全 文 ：基金项目： 国家转基因植物研究与产业化开发专项 （JY04-B-02）， 湖南农业大学人才科学基金（03YJ11）资助。
第一作者简介： 胡新喜， 男， 1973 年生， 博士、 副教授， 研究方向： 园艺植物生物技术。 E-mail： huxinxi163@163.com。
* 通讯作者， 熊兴耀， E-mail： xiongxingyao@126.com。
收稿日期： 2009-12-07 修回日期： 2010-02-09
第 31 卷 第 3 期 热 带 作 物 学 报 Vol．31 No．3
2010 年 3 月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Mar.2010
转 phyB基因枳橙生物学特性分析
胡新喜 1，2， 袁飞荣 2， 邓子牛 1，2， 甘德欣 2， 熊兴耀 1，2*
1湖南农业大学湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室， 湖南长沙 410128
2湖南农业大学园艺园林学院， 湖南长沙 410128
摘要 对转 phyB 基因枳橙进行分子检测和部分生物学特性研究。 PCR、 RT-PCR 和 PCR Southern 杂交结果表
明： phyB 基因已整合到枳橙的基因组， 并得到了转录； 转 phyB 基因枳橙表现出植株矮化、 分枝角度加大、 叶片
变小、 比叶干重增加， 其叶绿素含量比对照高 29.1％。 对枳橙叶片光合特性分析结果表明， 转 phyB 基因枳橙光
合作用增强， 其净光合速率对有效辐射强度和 CO2浓度响应值显著高于对照， 对强光和高浓度 CO2的利用能力
显著高于对照。 利用高效液相色谱法测定转 phyB基因枳橙叶片的内源激素含量， 结果表明， 其 GA1、 GA4、 ABA、
Z 分别比对照高 32.7％、 50％、 121％、 17.8％， 而 IAA 的含量比对照低， 生长类激素与抑制类激素的比值差异
显著， （GA1+GA4）/ABA， Z/ABA 分别比对照低 38.4％和 43.2％。
关键词 枳橙； phyB 基因； 生物学特性
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2010.03.019
中图分类号 S666
枳橙[C. sinensis（L.）Osb×Poncirus trifoliate（L.）Raf.]为甜橙和枳的杂种， 是世界各柑橘生产国广泛应用
的砧木， 不仅具有抗脚腐病和抗衰退病的特性， 并具有耐旱、 耐寒、 耐贫瘠， 对土壤适应性强、 与柑橘
主栽品种亲和力强等特征， 是一种生长势较强的柑橘砧木， 是遗传转化研究较多的柑橘材料， 转矮化基
因 Rol枳橙已进入田间中试阶段[1-2]。
光敏色素（phytochrome）是一类吸收红光或远红光可逆转换的光受体， 它广泛存在于蓝细菌、 低等植株
和高等植物体内[3-5]， 在细胞内以水溶性的色素蛋白二聚体形式存在， 其单体由一个脱辅基蛋白（120~130 kD）N
端 cys残基保守序列和一个线性的四吡咯生色团在细胞质中共价结合而成。 高等植物中存在五种基因型的
光敏色素分子（phyA~phyE）[6-8]， 因其对光的稳定性可分为光不稳定型（Ⅰ型）光敏色素和光稳定型（Ⅱ型）光
敏色素， phyA 属于Ⅰ型， phyB-phyE 属于Ⅱ型， 其中以 phyB 的生理作用为主[9]。 不同生理状态的光敏色
素分子可以根据外界环境光信号的变化在细胞水平和分子水平调控基因表达从而达到调控植物的代谢和
生长发育。 phyB 作为红光的主要受体， 在抑制黄化幼苗或其它细胞伸长生长、 避阴反应以及根据日长控
制开花时间等方面发挥着主要的作用。 研究表明， phyA、 phyB 通过与正调节因子 PIF3、 CCA1 和 LHY 的
G-box 调节元件结合[10]， 把特定的光信号传给下游光诱导基因 cba（叶绿素 a/b结合蛋白基因）、 chs（查儿酮
合成酶基因）、 rbcs（核酮糖-1， 5-二磷酸羧化酶基因）和昼夜节律钟蛋白组分的基因等达到正调节的目
