全 文 ：分析检测
《食品工业》2012年第3期
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立一种快速、简便、有效的分离方法，为今后神秘果
的进一步研究提供试验基础。
1 仪器与药品
HHS型电热恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂生
产；RE52-99型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂生
产；721可见分光光度计：上海光学仪器五厂生产；
高效液相色谱仪：日本岛津公司生产；WR-C微波样
品处理系统：上海新仪微波化学科学有限公司生产。
齐墩果酸对照品：四川维克奇生物科技有限公司
生产；熊果酸标准样品：四川维克奇生物科技有限公
司生产；95%乙醇、正丁醇、高氯酸，冰醋酸、香草
醛等，均为分析纯；甲醇，色谱纯；水，超纯化水。
神秘果采集于海南省尖峰岭国家森林保护区，经
海南师范大学生命科学学院钟琼芯高级实验师鉴定。
2 方法与结果
2.1 神秘果中齐墩果酸的提取
精确称取神秘果粉6.0 g置于600 W微波提取罐
内，以40 mL 95%的乙醇溶液为提取剂，盖上压力
盖、密封、放入微波样品处理系统中提取2 min，取
出冷却后离心分离。保留上层清液，下层残留物在
同样条件下提取两次，均留取上层清液。再用20 mL
95%的乙醇溶液洗涤残留物，合并洗涤液和提取液，
神秘果(Synsepalum dulcificum Daniell)为山榄科
(Sapotaceae)神秘属(Synsepalum)常绿灌木植物，原产
于西非热带地区。20世纪60年代引入我国海南、云
南、广西等热带亚热带地区种植。神秘果中含有的
神秘果素(Miraculin)是一种特异的变味蛋白，可使柠
檬，酸橙、葡萄柚等酸性食物变成可口的甜味，它也
因此而得名[1]。神秘果可用作食品、医药及化妆品等
领域的增甜剂、助食剂、食品色素等[2-6]。
五环三萜类(pentacyclic triterpenes)化合物是一类
重要的天然产物，大多数以游离或者苷类的形式广泛
存在于自然界中，其主要的结构类型有乌苏烷型，齐
墩果酸型，羽扁豆烷型和木栓烷型等[7-9]。齐墩果酸
(oleanolic acid)，又名庆四素，白色针状结晶，具有护
肝降酶、防止肝硬化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、镇
静等多方面的临床药理作用，是开发治疗肝病和降血
糖药物的有效成分[10-15]。
由于五环三萜及齐墩果酸母核的结构比较复杂，
人工合成步骤繁琐，目前仍然依赖于从植物中提取。
为了进一步研究和开发神秘果这种稀有的种质资源，
本文利用微波提取法从神秘果粉中提取齐墩果酸和五
环三萜，采用HPLC法测定齐墩果酸含量，以熊果酸
为对照品，利用比色法测定五环三萜的含量。旨在建
1. 海南师范大学化学与化工学院（海口 571158）；2. 海南南派实业有限公司（海口 571100）
神秘果中齐墩果酸和五环三萜含量的测定
卢圣楼1，刘红1*，曹佳佳1，黄巨波1，胡成豪2
摘 要 微波提取神秘果中齐墩果酸和五环三萜，并用HPLC测定齐墩果酸含量，比色法测定
五环三萜的含量。结果表明：齐墩果酸在0.01~0.05 mg/mL范围内线性关系良好，回归方程为：
Y=5.8672E-8X-2.908 07E-4，RSD=1.33%，相关系数r=0.995 72，含量为0.03 mg/g。五环三萜在
0.1~0.6 mg/mL范围内线性关系良好，A=2.92C+1.272，相关系数r=0.990 04，含量为0.9 mg/g。试验
建立的两种方法操作简便、准确、快速，适合神秘果中齐墩果酸及五环三萜含量的测定。
关键词 神秘果；齐墩果酸；五环三萜
Determination of the Content of Oleanolic Acid and Pentacyclic
Triterpenes from Synsepalum Dulcifi cum Daniell
Lu Sheng-lou1, Liu-Hong1*, Cao Jia-jia1, Huang Ju-bo1, Hu Cheng-hao2
1. College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University (Haikou 571158);
2. Hainan South Industrial Co., LTD (Haikou 571100)
Abstract Microwave extraction was used to extract oleanolic acid and pentacyclic triterpenes from
Synsepalum dulcifi cum Daniell. The content of oleanolic acid was determined by high performance liquid
chromatography. The content of pentacyclic triterpenes was determined by colorimetric determination. The
experimental results indicated that when concentration of oleanolic acid rang from 0.01 mg/mL to 0.05
mg/mL, the regressive equation of the calibration graph was Y=5.867 2E-8X-2.908 07E-4, RSD=1.33%,
r square value was 0.990 04, the content was 0.03 mg/mL. When concentration of pentacyclic triterpenes
rang from 0.1 mg/mL to 0.6 mg/mL, the regressive equation of the calibration graph was A=2.92C+1.272,
r square value was 0.990 04, the content was 0.9 mg/mL. The method was simple, rapid, and accurate to be
used in determination of oleanolic acid and pentacyclic triterpenes from Synsepalum dulcifi cum Daniell.
