 运用免疫酶标技术对其细胞内的长叶车前花
叶病毒进行显色定位已有报道〔 1 〕〔 2 〕。 但尚未对叶片直切面内的病毒作酶标显色定位。
至于叶柄内的病毒分布状况 , 无论是荧光抗体显色还是酶标抗体显色 , 国内均未见报道 。
现进一步用冰冻切片法 , 对叶片叶柄内的病毒进行免疫酶标定位 , 以了解青菜病毒病的
叶片横切面和叶柄横切面的病理结构 。
材 料 和 方 法
1
. 长叶车前花叶病毒及其免疫球蛋白的制备 : 将温室人工接种长叶车前花叶病毒的
青菜病叶捣碎 , 用聚乙二醇 ( P E G , 分子量 6 , 0 0 ) 沉淀病毒 , 用差速离心得病毒 液 。
测紫外吸收光谱曲线 , 2 6 0 n m 处有最高吸收峰 。 电镜观察 , 见大量棒状粒体。 接种心叶
烟 , 产生枯斑 。 接种长叶车前 , 产生花叶症状〔幻 。 在病毒 液 中 , 加入 10 % S D S , 在沸
水中处理 2 分钟 , 冷却后 ,进行聚丙烯酞胺凝胶电泳 。 凝胶是由 10 m l l5 % 贮 液 , 0 . 3 m l
1 0 乡` S D S , r s m l 0 . 2M p H 7。 8磷 酸 缓 冲 液 , 2 4协1 T E M E D , 0 . 2m l 1 0% A P , 4 . s m l
H : O配制而成 。 1 5%贮液则由 1 5 g A 。 r , 0 . 7 5 9 B i s溶于 1 0 0 m l H ZO 中而得 。 缓冲液系
统为 0 . 2 M p H 7 . 8磷酸缓冲液 , 1 0% S D S s m ] , H : 0 2 4 5 m l 。 电泳时间分别为 z 小时 ,
2 小时 , 3 小时 , 4 小时 , 染色脱色后 , 为单一条带 ( 图 1 ) 。 将此病毒作为抗原 , 用
非完全福氏佐剂法免疫家兔 , 所得抗血清效价为 1 : 2 0 4 8。 该抗血清进行双 向火箭免疫
电泳 , 呈单峰 , 这表明抗体成分在免疫学上是纯的 ( 图 2 ) 。 上述抗血清 , 用 3 %饱和
硫酸钱沉淀法制得免疫球蛋白。
植 物 病 理 学 报 1 3奋
图 l长叶车前花叶病毒 SD S降解后聚
丙蜂耽按凝胶电泳呈单一的条带
1
.
2
、
3
、
4分别为电泳 1 、 2、 8、 4小时
图 2长叶车前花叶病毒和其杭
血清双向火箭 电泳呈单一峰
2
。曲标杭体的翻奋 :将辣根过氧化物酶 (上海东风生化试剂厂 , R : = 3 . 0 ) 溶于浓
度为 l m g / m l的免疫球蛋白中 ( 以 5 : 2 m g / m l的比例 ) , 加入 戊 二 醛 ( O . D 23 5 / O . D
28 0 < 3 )
, 使其终浓度为 0 . 06 % 。 充分混和后置室温 4 小时 , 然后对 P B S 透析去除残
余戊二醛 , 即得醉标抗体液〔幻 。
8
. 筑光杭体的翻奋: 用异硫氰酸盐荧光黄 ( F I T C ) 标记免疫球蛋 白 , 4 ℃下搅拌
结合 12 小时 , 并过 S eP h a de x G 一 25 柱 , 即得荧光杭体液 。
4
。
, 菜碗叶片和启叶摘的获褥 : 将温室生长二周的青菜秧苗移栽于消毒土内 , 成活
后接种长叶车前花叶病毒。 所用材料为已生长 6 ~ 8 周 。
肠二标杭体维色: 在20 2一 r型冰冻切片机上 , 作感染病毒的青菜叶片横切面和叶柄
橄切面的冰冻切片 , 厚度为 10 微米。 将切片贴在载玻片上 , 立即用 75 %丙酮固定抗原。
自然千燥后 , 浸入 8 % N a N 3溶液中 , 抑制 4 ~ 5 小时或过夜〔 , 〕。 将残余的 N a N : 漂洗
去尽 , 滴加底物 3 . 3尹一二胺基联苯胺 盐 酸 盐 ( 简称 D A B一 4 H CI , 75 m g D A B一 4H CI 溶
于 i 0 0m l p H了。 6 , o . o 5M的 T r i s一H C ]缓冲液中 ) 和 H : O : ( 0 . 3% ) 。 用光学显微镜检
查 , 无显色反应 , 这表示内源酶被抑制 。 尔后 , 将切片材料洗净 , 滴加酶 标 抗 体 液 ,
3 7七反应 2 ~ 3 小时后 , 在 p H 7 。 4 O. 01 M P B S中将切片材料洗净 , 滴加 底 物 D A B一
4 H CI 和 H : O : 反应 , 用光学显微镜观察 。
.
