全 文 ：园　艺　学　报　2006, 33 (1):130 ～ 133
Ac taH or ticu ltu rae S inica
收稿日期:2005 - 06 - 08;修回日期:2005 - 08 -17
基金项目:国家转基因专项资助项目 (Y J04-B-02);湖南农业大学引进人才基金项目 (03YJ09)
*通讯作者 Au thor for correspondence (E-m ail: dengzn@hunau. net)
分子检测部分的试验在湖南农业大学细胞工程重点实验室完成。
转 rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学的观测
胡春华 1　邓子牛 1*　A. G entile2　徐　艳 1　熊兴耀1
(1湖南农业大学园艺园林学院 , 长沙 410128; 2University of C atania, C atan ia 95123, 意大利)
摘　要:对转 rol基因枳橙 B、 D、 E 3个系及对照田间高接植株进行了 PCR分子鉴定 、 RT-PCR转基因
表达分析和生物学特征的观测。 PCR分析表明 rolA、 rolB、 rolC已成功转入到 3个转化枳橙系中。利用 RT-
PCR在田间转化植株中只检测到 nptⅡ和 rolC基因的表达 , 而 rolA、 rolB基因未检测到。 3个转化系枳橙均
表现出顶端优势减弱 , 侧枝增多 , 植株矮化性状明显 , 高度只有对照植株的 44% ～ 50%, 节间长度缩短 ,
叶面积减少;光合作用增强;内源赤霉素 、 生长素 、 玉米素等促进类激素在中部 、 下部叶片含量均高于对
照 , 这可能是诱导上述形态特征的变化的因素之一。
关键词:转基因;枳橙; rol基因;RT-PCR;形态特征;Pn;内源激素
中图分类号:S 666　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X (2006) 01-0130-04
Molecular Analysis, Morphological and Physiological Evaluation of the
Transgen ic C itrange P lantsW ith rolA , ro lB , rolC Genes
Hu Chunhua
1 , Deng Ziniu1* , G en tile A lessandra2 , Xu Yan1 , and X iong X ingyao1
(1Horticulture and Landscape College, Hunan Agricu ltural Un iversity, Changsha 410128; 2University of Catania, Catan ia
95123, Ita ly)
Abstract:Molecular identifica tion, phy sio logy evalua tion and morpho logica l obse rvation of the rolA ,
rolB and rolC transgen ic citrange c lones (B , D, E) were conducted. PCR ana ly sis indicated that the rolA ,
rolB , rolC genesw e re in tegra ted into the citrange genome. The expression of the transgenes nptⅡ and rolC
was detected by using RT-PCR;while the transgenes rolA and rolB d id no t show any RT-PCR product, and it
w as no t clear for the factors re lated to their expression. In comparison w ith the contro l plan ts, the rol transgen-
ic p lant showed ev ident dw a rfing charac teristics, such as only ha lf o f the con tro l in plant he ight, shorter inter-
nodal leng th, weaker apica ldom inancew ithmo re latera lb ranches, smaller leaf area, and h ighe r net pho tosyn-
thesis ra te. H igher contents o f the endogenous GA 3 , IAA and zea tin we re found in the m iddle and basa l parts
of the transgenic shoo ts than the contro l, this could be one o f the facto rs responsib le for the above described
mo rpho log icalmodifications.