的 [11-12]。 利用转基因技术， 使 phyB 在拟南芥、 烟草和苹果 M26 中得到超表达， 获得矮化植株 [9，13-15]。 用
phyB转化枳橙， 可能获得光合效率更高的种质资源。 本试验对转 phyB基因的枳橙植株， 进行株型、 叶绿
素与激素含量、 光合作用等生物学特性观测， 为进一步阐明 phyB基因在枳橙内的作用机理提供参考。
3期
1 材料与方法
1.1 材料
转 phyB基因特洛亚枳橙植株由国家柑橘改良中心长沙分中心提供， 嫁接在枳壳砧木上， 盆栽于温室
内， 苗龄 1.5 a； 未转化的枳橙采用同样处理。 转基因株系和对照各选 5 株生长一致的植株用于生物学特
性观测， 重复 3次。
1.2 方法
1.2.1核酸提取 采集转基因植株的幼嫩叶片， 利用 Qiagen 试剂盒 DNeasy Plant Mini Kit 提取纯化总
DNA。 Qiagen试剂盒 RNeasy Plant Mini Kit 提取纯化总 RNA， 具体操作参照试剂盒说明进行。
1.2.2PCR 检测 根据 phyB基因序列设计引物： 5ˊ端引物， 5ˊ-CATTATCCGGCTACTGATATTCC-3ˊ；
3ˊ端引物， 5ˊ-TCCACTAGCTACATTGCTCCCA-3ˊ。 扩增体系为： ddH2O 3.75 μL， Buffer（10×Buffer）
1.5 μL， MgCl2（25 μmol/L）1.5 μL， dNTP（1 μmol/L）3 μL， 引物 1、 引物 2（2.5μmol/L）各 1.5μL， DNA（20 ng/L）
2 μL， Taq 酶（1U/μL）0.25 μL。 扩增条件为： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35 个循
环； 72 ℃ 10 min。 采用 ABI 2720 PCR 仪进行 PCR 扩增， 扩增产物用 1.2％的琼脂糖凝胶电泳， 山富
Biosens SC810凝胶成像系统分析。
1.2.3PCR Southern 杂交 以 pGV3850 质粒为模板， PCR 扩增 phyB 基因， 1.2％琼脂糖凝胶电泳， 切
取含目的片段的凝胶于 1.5 mL 的 Eppendorf 管中， 再根据北京鼎国生物技术公司 DNA 快速回收试剂盒说
明， 回收 DNA 片段用于探针制备。 探针标记、 印迹至硝酸纤维素膜、 杂交及显影均参照地高辛标记与检
测试剂盒说明书（Amersham公司）进行。
1.2.4RT-PCR检测 反转录体系为： DEPC 处理水 10.3 μL； 5×Buffer 5 μL； dNTPs （1 mmol/L）5 μL；
3 引物（10 μmol/μL）0.5 μL； RNasin（30 U/μL）0.7 μL； 总 RNA 3 μL（约 3 μg）； M-MLV（200 U/μL）反转录
酶 0.5 μL； 反转录条件： 在 42 ℃反转录处理 1 h， 升温至 95 ℃， 5 min 后终止反应， 再将 cDNA 产物置于
4℃下保存。 最后以反转录产物为模版进行 PCR扩增， 体系和条件同 phyB基因扩增。
1.2.5形态学观测 从 2006年 3月 16日~9月 8日， 对各组材料进行观测， 分别于 3 月 16 日和 4 月 16
日记录枝条长度， 计算新梢生长量； 9月 8日测定株高、 枝条分枝角度和叶面积， 叶面积采用剪纸称量法
[16]， 测定三出复叶的 3个小叶总面积， 并计算比叶干重。
1.2.6叶绿体色素含量测定 叶绿素提取和测定参照张志良的方法 [17]。
1.2.7光合特性测定 转基因系和对照植株各选 5 株， 每株选树体生长一致的 3 片功能叶进行测定， 取
平均值。 于晴天上午（7:30~11:30）测定光合-光强响应特性和光合-CO2响应特性。 用 Li-6400便携式光合分
析系统测定枳橙叶片净光合速率， 在温室活体条件下进行， 同时测定叶片净光合速率 （Pn）、 光合有效辐射
（PAR）、 细胞间隙 CO2浓度（Ci）、 蒸腾速率（Ts）、 气孔导度（Gs）等参数。 采用用 Li-6400便携式光合分析系统
测定 Pn-PAR响应曲线： 参考气源采自 3 m高处， 用 6400-02B LED光源， 在 PAR 50～2 000 μmol·m-2·s-1范