。臾光杭体维色 : 病叶的冰冻切片材料 , 丙酮固定 , 荧光抗体染色 1 小时 , P B S充
分洗涤 , 封裱后 , 镜检 。
结 果 和 讨 论
青菜健叶片叶柄用酶标抗体液处理后 , 滴加底物无显色反应 ( 图 3 . a , c ) , 而 感 染
长叶车前花叶病毒的病叶片叶柄均显示棕色反应 ( 图 3 。 b , d ) 。 从染 色 程度 看 , 叶片
切片比叶柄切片为甚。 从叶片切面看 , 显示棕色的叶肉细胞 , 即栅栏细胞和海绵细胞分
布广泛 , 由于栅栏细胞排列紧密 , 因而染色更深 ( 图版 3 . b ) 。 从叶柄切面看 , 着色 的
薄壁细胞分布广泛 , 维管束周围的薄壁细胞以及韧皮部与木质部之间的形成层细胞染色
更深 , 而无生命的细胞 ( 例如导管 ) 就不显色 ( 图3 . d ) ,
朱培坤等 :长 叶车前花叶病娜在青莱叶片叶柄内的免度 .标定位
a 。 健叶片 , 无显色反应。 病叶片 , ( 肠染长叶车前花叶病毒
叶肉细班呈徐色 反应。
`二 , . , , , , 二二 0 二。 。 d . 病叶柄 ( 感集长叶车前花叶病毒 ) ,薄盆细旅和形成层细启呈徐色反应 。
图 3 青莱叶片 ( 横切面 ) 叶柄 ( 横切面 ) 冰冻切片免疚晦标
技术处理结果 ( 照片均为 8 x lo )
灸光抗体染色健叶切片无特异荧光 , 而病叶切片 , 其发生荧光区域与免疫酶标技术
染色的区域基本一致 , 均为叶肉细胞 ( 图 4 ) 。 从图 4 与图 3 . b 比较来看 , 酶标抗体的
显色比荧光抗体更充分 , 这说明免疫
酶标技术的灵敏性高。 另外 , 用免疫
酶标技术对病毒显色定位 , 观察细胞
结构甚为清晰 , 摄影方便 。 若用石蜡
切片代替冰冻切片 , 可以避免低温对
切片材料的损伤 , 从而使组织与细胞
的结构更完整 。 作者认为 : 叶片叶肉
细胞和叶柄薄壁细胞被广泛染色 , 表
明病毒极可能经过胞间联丝或细胞间
其它通道从一个细胞扩散到另一个细 图 4 贡莱叶片冰赤切片 ( 直切面 )
胞。 同时作者又认为维管束周围的薄 免疫荧光对其叶肉细 . 内病专的定位 ( 。 、 10)
璧细胞染色较深 , 这为病毒系统感染植物输导组织可能是一个主要通道的设想提供了间
接的佐证 。 与叶柄发育有关的形成层细胞和与光合作用有关的叶片栅栏细胞 染 色 也 较
深 , 表示病毒使青菜无法正常生长发育 , 以致叶片出现褪绿明脉和间绿斑块 , 叶柄乃至
莱茎出现僵缩 , 整棵青莱奄奄一息 。
“ 植 物 病 理 学 报 13卷
应用免疫酶标技术对植物组织内的病毒染色定位 , 还可进一步从动态的角度 , 研究
病毒侵染植物细胞后的发展状况 , 阐明病毒在植物体内的输导途径 , 了解病毒感染不同
种属的植物的病理结构 , 探索病毒与寄主细胞的关系 , 无疑是有意义的 。 .
, 考 文 献
〔 1〕
〔 2〕
〔 8〕
朱培坤 : 上海农业科技 , 14 2 : 17 ~ 18 , 1 9 8 0 .
朱堵坤等 :
徐来升等 :
发且学报 ( 自然科学版 ) , 2。
上海农业科技 , 1魂。 : 2 5~ 3 2 ,
: 19 2~ 1 9 8
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