全 文 ：第 33卷 第 1期 生 态 科 学 33(1): 106−112
2014 年 1 月 Ecological Science Jan. 2014

收稿日期: 2013-11-15; 修订日期: 2013-12-27
基金项目: 国家自然科学基金(31271397, 31170387, 31370435); 上海市闵行区科委项目(2011MH063); 国家海洋局极地科学重点实验室开放研究基金
资助项目(KP201107)。
作者简介: 许丽丽(1984—), 女, 博士研究生, 从事植物生理生态学及分子生物学方面的研究
*通信作者: 李德志, E-mail: dzli@des.ecnu.edu.cn; 吴双秀, E-mail: wushx@big.ac.cn

许丽丽, 王全喜, 吴双秀, 等. 转基因莱茵衣藻 hemHc-lbac 和根瘤菌共培养提高产氢培养条件的优化[J]. 生态科学, 2014,
33(1): 106−112.
XU Lili, WANG Quanxi, WU Shuangxiu, et al. Optimization of co-cultivation conditions of transgenic alga hemHc-lbac and
Bradyrhizobium japonicum for hydrogen production[J]. Ecological Science, 2014, 33(1): 106−112.

转基因莱茵衣藻 hemHc-lbac 和根瘤菌共培养提高
产氢培养条件的优化
许丽丽 1, 王全喜 3, 吴双秀 2,*, 李德志 1,*
1. 华东师范大学资源与环境科学学院环境科学系, 上海 200241
2. 中国科学院北京基因组研究所基因组科学与信息重点实验室, 北京 100101
3. 上海师范大学生命与环境科学学院生物系, 上海 200234

【摘要】 转基因莱茵衣藻 hemHc-lbac(transgenic Chlamydomonas reinhardtii hemHc-lbac)以不同比例与日本慢生大豆根
瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)混合, 在不同光照条件下进行产氢培养, 以确定产氢的最优条件和探索产氢提高的机
理。结果表明藻菌共培养的最优产氢条件为 25 ℃、光照 30 μE⋅m–2⋅s–1、生长至饱和期的菌和藻体积比为 1: 80, 产氢
量达到最大, 约为 278 μmol⋅mg–1Chl, 是对照组 80 μmol⋅mg–1Chl 的 3.5 倍。藻菌共培养提高产氢量的主要原因是体系
中氧气浓度的降低而使氢化酶活性提高、以及衣藻生物量的增加。该研究为利用藻菌共培养及转基因的方法提高微藻
光合生物制氢效率提供了重要实验基础。

关键词：转基因莱茵衣藻; 根瘤菌; 共培养; 产氢; 培养优化; 生物量
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2014.01.017 中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2014)01-106-07
Optimization of co-cultivation conditions of transgenic alga hemHc-lbac and
Bradyrhizobium japonicum for hydrogen production
XU Lili1, WANG Quanxi3, WU Shuangxiu2,*, LI Dezhi1,*
1. Department of Environmental Science, College of Resources and Environmental Science, East China Normal University,
Shanghai 200062, China
2. CAS Key Laboratory of Genome Sciences and Information, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100101, China
3. Department of Biology, College of Life and Environmental Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China
Abstract：Transgenic alga C. reinhardtii hemHc-lbac and bacterium Bradyrhizobium japonicum were co-cultivated with a
series of volume ratios and under a variety of light density, in order to determine the optimal culture conditions and to
investigate the mechanism for improvement of hydrogen production of the co-cultivation. The results showed that the optimal
culture conditions for highest hydrogen production of the co-cultures were with the volume ratio at 1: 80 and under 30 μE⋅m–2⋅s–1 of
light intensity for bacterial cultures to algal cultures at nearly saturated growth stage at 25 ℃. Under such condition, the
maximal hydrogen yield was 278 μmol·mg–1 Chl, approximately 3.5 times of that of the control. The reasons for the
1 期 许丽丽, 等. 转基因莱茵衣藻 hemHc-lbac 和根瘤菌共培养提高产氢培养条件的优化 107
improvement of hydrogen yield relied on decrease of oxygen content, increase of hydrogenase activity and enhancement of
algal biomass of the co-culture. These data provided important experimental information for improvement of micro-algal
hydrogen yield efficiency by employing the approach of co-cultivation of bacteria and algae in future studies.