围内进行连续测定， 回归法求得光补偿点（LCP）、 光饱和点（LSP）， 该曲线初始直线部分的斜率即为表
观量子效率（AQY）[18]。 测定 PAR 为 1 500 μmol·m-2·s-1下的 Pn-CO2响应曲线， 在仪器参比室内 CO2 50～
2 000 μmol/mol 范围内连续测定， 回归法求得 CO2饱和点（CSP）和补偿点（CCP）， 该曲线初始直线部分的
斜率即为羧化效率（CE）[18]。
光合速率日变化的测定选晴天（7:30~18:30）， 采用 Li-6400 便携式光合分析系统进行净光合速率（Pn）
日变化的测定， 每隔 1 h 测定 1 次。 仪器同时记录 Pn、 蒸腾速率（Tr）、 气孔导度（Gs）、 细胞间 CO2浓度
（Ci）、 环境 CO2浓度（Ca）、 叶片温度（TL）和光照强度（PAR）。 PAR、 TL 和 CO2浓度以外界条件为准。 为
了消除时间上的误差， 每次重复测定时各品种间采取随机测定的方法。
1.2.8激素含量测定 枳橙内源激素测定采用改良高效液相色谱法， 用岛津 LC-9A 型高效液相色谱系
统[19]测定吲哚乙酸（IAA）， 赤霉素（GA1， GA4）、 玉米素（Z）和脱落酸（ABA）等 5种内源激素的含量。
以上测定重复 3次， 取平均值， 用 DPS数据处理系统进行分析。
胡新喜等： 转 phyB 基因枳橙生物学特性分析 441
热 带 作 物 学 报 31 卷
2 结果与分析
2.1 转 phyB基因枳橙分子检测
2.1.1转 phyB 基因枳橙 PCR 检测 以转基因枳橙和对照植株总 DNA 为模板， phyB 基因的特异引物进
行 PCR扩增， 在转基因植株中扩增出长度约 260 bp 的特异带， 未转化的对照植株无扩增条带， 证明试验
枳橙是转 phyB基因植株（图 1）。
2.1.2PCR-Southern 杂交 用 phyB 基因 PCR 产物作探针， 对转 phyB 基因枳橙和对照 PCR 产物进行
Southern杂交， 结果显示， 转 phyB基因枳橙 DNA的扩增条带有明显的阳性杂交带， 而未转化的对照植株
未见有杂交条带（图 2）， 证明扩增条带确实是 phyB基因的特异性片段。
2.1.3转 phyB基因枳橙 RT-PCR检测 以转化植株和对照植株的 RNA为模板， 进行 RT-PCR扩增， 转
phyB 基因枳橙和阳性对照质粒扩增出一条约 260 bp 的特异带， 未转基因植株无特异带， 表明 phyB 基因
在枳橙植株中已得到转录水平的表达（图 3）。
2.2 转 phyB基因枳橙的形态特征和生长习性
嫁接在枳壳上的转 phyB 基因枳橙在温室内生长状况良好， 转基因植株和对照均在 3 月中旬萌发新
梢。 形态特征观测结果见表 1。 从表 1可见， 转基因植株新梢一个月生长量为 23.6 cm， 而对照为 27.2 cm，
差异显著。 转基因植株株高为 74.6 cm， 比对照矮 9.9％， 差异显著。 转基因枳橙的一次分枝和二次分枝的
角度均比对照大， 即分枝更加向水平方向靠近， 但一次分枝差异更大， 转基因植株一次分枝比对照大
72.7％。 转基因植株的叶面积比对照小 3.2 cm2， 但是其比叶干重却比对照植株多 13.2％。 通过观测结果分
析， 转基因枳橙植株矮化的原因可能与枝条的分枝角度以及生长速度有关。
2.3 转 phyB基因枳橙光合特性分析
2.3.1叶绿素含量比较 从表 2可见， 转 phyB 基因植株叶片的叶绿素 a、 b 及总叶绿素含量均显著高于
对照， 比对照分别增加了 27.6％、 34.8％、 29.1％， 但是转 phyB 基因的叶绿素 a/叶绿素 b 较对照小
5.8％， 差异不显著。 转 phyB 基因枳橙的叶绿素 a 和叶绿素 b 增加， 可能是因为 phyB 基因的过量表达促
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M. 分子量标记； 1～3. 转基因植株，
4. 阴性对照； 5. 阳性对照
图 1 转 phyB 枳橙 PCR 检测
M 1 2 3 4 5
260
bp
M 1 2 3 4 5 6 7