Key words:Transgenic;C itrange;rol gene;RT-PCR;Morphology;Pn;Endogenous ho rmone
1　目的 、 材料与方法
枳橙 〔Citus sinensis (L. ) O sb. ×Poncirus trifoliate (L. )Ra.f 〕是枳与甜橙的杂种 , 是世界各生
产国广泛应用的砧木 , 生长势强。据报道 , 转 rol基因植物矮化性状突出。 Gentile等〔1〕获得了 5个转
rolA、 rolB、 rolC组合基因系 , 其中 B、 D、 E系在温室内的盆栽苗表现出明显的矮化特征。本试验对
其转 rol基因枳橙 B、 D、 E系的田间高接植株进行分子鉴定 、基因表达分析和田间形态及生理特性的
观测 , 以未经转化的通过相同再生体系获得的枳橙植株为对照 。 2003年所有转基因系和对照同时高
DOI牶牨牥牣牨牰牬牪牥牤j牣issn牣牥牭牨牫牠牫牭牫x牣牪牥牥牰牣牥牨牣牥牪牴
　1期 胡春华等:转 rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学特征的观测　
接于湖南农业大学果树教学基地 10年生枳砧温州蜜柑尾张树上 。以进一步了解其分子基础 , 转基因
的表达 、生长 、 生理特点 , 为砧木试验提供翔实参数。
改良 CTAB法 〔2〕提取叶片 DNA , 以携带 rolA、 rolB、 rolC基因的质粒 DNA为阳性对照 , 分别用各基
因的专一引物进行 PCR分析。 Trizo l试剂盒提取总 RNA。 B iosciences公司 Reandy-to-Go RT-PCR Beads试
剂盒进行 RT-PCR反应。反转录反应程序为 42℃ 25 m in, 随后用基因专一引物进行 PCR反应 。以失活
反转录酶反应为阴性对照 , 排除 DNA干扰 。同时以携带 rolA、 rolB、 rolC基因的质粒 DNA为阳性对照。
将转基因系及对照各分为 3组 , 3次重复 , 每组 3 ～ 5个枝条 , 从 2004年 4月 8日 ～ 8月 6日 ,
每半月测定 1次株高 。 8月 6日记录各组枝条的节间长度 、 分枝数量和叶面积 , 其中叶面积采用剪纸
称量法 〔3〕测定三出复叶的 3个小叶的总叶面积。最后数据取 3组平均值 。采用美国 LI-COR公司生产
的 Li-6400光合测定系统测定光合速率 (Pn)、 气孔导度 (G s)、 胞间 CO2浓度 (C i)和蒸腾速率
(Tr)等指标 。每个转基因系和对照各选 5根枝条 , 取春梢从上往下数第 3 ～ 4片完整功能叶片测定 ,
每一处理测定 5片叶 , 取平均值 。在生长季节各选取 5根嫁接在同一尾张树上生长一致的转基因和对
照枝条 , 分别在枝的上 、 中 、 下部取叶样 , 采用岛津 LC-9A型高效液相色谱系统测定吲哚乙酸
(IAA)、赤霉素 (GA 3)、 玉米素 (Z it)和脱落酸 (ABA)的含量。
2　结果与分析
2.1　转基因植株的分子鉴定
对 B、 D、 E 3个转化系分别用 rolA、 rolB、 rolC和 nptⅡ基因的特异性引物进行了 PCR检测 , 结
果显示各转化系都扩增出特异条带 , 与阳性对照一致 , 而阴性对照没有扩增出相应的条带 (图 1),
表明外源基因 rolA、 rolB、 rolC已经整合到枳橙基因组中 , 并在高接子代中稳定传递下来 。
图 1　转 rolA、 rolB、 ro lC、 np tⅡ枳橙 PCR分析
M:100 bpDNA分子量标记;CK +:阳性对照;B、 D、 E:转化株系;CK - :未转化植株对照。
F ig. 1　PCR analysis o f transgenic citrange plantsw ith ro lA , ro lB, rolC, nptⅡ prim ers
M:100 bp DNA m arker;CK +:P lasm id DNA;B, D, E:Tran sgen ic citrange clones;CK - :N on-transform ed p lants.
2.2　rol基因在枳橙基因组中的表达
应用 RT-PCR分析转化系 B、 D、 E和对照田间苗 , 只有 nptⅡ和 rolC基因有扩增片段 , 并且与质
粒 DNA的 PCR扩增片段相符 , 而 rolA和 rolB基因均未获得相应的 RT-PCR产物。当反转录酶失活
后 , 均无相应的 RT-PCR扩增片段 , 排除了 DNA的干扰。对照植株没有任何反应产物 (图 2)。以上
初步结果表明 nptⅡ和 rolC能在枳橙基因组中正常表达 , 而 rolA和 rolB基因虽然已转入枳橙基因组 ,
但在本研究的条件下未检测到表达信息。这可能与 rol转入基因的组分和是否出现基因沉默有关 。
2.3　转 rol基因枳橙的形态特征和生长习性
嫁接芽在 2004年 3月中 、下旬萌发 , 转化系与对照芽萌发时间相差无几 , 对照植株在 5 ～ 6月间
出现 1个生长高峰 , 整个生长季生长呈 “ S” 型曲线 。转基因植株 3个系植株在整个生长季长势缓
慢 , 生长曲线类似 , 几乎成一平缓的直线 。 7月下旬之后 , 高温干旱 , 植株基本停止生长。
B、 D、 E转化植株平均枝条长度分别是对照植株的 50%、 46%、 44% (图 3), 节间平均长分别
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园　　艺　　学　　报 33卷
