全 文 ：上海免疫学杂志 1 9 8 2 年第 2 卷第 3期 (总 1 69 ) · 41 .
长叶车前花叶病毒与酶标抗体反应后的电镜观察
复旦大学生物系 朱培冲 张武宁 陆妙康 王鸣歧
目前 , 在国内免疫酶标电镜技术观察病毒的工
作正在开展 , 对植物病毒在植物组织细胞内的定位
开始有所报道 〔” 。但是由于超薄切片技术的限制 ,无
法清楚观察植物与酶标抗体反应后的形态。 鉴于辣
根过氧化物酶标记抗体与病毒反应后 , 经底物的作
用 ,会形成使电子密度发生变化的物质 , 对病毒起着
正显示的效果 。 因此可以考虑用免疫酶标技术代替
电镜技术中的常规染色方法 。
本文报道长叶车前花叶病毒 ( R ib g r as s M os a i。
vi ur
s , R M v ) 与辣根过氧化物酶标记相应抗体结
合并经底物作用后的电镜观察结果 。
材料和方法
一 、 R M V 抗原的纯化 : 温室人工接种 R M V
的青菜病叶捣碎后用正丁醇净化 , 并用 聚 乙 二醇
( P E G
,分子量 6 , 00 0) 沉淀病毒 ,再经超速离心得纯
化的病毒 。
二 、 R M V 抗血清的制备及其免疫球蛋白的 纯
化 : 以纯化病毒为抗原 ,加福氏不完全佐剂 免疫 家
兔 , 每周一次 , 第一次取浓度为 3 毫克 /毫升 /病毒
和 1 毫升佐剂 ( 8 份石腊油 、 2 份羊毛脂配制 )乳化后
注射家兔的背部脊椎两侧 、 大腿肌肉 、 脚掌 、 胫脖等
部位 ; 以后三次 ,均取浓度为 5 毫克 /毫升病毒 1毫升
加 1 毫升福氏不完全佐剂于相同部位作加 强免疫 ,
最后一次注射后间隔一星期采血 。 用试管沉淀法测
抗血清效价为 1 : 20 48 , 将抗血清用饱和硫酸按沉淀
法提纯免疫球蛋白。
三 、 辣根过氧化物酶标记抗体的制备 : 将辣根
过氧化物酶 (上海东风生化试剂厂 , 几: = 3 . 0) 溶于浓
度为 1毫克 /毫升的免疫球蛋白溶液中 ,使其比例为
5 : 2( 毫克 /毫升 ) ,然后加入戊二醛 ( 0 . D . 2 35,/ 0 . .D
28 。 < 3 ) , 使其终浓度为 0 . 06 男 。 室温放置 4 小时
后 ,对 P B S 透析 , 以去除过剩的戊二醛 。
四 、 酶反应底物溶液的配制 : 将 75 毫克 3 、 3 , -
二氨基联苯胺四盐酸 ( D A B性H CI )溶解于 10 毫升
T ir s 一 H CI 缓冲液中 ( 0 . o 5 M , p H 7 . 6) , 滤纸过滤
后 ,避光冷保存 。另外配备好 0 . 03 粥 H ZO Z 溶液〔 ` ’ 。
五 、 标本制备过程 : 吸取 0 . 1 毫升浓度为 1 毫
克 /毫升的 R M V 置于小试管中 , 加入 0 . 1 毫升 酶
标抗体 ,在室温下反应 1一 2 小时后 , 置于冰箱过夜 。
上述小试管同时制备 2 支。 次日从冰箱取出上述内
有 R M V 和酶标记抗体的小试管 , 可见底部有大量
絮状沉淀 , 上层为清液 (带有黄色 ) 。 试验 管加入
0
.
05 毫升 D A B 一 4 H CI 和 0 . 05 毫升 H ZO Z , 晃动试
管 ,使其充分作用 , 即见大量棕褐色沉淀物产生。 另
一管不加入底物 ,作为对照 。
将管内沉淀物剧烈摇晃后 , 分别以双层滤纸重
复过滤两次 ,得溶液作为电镜观察制样用 。
分别用铜网沾取上述两管经过滤所得 的溶 液 ,
在沾取时应略为晃动试管 , 但不使管内上层溶液浑
浊 。 然后让铜网干燥。 不必加入任何电镜样品染色
液 。 用 H u 一 n B 型电子显微镜分别对上 述二 组样
品进行观察。
结果和讨论
R M V 与酶标抗体反应后不 加底 物 的管 内物
(即对照管 )观察 : 所见病毒形态与病毒和免疫球蛋
白(未标记 )反应后的状况基本一致 , 略有加粗〔 2 ’ 。但
是病毒形态不清晰 , 背景也不理想 ,其中可见大量黑
点 ,可能是游离的过氧化物酶所造成的 , 虽经滤纸过
滤 ,未能去除 ,见图 o1
R M V 与酶标抗体反应后滴加底物的管内物 观
察 :所见病毒粒体为一根根黑色短棒 ,形态清晰 。 可
图 1 . R M V 与酶标抗体反应后 ,未加底物
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(下转第 5 页 )
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R E S E A R C H E S O N H L A I N D I A B E T E S IN S H A N G H A I
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(上接第 4 1 页 )
能经底物作用后游离酶也易过滤除去 , 所以背景也
较理想 ,见图 2 。
以往电镜观察病毒常用 P T A 负染 , 即将病毒
负显示 。 本工作 , 用底物使辣根过氧化物酶反应后
改变了 电子密度 , 从而使与酶标抗体结合着的病毒
正显示 。 从电镜观察结果看 , 不用常规染色方法也
能得到这样清晰的病毒图像 ,值得关注。过去曾报道
过病毒与免疫球蛋白结合后有加粗的现象仁, ’ , 有利
于提高 电镜观察的灵敏度 。 而且采用酶标抗体与病
毒免疫反应的技术 ,又可省略电镜常规染色处理 , 因
此 ,进一步开展免疫酶标电镜技术的研究是有益的 。
参 考 文 献
〔 1 〕 朱培坤等 : 复旦学报 ( 自然科学版 ) , 2 0 ( 2 ) : 1 92
198 1
( 2 〕 朱培坤等 : 复旦学报(自然科学版 ) , 2 1 ( 2 ) : ,
( 1 98 1年 1 2 月 2 6 日收稿 , 198 2年 1月 13 日修
19 8 2
回 )
图 2 RM V 与酶标抗体反应后 ,滴加底物
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