260
bp
M. 100 bp 分子量标记； 1~3. 阴性对照；
4~6. 转基因枳橙； 7. 阳性对照
图 3 转 phyB 基因枳橙的 RT-PCR 分析
1， 2. 转基因枳橙； CK-. 阴性对照；
CK+. 阳性对照
图 2 转 phyB 基因枳橙 PCR Southern 分析
1 2 ck- ck+
442
3期
使叶绿素 a/b 结合蛋白（CAB）的过量表
达， 使叶绿素 a和叶绿素 b的合成增加。
2.3.2转 phyB 基因枳橙光合特性分析
（1）转 phyB 基因枳橙与对照光合作用对
光强的响应 。 图 4 是测定的对照和转
phyB 基因枳橙叶片 Pn-PAR 曲线。 用计算机模拟运算， 得出对照的 Pn-PAR 曲线方程为 y=-2.62E-06x2+
0.007 285x-298.995 6x-1+6.239 274 （R2=0.981 7）， 由此求得对照光补偿点为 45.54 μmo1·m-2·s-1， 饱和点为 1
418.622μmo1·m-2·s-1， 转 phyB 基因枳橙的 Pn-PAR 曲线方程为 y=-2.97E-06x2+0.010 416x-302.629 4x -1+
5.751 974（R2=0.988）， 转 phyB 基因枳橙的补偿点为 48.83 μmo1·m-2·s-1， 饱和点为 1 769.8 μmo1·
m-2·s-1， 说明转 phyB 基因枳橙对强光的耐受性显著强于对照， 而对弱光的利用能力稍低于对照。 根据以
上方程计算得到对照和转 phyB基因枳橙的 AQY分别为 0.126 6 和 0.131 2 ， 说明转 phyB 基因枳橙对光的
利用率较对照高。 （2）转 phyB基因枳橙与对照光合作用对 CO2的响应。 对照 Pn对 CO2浓度的响应见图 5所
示， 其曲线方程为： y=-4.19E-06x2+0.012 212x-235.265 4x-1+5.499 9（R2=0.989）。 由此得出的 CO2补偿点为
39.36 μmol/mol， 饱和点为 1 470.27 μmol/mol； 转 phyB基因枳橙的曲线方程为： y=-4.99E-06x2+0.015 107x-
235.789 8x-1+5.736 981（R2=0.995）， 由此得出的 CO2补偿点为 37.45 μmol/mol， 饱和点为 1 523.9 μmol/mol。
可见， 转 phyB 基因枳橙对 CO2的需求高于对照。 根
据以上方程计算得到对照和转 phyB 基因枳橙的 CE
分别为 0.105 6 和 0.108 6， 说明转 phyB 基因枳橙对
CO2羧化效率较对照高。 （3）转 phyB 基因枳橙与对照
光合作用的日变化。 从图 6 可见， 秋季晴天转 phyB
基因枳橙与对照的 Pn 日变化均为单峰曲线， 最高峰
出现在上午 10:00左右， 下午 4:00前后有一个不明显
的次高峰出现， 转 phyB 基因枳橙总体 Pn 较对照高，
表现出较高的光合效能。 转 phyB 基因枳橙对午前上
升的光强较敏感， Pn 增加迅速， 能较好利用上午的
有利环境条件进行光合生产。
2.4 内源激素含量
植物内源激素和植物的生长和发育密切相关， 因其作用可分为促进生长类激素和抑制生长类激素。
叶片 GA1、 GA4、 IAA、 Z、 ABA内源激素含量测定结果表明， 内源激素含量转化植株与对照存在较大的差异
（表 3）。 转基因枳橙的促进生长类激素 GA1、 GA4 和 Z 均比对照显著提高， 分别高出 32.7％、 50％和
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18
16
14
12
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8
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4
2
0
0 500 1 000 1 500 2 000 2 500
CK phyB
光合有效辐射 PAR/（μmol·m-2·s-1）
净
光
合
速
率
Pn
/（
μm
ol·