Key words: transgenic algae; Bradyrhizobium japonicum; co-culture; hydrogen production; culture optimization; biomass
1 前言
随着工业社会的发展, 传统能源——煤、石油、
天然气大量消耗, 人们面临能源枯竭的危机, 同时,
化石燃料燃烧造成严重的环境问题。氢气能效高,
燃烧产物只有水无污染, 被认为是理想的可再生清
洁能源 [1] 。绿藻中的莱茵衣藻 (Chlamydomonas
reinhardtii)氢化酶活性高, 培养成本低, 遗传背景清
晰, 被认为是生物制氢的模式物种[2]。衣藻在有氧的
条件下并不产氢, 必须在厌氧的条件下其细胞内的
氢化酶(Hydrogenase)基因才被诱导表达, 然后运输
到叶绿体中, 接受来自光合电子传递链的电子, 将
H+还原为 H2 释放出细胞外, 同时合成少量 ATP, 这
是衣藻在缺氧胁迫条件下的一种生存方式[2−3]。由于
氢化酶是氧敏感的, 而氧气又是光合作用的副产物
导致氢化酶失活而大大降低了衣藻产氢效率, 是影
响衣藻产氢技术应用的关键[2]。某些含有固氮酶的
光合细菌可以利用有机质进行产氢代谢[4], 衣藻与
光合细菌共培养提高氢气产量的研究前人也曾报
道。1992 年, Miura 将莱茵衣藻与光合细菌共培养,
使产氢量提高 10 倍多[5]。2001 年, Hideo Kawaguchi
将海虹菌、食淀粉乳杆菌与杜氏盐藻和莱茵衣藻共
培养, 氢气产量提高了 15.5% [4]。2006 年, Kim 将莱
茵衣藻与梭菌和球形红细菌KD131共培养提高产氢,
产量提高 2—10 倍[6]。2006 年, Melis 将莱茵衣藻与
光合细菌(红螺菌和梭状芽孢杆菌)共培养进行产氢,
产量提高约 5 倍[7]。日本慢生大豆根瘤菌(Bradyrh-
izobium japonicum)是一种好氧性的杆状细菌, 可以
和大豆共生形成根瘤, 使同样对氧气敏感的固氮菌
发挥高效固氮作用[8]。吴双秀等[9]曾尝试将根瘤菌
与莱茵衣藻藻株 cc849 及其转基因藻 lba 共培养,
使产氢量提高了 4.5—13 倍, 是提高衣藻产氢效率
研究是新尝试。基于此, 为了进一步探究藻菌作用
提高产氢的机制, 本研究将根瘤菌与转基因莱茵
衣藻株 hemHc-lba(transgenic Chlamydomonas reinh-
ardtii hemHc-lbac)共培养, 寻找最适的藻菌培养及
产氢条件, 并检测衣藻生长和氢化酶活性, 初步探
索产氢量提高的原因, 为实现微藻光合生物制氢技
术的应用奠定实验基础。
2 材料与方法
2.1 实验材料及其培养方法
转基因莱茵衣藻hemHc-lbac是在细胞壁缺陷型
莱茵衣藻(C. reinhardtii)cc849叶绿体中异源表达了
密码子优化后的豆血红蛋白基因hemH和lba基因,
由吴双秀提供[10]。其正常培养条件为(25±1) , ℃ 水平
摇床转速120 r·min–1, 光照强度为0—200 μE·m–2·s–1,
培养基为Tris-Acetate-Phosphate (TAP) (pH 7.0), 液
体培养每5天继代1次, 接种量为1%; 固体TAP培养
基含1%的琼脂, 藻种的纯化和保存是以藻液或单克
隆通过划线方法接种在TAP琼脂平板上, 每2周继代
1次[11]。衣藻产氢培养所用的缺硫培养基为正常TAP
培养基内的硫酸镁、硫酸铁、硫酸铜和硫酸锌分别
用等摩尔的氯化物来替换, 简称TAP-S[10−11]。
日本慢生大豆根瘤菌(B. japonicum)购于中国农业
大学。培养条件为(28±1) ,℃ 水平摇床转速200 r·min−1,
遮光, 培养基为yeast extract-mannitol (YEM) (pH 7.2),