Keywords Synsepalum dulcifi cum Daniell; oleanolic acid; pentacyclic triterpenes
基金项目：海口市重点科技计划（2010-086）和海南省
社会发展专项（2010SF007）
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减压浓缩。所得的浸膏先后用水和氯仿洗涤，合并洗涤
液，去水层。有机层再用水洗涤6次，去水层，蒸馏氯仿，
用甲醇将所得溶液转移至10 mL容量瓶中并定容至刻
度。经0.45 μm滤膜过滤，即得齐墩果酸溶液。
2.2 神秘果中五环三萜的提取
精确称取神秘果粉6.0 g置于600 W微波提取罐
内，以40 mL 95%的乙醇溶液为提取剂，盖上压力盖、密
封、放入微波样品处理系统中提取5 min，冷却后离心分
离。提取液中加入适量活性炭加热煮沸，趁热过滤，浓
缩，蒸馏水稀释后，再用正丁醇萃取，合并萃取液，浓缩
回收正丁醇，所得浸膏用乙醇定容，即得样品液。
2.3 色谱条件的建立
2.3.1 流动相配比的选择
对于反相液相色谱，当流动相中有机溶剂的比例
增加时，极性减小，流动相的洗脱能力增强；当流动
相中有机溶剂比例减少时，极性增大，流动相的洗脱
能力减弱。以下是流动相的不同配比洗脱齐墩果酸标
准品的色谱图，见图1。
由图1可知：(a)甲醇∶水=90∶10时齐墩果酸的保
留时间t=5.941 s；(b)甲醇∶水∶冰醋酸=85∶15∶0.1时
齐墩果酸的保留时间t=8.678 s。流动相的洗脱情况随
水的比例增加，色谱峰展宽的现象明显改善。齐墩果
酸保留时间合适，可以减少甲醇水合峰的干扰，有利
于样品的分析分离，因此本试验确定流动相配比为甲
醇∶水∶冰醋酸=85∶15∶0.1。
2.3.2 检测波长的确定
用紫外分光光度计在194~250 nm范围内，对齐
墩果酸标准品进行扫描，结果显示齐墩果酸的吸收波
长在195~225 nm范围之间。甲醇的最大吸收波长为
205 nm，容易引起干扰，影响洗脱效果。为了提高灵
敏度，降低干扰因素，本文选择检测波长为215 nm。
经过讨论，建立如下色谱条件：色谱柱：
ODSHyper2SILC18(4.0 mm×200 mm×5 μm)；流动相：
甲醇∶水∶冰醋酸=85∶15∶0.1；检测波长：215 nm；
流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。
2.4 齐墩果酸标准曲线的绘制
精确称取减压干燥至恒重的齐墩果酸标准品5.00
mg，加5 mL甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含
齐墩果酸1.0 mg/mL的标准品溶液。精密吸取标准品
溶液0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL置于
10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得浓度为
0.01 mg/mL，0.02 mg/mL，0.03 mg/mL，0.04 mg/mL，
0.05 mg/mL的标准品溶液，按2.3色谱条件进样20 μL
分析。以峰面积为横坐标，标准品浓度为纵坐标，
绘制齐墩果酸的标准工作曲线，见图2，得回归直
线方程为Y=5.867 2E-8X-2.908 07E-4，相关系数
r=0.99572。表明齐墩果酸在浓度0.01~0.050 mg/mL范
围内与峰面积具有良好的线性关系。
2.5 专属性试验
分别吸取空白溶液(不含齐墩果酸的甲醇溶液)，
标准品对照溶液，供试样品溶液，按2.2色谱条件进
样20 μL。结果表明，供试样品溶液在标准品对照
HPLC色谱图的相应的位置上有相同的保留时间，空
白溶液在标准品对照HPLC色谱图的相应的位置无干
扰峰，证明本方法可行，如图3~图5所示。
图1 不同流动相配比洗脱齐墩果酸的色谱图
图2 齐墩果酸的标准曲线
图3 空白对照色谱图
(a)甲醇∶水=90∶10
(b)甲醇∶水∶冰醋酸=85∶15∶0.1
图4 齐墩果酸标准对照品图谱
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2.6 精密度试验
微波制样，进样5次，每次进样20 μL，记录峰面
积。结果RSD=2.23%，表明仪器精密度较好。
2.7 重复性试验
取同批次样品5份，按2.1方法微波制样，进样，
测定，结果RSD=1.34%，如表1所示，表明本法重复
性良好。
2.8 比色法测定五环三萜的含量
2.8.1 测定方法原理[16]
采用冰醋酸-香草醛及高氯酸显色比色法，其原
理机制是三萜本身在可见光区无吸收，羟基脱水而使
其双键数目增加，又经双键位移后，与香草醛结构中
的醛基发生缩合反应，最后在酸作用下形成碳正离子
盐而显色，测定缩合物的量，从而获得总三萜的含
量。以熊果酸(标准样)作标准，在548 nm处有吸收峰
且符合定量分析的比尔定律。
2.8.2 熊果酸标准曲线的绘制
将5 mg熊果酸标准品移入小烧杯中，加95%乙醇溶
解，25 mL容量瓶中95%乙醇定容，摇匀，得0.20 mg/mL
的熊果酸标准品。分别移取0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，
1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL，3.0 mL的熊果酸标准品于8
个试管中，85 ℃水浴挥干乙醇。各加0.5 mL 5%的冰
醋酸-香草醛溶液，摇匀，再各加入1.0 mL高氯酸，
摇匀[17]，60 ℃水浴加热15 min，取出冷却，在548 nm