m
-2 ·
s-1
）
图 4 Pn-PAR 响应曲线
! #$%&’()*+,+-./01234567289:;
光
合
速
率
Pn
/（
μm
ol·
m
-2 ·
s-1
）
CO2/（μmol/mol）
CK phyB
0 500 1 000 1 500 2 000 2 500
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
图 5 Pn-CO2响应曲线
CK phyB
8:30 9:30 10:30 11:30 12:30 13:30 14:30 15:30 16:30 17:30
时间/h
光
合
速
率
Pn
/（
μm
ol·
m
-2 ·
s-1
）
图 6 光合速率日变化
12
10
8
6
4
2
0
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17.8％； 而生长激素 IAA 的含量比对照低。 生长激素的降低使细胞的伸长受到影响， GA1、 GA4和 Z 的升
高， 能促进细胞的伸长和分裂以及腋芽的萌发和侧枝的生长， 表现出分枝增多、 矮化。 转基因枳橙的抑
制类生长激素 ABA含量比对照显著增加， 比对照高 121％， ABA是植物体内中最重要的生长抑制剂， 能抵
消生长素、 细胞分裂素和赤霉素促进生长的效应， 它的增加能抑制植株的生长。 植物的生长发育进程中不
只是受某单一激素的调节， 而是多种激素间的平衡关系影响着代谢过程。 转基因枳橙的（GA1+ GA4）/ABA，
Z/ABA分别比对照低 38.4％和 43.2％。
3 讨论
光敏色素是一类吸收红光或远红光可逆转换的光受体， 它广泛存在于蓝细菌、 低等植株和高等植物
体内。 不同生理状态的光敏色素分子可以根据外界环境光信号的变化在细胞水平和分子水平调控基因表
达从而达到调控植物的代谢和生长发育。 phyB 作为红光的主要受体， 在抑制黄化幼苗或其它细胞伸长生
长、 避阴反应以及根据日长控制开花时间等方面发挥着主要作用。
Quail等[20]研究结果表明， 已转绿的双子叶植物茎的生长抑制是由 phyB 介导的。 利用转基因技术， 使
phyB 基因在拟南芥、 烟草和苹果 M26 中得到超表达， 获得矮化植株。 Yamaguchi 等[21]研究表明， 光敏色
素（至少有phyB参与）能诱导催化 3β－羟基化酶编码基因的转录活性， 而此酶催化的是产生活性赤霉素 GA1
和GA4的关键步骤。 Holefors等人发现转 phyB基因苹果砧木 M26 表现出矮化[16]。 肖慈木等 [22]研究表明， 促
进生长类激素含量/抑制生长类激素含量比单一激素含量对树体生长影响更重要， GA3/ABA， （ZT十CTK）/ABA，
（ZT+CTK+GA3）/ABA 值越高， 则树体越乔化， 反之则矮化。 本试验结果表明， phyB 基因已整合到转化枳
橙植株中并得到了表达， 而且转 phyB 基因枳橙形态特征和生物学特性表现为植株变矮、 枝条分枝角度增
大、 叶片变小； 内源激素 GA1， GA4、 ABA、 Z 含量比对照高， 而生长激素的含量比对照低。 生长激素的
降低和脱落酸的增加使细胞的伸长受到影响， GA1、 GA4和 Z 的升高， 能促进腋芽的萌发和侧枝的生长，
表现出分枝增多、 矮化， 且转基因枳橙的（GA1+GA4）/ABA， Z/ABA 分别比对照低 38.4％和 43.2％。 因此，
可以推测 phyB基因的表达后， phyB感受日光中的红光， 能诱导改变转基因枳橙体内激素的平衡关系， 从
而使植株表现出矮化。
研究结果表明， phyA、 phyB 通过与正调节因子 PIF3、 CCA1 和 LHY 的 G-box 调节元件结合， 把特
定的光信号传给下游光诱导基因 cab（叶绿素 a/b 结合蛋白基因）、 chs（查儿酮合成酶基因）、 rbcs（核酮糖-
1， 5-二磷酸羧化酶小亚基基因）等基因达到正调节的目的[11-12]。 Bowler 等研究表明， 外源光敏色素的注入
促进番茄光敏色素缺失突变体花色素积累相关基因 chs 和叶绿体发育相关基因 cab、 fnr（铁氧化还原蛋白