液体培养每2天继代1次, 接种量为1%; 固体YEM培
养基含1%的琼脂, 菌种的纯化和保存是以菌液或单
克隆通过划线方法接种在平板上, 每3周继代1次[9]。
2.2 衣藻的生长及叶绿素含量检测
衣藻在750 nm处的吸光度(OD750)与其细胞数正
相关, 因此以OD750值来表示衣藻的生长情况[11]。所
用分光光度计为TU-1901双光束可见-紫外光分光度
计。衣藻叶绿素含量的测定是用95%酒精萃取, 测定
OD665及OD649值, 根据下列公式计算出叶绿素a和叶
绿素b及总叶绿素的含量, 单位是mg·L–1[11]。
Chl= Chla+ Chlb= 6.10×A665 + 20. 04×A649
2.3 藻菌共培养
2.3.1 藻菌产氢共培养
生长接近饱和期的莱茵衣藻的 OD750值约为 3.0,
108 生 态 科 学 33 卷
6000 rpm 离心 5 min, 藻沉淀用 TAP-S 培养基洗 3
次, 然后转移至 55 mL 的玻璃管中, 加入 TAP-S 培
养基 40 mL 将衣藻叶绿素浓度定为 0.5 mg·L–1。培养
至对数中后期的大豆根瘤菌的OD600值约为 1.0, 离
心后也用 TAP-S 培养基洗 3 次, 定容至 OD600 仍然
为 1.0, 按照不同的菌藻体积比 1: 200、1: 80、1: 40
和 1: 20 分别加入已装有衣藻的玻璃管中, 用橡胶
塞密封瓶口, 纯根瘤菌和纯衣藻分别作为空白对
照。分装好的样品在(25±1)℃、黑暗培养 24 小时后
分 别 放 到 30 μE·m–2·s–1 、 60 μE·m–2·s–1 、 100
μE·m–2·s–1 和 200 μE·m–2·s–1 的光照下培养。每隔 1
天检测样品的氢气及氧气含量变化。
2.3.2 根瘤菌对衣藻生长的影响
将 OD600 值约为 1.0 的根瘤菌离心后用 TAP 培
养基洗 3 次, 按照实验 2.3.1 中得到的最优产氢条件
和最优菌藻混合比例(1:80), 混合于 TAP 培养基中
共培养, 每天检测衣藻的生长及叶绿素含量, 只含
有衣藻的样品作为空白对照组。
2.4 氢气和氧气含量测定
用气密性好的微量进样器从样品中抽取气体,
注入气相色谱仪(gas chromatography, GC), 检测氢气
和氧气含量。检测条件为: GC设备为AgilentTM 7890,
TCD热导检测器,5A分子筛色谱柱2 m×1/8 mm, 载
气为氩气, 流速20 mL·min−1, 进样口温度200 , ℃ 柱
温50 ,℃ 检测器300 , ℃ 进样量0.5 mL[9−10]。
2.5 氢化酶活性测定
在指定的时间点用微量取样器取5 ml冲氩厌氧
处理过的藻菌共培养液体, 快速注入厌氧管中, 用
橡胶塞密封瓶口, 放置在160 r·min−1的摇床上, 25 , ℃
100 μE·m–2·s–1反应1小时, 然后用气相色谱测氢气产
量, 计算每小时每纳克叶绿素的衣藻产生氢气的量, 即
为体内氢化酶的活性[9]。将冲氩厌氧处理过的1 mL的
样品加入到装有1 mL 50 mmol·L–1缓冲液 (含10
mmol·L–1甲基紫精、0.2%体积比Triton X-100的磷
酸缓冲液)和200 μL 100 mmol·L–1连二亚硫酸钠
(Na2S2O4)溶液的厌氧管中。黑暗条件下37 ℃震荡
水浴60 min。用气相色谱检测厌氧管中的氢气产量,
计算出每小时每纳克叶绿素的衣藻氢气产量, 即为
体外氢化酶的活性[12]。
2.6 显著性检验
实验组和对照组的氢气产量或者氢化酶活性的
显著性差异分别采用独立样本t检验的方法, 显著性
水平设定为p-value＜0.05, 显著性差异的结果用*标
注在相应的图中, 所有数据处理过程均在SPSS 17.0
中完成。