只有对照枳橙节间长度 3.02 cm的 41%、 38%、
38%, 同时单枝平均节数增多 , 这与单转 rolC基
因节数减少的报道 〔4, 5〕不一致。对照叶具翼叶 ,
而转化叶几乎没有翼叶 。转化植株叶柄长约为对
照的 1 /3, 叶面积减少 , 以三出复叶面积计算 ,
转化系 B、 D、 E叶面积仅为对照的 31% ～ 32%
左右 , 3个转基因系之间叶面积无显著差异 (表
1, 图 3)。转化植株单芽平均萌发新梢 2.2个 ,
每根枝条至少具有 1个分枝 , 最多的有 8个分枝
(D系 ), 顶端优势减弱 , 而对照嫁接芽每芽主干
枝条没有分枝 , 表现出很强的顶端优势。
表 1　转基因植株主要形态特征指标的观测
Table 1　M orphologica l ob servation o f the transgen ic plan ts
株系
Sam p le
单枝平均节数
Number of
nodes
植株高度
P lan t heigh t
(cm)
节间长
Internode
length(cm)
叶面积
Leaf area
(cm2)
对照 C on trol 72B 223. 2A 3. 1A 39. 5A
B 93A 115. 4B 1. 3B 12. 3B
D 91A 102. 6B 1. 2B 13. 0B
E 81A 98. 6B 1. 2B 13. 0B
　　注:邓肯氏新复极差测验法检验 , α=0. 01。
Note:Duncans new mu ltip le range tes t, 1% leve.l
2.4　转基因植株光合特性的变化
测定结果表明 , 转基因植株具有较高的 Pn,
同时叶片 G s、 C i、 Tr等指标都比对照高 (表 2)。
说明转化植株的光合作用的适宜温度范围比对照
广 , 更能适应高温的环境 。
2.5　内源激素
转 rol基因枳橙内源激素发生了很大变化
(图 4)。GA 3含量在转化植株中 、 下部较顶部高 ,
对照则相反。转化 D、 E系各部分叶片 GA3含量
下部 , 较顶部高很多 。 B系中部较顶端和下部低 ,
但下部含量仍高于顶端 。GA 3在转化植株茎下部
含量相对高 , 有利于腋芽的萌发和侧枝的生长 ,
植株表现出分枝增多 、 矮化 。对照植株 GA 3上部
和中部较高 , 有利于植株的顶端生长 。转 rol基因
可能的矮化机理如果单从 GA3在植株中的梯度含
量看 , 下部的高浓度 GA 3有利于植株矮化 。生长
素在顶端和下部的含量 D、 E系植株与对照近似 , 但前两者中部含量比对照中部高 2倍多。 B系顶端和
中部生长素含量较对照植株同一部位都要低。有报道 〔6〕 , 单转 rolB基因能提高转基因植株内源生长素含
量 , 这与本试验 D、 E系转基因植株一致 , 但 B系植株相反。 Zit含量 3个转化系均高于对照 , 特别是 D
和 E中部叶片含量较对照高出 5倍以上。转 rol基因枳橙矮化原因之一很可能是 rol基因提高了植株
体内 Zit含量。据报道 〔7〕 , rolC基因具有类似细胞分裂素的生理效应 , 可能会提高体内活性态细胞分
裂素水平。 ABA含量 B与对照差不多 , D , E中部叶片含量较对照高 , 上部和下部叶片较对照低 , 没
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　1期 胡春华等:转 rol基因枳橙分子鉴定及部分生物学特征的观测　
有明显的变化规律。内源激素含量的改变 , 实际上可能是各个 rol基因分别表达产生的综合结果 。
表 2　光合特性测定结果
Table 2　The effect of transplants and w i ld plants on pho tosynthetic character
温度
T lea f(℃)
光强 PAPi
(μmo l m - 2 s- 1)
样品
Samp le
净光合速率 Pn
(μm ol m - 2 s - 1)
气孔导度 G s
(mm ol m - 2 s - 1)
胞间 CO 2浓度 C i
(μm ol m ol- 1)
蒸腾速率 T r
(mm ol m - 2 s - 1)
28 1 000 对照 Con trol 12.03 0. 06975 62. 666 1.37
B 11.41 0. 07655 98. 401 1.47
D 12.52 0. 07583 73. 812 1.51
E 13.17 0. 09447 110. 725 1.83
35 1 000 对照 Con trol 11.55 0. 08336 110. 100 2.38
B 12.52 0. 10266 137. 142 2.81
D 13.16 0. 11833 133. 001 2.98
E 15.12 0. 12433 134. 666 3.17
35 500 对照 Con trol 9. 48 0. 08860 164. 501 2.45
B 9. 17 0. 11847 210. 750 3.05
D 10.53 0. 10176 168. 333 2.64
E 9. 82 0. 10565 183. 333 2.76
图 4　不同部位叶片的内源植物激素
F ig. 4　Ana lys is of four endogenous horm one o f leaves in different position
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