nadp 氧化还原酶）等基因的表达[23]。 本试验结果表明， 转 phyB 基因枳橙总叶绿素的含量比对照高 29.1％，
光合特性发生了变化， 与对照相比在高光强和高 CO2浓度下， 净光合速率增加， 这可能是 phyB 基因表达
促进了 cab等光合作用相关基因表达的结果。
虽然对 phyB 基因在植物中的作用研究取得了很大的进展， 但是其介导的光信号转导途径复杂， 与其
他信号因子的相互作用并不完全清楚。 关于 phyB 基因在柑橘中的研究成果很少， 转 phyB 基因枳橙是否
还发生其他性状的变化如： 开花、 昼夜节律、 光呼吸等还需进一步的研究。
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责任编辑： 赵军明
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Biological Characteristics of phyB Gene-based Transgenic Citrange Plants
Hu Xinxi1,2, Yuan Feirong2, Deng Ziniu1,2, Gan Dexin2, Xiong Xingyao1,2
1 Hunan Provincial Key Laboratory for Innovation and Development of Crops Germplasm, Hunan
Agriculture University, Changsha, Hunan 410128
2 College of Horticulture and Landscape Architecture, Hunan Agriculture University, Changsha,
Hunan 410128, China
Abstract Citranges transferred with phyB gene were detected at the molecular level and their biological
characteristics were analyzed. PCR, RT-PCT and PCR-Southern blot analysis indicated that phyB gene was
successfully integrated into citrange genome and was transcribed in citrange. Compared with the non-transgenic
plant, the transgenic plant was dwarf, with larger shoot insertion angle and smaller leaf area, and was higher
in chlorophyll content, net photosynthesis rate, light saturation point and specific leaf weight. Determination
of endogenous hormone by HPLC indicated that the content of GA1, GA4, ABA and Z of the transgenic
plant was 32.7%, 50%, 121% and 17.8% higher than that of the non-transgenic plant, respectively, whereas
the content of IAA was lower than that of the non-transgenic plant. (GA1+ GA4)/ABA and Z/ABA ratios of
the transgenic plant were 38.4% and 43.2% lower than those of the control, respectively.
Key words citrange; phyB gene; biological characteristics.
胡新喜等： 转 phyB 基因枳橙生物学特性分析 445