3 结果
3.1 藻菌共培养后不同条件下的氢气产量和氧气
消耗情况
25 ℃条件下, 转基因藻与不同比例的根瘤菌共
培养后在不同光照下的氢气产量和氧气消耗结果如
图 1 所示。只有根瘤菌的体系在任何条件下都检测
不到氢气的产生。在 30 μE·m–2·s–1光照下, 根瘤菌与
衣藻按照 1: 200, 1: 80, 1: 40, 1: 20 的比例共培养后,
氢气最大值分别约为 120 μmol·mg–1Chl 、 278
μmol·mg–1 Chl、91 μmol·mg–1Chl、85 μmol·mg–1Chl,
分别是对照组 (纯藻的培养体系 )最大产氢量 (80
μmol·mg–1Chl)的 1.5 倍、3.5 倍、1.1 倍、1.0 倍, t 检
验结果显示在第 13、15、17、19、21 天, 最高产氢
量与对照组间存在显著性差异(p < 0.05)(图 1a)。黑
暗培养 24 小时后, 体系内氧气含量迅速下降, 分别
为 3.7%、2.6%、2.7%和 1.8%, 之后保持在较低水平,
约 3.5%; 而对照的氧气含量为 14.6%, 之后逐步下
降, 第 7 天之后达到最低值, 约为 5.7%(图 1b)。
在 60 μE·m–2·s–1光照下, 根瘤菌与衣藻按照 1: 200,
1: 80, 1: 40, 1: 20 的比例共培养后, 氢气累积量的最
大值分别为 143 μmol·mg–1Chl、139 μmol·mg-1Chl、
111 μmol·mg–1Chl、90 μmol·mg–1Chl, 分别是对照组
最大产氢量(83 μmol·mg–1Chl)的 1.7 倍、1.6 倍、1.3
倍、1.1 倍, t 检验结果显示在第 17、19、21 天, 最
高产氢量与对照组间存在显著性差异(p < 0.05)(图
1c); 在黑暗培养 24 小时后, 其氧气含量分别迅速下
降到 2.9%、2.3%、2.0%和 1.7%, 之后保持在 3.2%
左右的水平, 而对照组的氧气含量只下降到 13.1%,
直到第 7 天以后才逐渐降到 6.7%的水平(图 1d)。
在 100 μE·m–2·s–1 光照下, 根瘤菌与衣藻按照 1:
200, 1: 80, 1: 40, 1: 20 的比例共培养后, 氢气累积量的
最大值分别为 115 μmol·mg–1Chl、215 μmol·mg–1Chl、
122 μmol·mg–1Chl、99 μmol·mg–1Chl, 是对照最大产氢
量(83 μmol·mg–1Chl)的 1.4 倍、2.6 倍、1.5 倍、1.2
倍, t 检验结果显示在第 17、 19、21 天, 最高产氢
量与对照组间存在显著性差异(p < 0.05)(图 1e)。在
黑暗 24 小时后氧气含量迅速下降, 分别为 3.6%,
1 期 许丽丽, 等. 转基因莱茵衣藻 hemHc-lbac 和根瘤菌共培养提高产氢培养条件的优化 109
2.9%, 2.8%, 1.9%, 之后保持在 3.7%以下的低水平,
而对照组的的氧气含量只下降到 14.2%, 直到第 9
天以后才逐渐降到 7.7%的水平(图 1f)。
在 200 μE·m–2·s–1 光照下, 根瘤菌与衣藻按照 1:
200, 1: 80, 1: 40, 1: 20 的比例共培养后, 氢气累积量
的最大值分别为 80 μmol·mg–1Chl、79 μmol·mg–1Chl、
75 μmol·mg–1Chl、74 μmol·mg–1Chl, 是对照最大产氢
量(50 μmol·mg–1Chl)的 1.6 倍、1.6 倍、1.5 倍和 1.4
倍, t 检验结果显示在第 17、19、21 天, 最高产氢量
与对照组间存在显著性差异(p < 0.05)(图 1g)。在黑暗
24 小时后体系内氧气含量迅速下降, 分别为 3.7%,