处测定吸光度A。以浓度为横坐标，A为纵坐标绘制标
准曲线，结果见图6。
从图6可以计算出熊果酸标准曲线回归方程为：
A=2.92C+1.272，其中C为五环三萜浓度(mg/mL)，A
为吸光度值，相关系数r=0.990 04。线性关系良好。
2.8.3 五环三萜含量测定
准确移取1.0 mL的标准品于试管中，85 ℃水浴
蒸干乙醇，加入0.5 mL 5%的冰醋酸-香草醛溶液，
再加入1.0 mL高氯酸，85 ℃水浴15 min，取出冷
却，加5.0 mL冰醋酸摇匀，在548 nm处测定吸光度
Abs=2.85。根据标准曲线换算，可计算出五环三萜得
率A=2.92C+1.272(其中，r=0.990 04)，五环三萜含量
=(CV)×100/样品质量=0.09%。
3 结论
微波提取神秘果中齐墩果酸和五环三萜，建立的色
谱条件：ODSC18色谱柱，柱温25 ℃，流速1 mL/min，流
动相为甲醇∶水∶乙酸=85∶5∶0.1，检测波长215 nm。测
得齐墩果酸的含量为0.03 mg/g，五环三萜的含量为0.9
mg/g。该方法操作简便，准确度高，为今后神秘果相
关产品的开发，提供了科学依据。
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图5 供试样品图谱
表1 重复性试验结果
图6 熊果酸的标准曲线
测量次数 峰面积 齐墩果酸含量/(mg·g-1)
1 307899 0.0296
2 319658 0.0308
3 313036 0.0301
4 312606 0.0301
5 313435 0.0302
RSD/% 1.34
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劳效果对消费者的选择具有指导意义。此次研究全面
评价了三种不同功效成分的功能饮料的抗疲劳效果。
试验根据中国卫生部发布的《保健食品检验与评价技
术规范》，采用小鼠负重游泳试验作为抗疲劳作用的
基本试验项目[2]。
1 材料与方法[3]
1.1 材料
实验室参照市场上常见的抗疲劳功能饮料类型，
分别配制不同功效组分的样品。
样品1按市售氨基酸饮料的配方调配，总糖5 g/100mL，
随着社会的进步、竞争压力的增加，现代人的生
活、工作节奏日益加快，以疲劳为表征的亚健康问题
成为一个社会性的问题。抗疲劳、增强免疫、改善学
习记忆力、帮助睡眠等5大功效的保健品越来越受到
消费者的关注，尤以具有抗疲劳作用的功能饮料备受
青睐。目前，市场上抗疲劳功能饮料种类繁多，大体
分为三个大类：以氨基酸、天然咖啡因为主要功效成
份；以维生素、合成咖啡因为主要功效成份；以天然
鲜鸡精华为主要功效成份。人们选择功能饮料时最关
注的重点是产品功效，因此研究各种功能饮料的抗疲
1. 上海东锦食品集团有限公司 (上海 201812)；2. 复旦大学药学院(上海 201203)
不同功效组分的功能饮料抗疲劳作用的研究
蔡愈杭1，荣耀中1，罗殷1，程能能2，陈伟1
摘 要 比较不同功效组分的功能饮料抗疲劳作用。将雄性昆明小鼠按体重随机分组，分别灌胃不同
剂量不同功效组分的饮料30 d，之后观察各组小鼠体重的变化和负重游泳情况。三款功能饮料均能
够延长小鼠负重游泳时间、持续游泳生存率。三款功能饮料均具有抗疲劳作用，但其中以氨基酸、
瓜拉纳为主要功效组分的氨基酸功能饮料抗疲劳效果最佳。
关键词 功能饮料；游泳时间；生存率；抗疲劳
Study on the Anti-fatigue Effect of Functional Drink Contained
Different Effectiveness
Cai Yü-hang1, Rong Yao-zhong1, Luo Yin1, Cheng Neng-neng2 , Chen Wei1
1. Shanghai Tohkin Food Group Co. Ltd (Shanghai 201812); 2. School of Pharmacy, Fudan University
(Shanghai 201203)
Abstract To study the anti-fatigue effect of functional drink contained different effectiveness, the KM
male mice were randomly divided into groups according to their body weigh. The mice were administered
respectively with water and different functional drink within different dosage. After 30 d, the increase
of mice weight and the forced swimming test were determined. All of the functional drink prolonged the
swimming time of mice and improved their’ survival rate. All of the functional drink had an anti-fatigue
effect, which contain amino acid and guarana functional drink was the best.
Keywords functional drink; swimming time; survival rate; anti-fatigue
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