3.8%, 3.5%, 2.8%, 之后保持在 3.2%—4.4%的水平,
而对照的氧气含量在 24 小时黑暗培养后只下降到
14.1%, 直到第 7 天以后才逐渐降到 7.6%的较低水
平(图 1h)。
综上所述, 根瘤菌(OD600=1.0)与培养至接近饱
和期的衣藻在 30 μE·m–2·s–1 光照下, 体积比为 1:80
时, 氢气产量为最大值 278 μmol·mg–1Chl, 是纯藻培
养体系 83 μmol·mg–1Chl 的 3.5 倍(图 1a), 这是藻菌
共培养的最优产氢条件。
3.2 最优产氢条件下衣藻的氢化酶活性测定
衣藻产氢是由氢化酶直接催化的[3], 为了研究加
入根瘤菌使衣藻氢气产量提高的原因, 我们进一步检
测了衣藻体外和体内的氢化酶活性。结果如图 2 所示:

图 1 转基因藻与根瘤菌按不同比例混合共培养体系在不同光照下的氢气产量和氧气消耗的变化
Fig. 1 H2 production and O2 consumption of pure transgenic algae and its co-cultivation with different proportion of B.
japonicum under different intensity light
110 生 态 科 学 33 卷

图 2 转基因藻及其与根瘤菌共培养后体外氢化酶活性(a)和
体内氢化酶活性(b)的变化
Fig. 2 in vivo (a) and in vitro (b) H2ase activity of
transgenic algae and its co-cultivation with B. japonicum
under 80:1 volume-ratio condition
加入根瘤菌后共培养的衣藻体外和体内的氢化酶活性
都比未加入根瘤菌的活性有所增高。未加入根瘤菌的衣
藻体外氢化酶最高活性约为 27.6 nmol H2·μg Chl–1·h–1,
与根瘤菌共培养的衣藻的体外氢化酶最高活性提高
了 1.1 倍, 约为 57.9 nmol H2· μg Chl–1·h–1, t 检验结果
显示在第 3、4、6、7、8 d, 实验组与对照组间存在
显著性差异(p < 0.05)。未加入根瘤菌的衣藻体内氢化
酶最高活性约为 16.6 nmol H2·μg Chl–1·h–1, 而与根瘤
菌共培养的衣藻体内氢化酶最高活性约为25.3 nmol
H2·μg Chl–1·h–1, 是纯藻培养的 1.5 倍, t 检验结果显
示在第 3、4、6、7 d, 实验组与对照组间存在显著
性差异(p < 0.05)。
3.3 藻菌共培养后衣藻的生长情况
随着培养时间的增加, 无论是加入根瘤菌的衣
藻还是未加入根瘤菌的衣藻其 OD750 值和叶绿素含
量都有所增长, 但是加入根瘤菌后共培养的衣藻的
OD750 值和叶绿素含量都比未加入根瘤菌的衣藻有
明显增加(图 3)。共培养前衣藻的 OD750 值约为 1.08,
加入根瘤菌后共培养的第 3 天达到最大值, 约为
5.92, 而未加入根瘤菌的衣藻在第 5 天的 OD750值达
到最大值, 约为 3.63(图 3a)。共培养前的衣藻叶绿素
含量都是约为24.62 mg·L–1, 加入根瘤菌共培养后第
4 天达到最大值为 67.77 mg·L–1, 未加根瘤菌的衣藻
在第 5 天达到最大值为 38.95 mg·L–1 (图 3b)。

图 3 转基因藻及其与根瘤菌共培养的生长曲线(a)和叶绿素
含量变化(b)
Fig. 3 Growth curves (a) and kinetics of chlorophyll
contents (b) of pure transgenic algae and its co-cultivation
with B. japonicum.
4 讨论
目前国际上提高衣藻氢气产量的方法主要有以
下4种: (1)减少光系统 II的放氧: 主要手段有培养基
中去除硫元素、添加光合抑制剂如 DCMU、NaHSO3、
CCCP 等方法[2,13−14]。(2)筛选突变株: 利用基因工程
手段筛选高产氢突变体, 目前已经得到一些有意义
的突变株如 stm6 提高了 5—13 倍[15], T1 提高了近 7
倍[16], 并进行了产氢代谢机理的研究。(3)改造衣藻
氢化酶氧耐受性: 由于衣藻氢化酶的三维晶体结构
还没有得到很好的诠释, 对衣藻氢化酶的改造未取
得突破性进展。(4)进行培养条件的优化调控, 如光
照、pH 等[17−18]。前期, 我们将密码子优化后的豆血
红蛋白基因 hemH、lba 转入衣藻叶绿体中获得转基
因藻 hemHc-lbac, 氢气产量提高了 6.8倍[10], 在此基
础我们将转基因藻 hemHc-lbac与大豆根瘤菌共培养,
进行培养条件的优化以期望在环境友好的基础上更
进一步提高氢气的产量并初步揭示藻菌共培养氢气
产量提高的机理。
衣藻氢气产量及其生物量与培养光照有着密切联
系[17], 因此本实验设置了 30 μE·m–2·s–1、60 μE·m–2·s–1、
100 μE·m–2·s–1 和 200 μE·m–2·s–14 个光照梯度进行培
养条件的筛选。细菌对藻细胞增殖的影响与细菌的
浓 度 及 生 长 阶 段 有 关 [19], 因 此 我 们 选 取 了
OD600=1.0的根瘤菌, 1:200, 1:80, 1:40, 1:20, 4个不同
1 期 许丽丽, 等. 转基因莱茵衣藻 hemHc-lbac 和根瘤菌共培养提高产氢培养条件的优化 111
的菌藻混合比例。将转基因藻 hemHc-lbac 与根瘤菌
共培养后, 在不同的培养条件下, 体系中的氧气含量
都比未加入根瘤菌的体系低, 而相应的氢气含量都
有所增加, 最优的产氢培养条件光照为 30 μE·m–2·s–1,
菌藻体积比为 1:80, 氢气产量为 278 μmol·mg–1Chl,
是纯藻培养体系的 3.5 倍(图 1a), 是对照藻 cc849 在
最佳培养条件 60 μE·m–2·s–1 光照, 菌藻体积比 1:100
时最大产量 15 μmol·mg–1Chl 的 18.5 倍[9]。
衣藻的生物量与氢气产量有直接关系, 为了探
究在最优条件下氢气产量提高的原因, 本实验检
测了最优藻菌培养条件下转基因藻的750 nm吸光
值及叶绿素含量变化, 结果显示转基因藻与一定
比例的根瘤菌混合后其生长、叶绿素含量并未受
到抑制反而有所升高。衣藻氢气产量与氢化酶活
性正相关, 本实验进一步检测了最优产氢条件下
转基因藻的体外及体内的氢化酶活性, 结果显示
转基因藻与根瘤菌共培养后其氢化酶活性并未受
到抑制反而有所增高。由此可知, 共培养体系中氧
气含量降低导致的氢化酶活性增高是氢气产量提
高的直接原因, 而衣藻生物量的提高是氢气产量
提高的一个重要原因。
细菌分泌的维生素、酶类、糖肽类物质可以
促进藻类的生长, 微藻分泌的氨基酸等物质可以
刺激细菌的生长[20], 细菌和藻类存在着复杂的生
态关系。Ietswaart 等[21]发现, 缺陷假单胞菌和泡囊
假单胞菌可以促进栅藻和小球藻的生长。本实验
发现根瘤菌可以提高衣藻的生物量, 我们推测加
入的根瘤菌可能分泌了酶或者某些维生素促进了
衣藻生长 , 根瘤菌是一种固氮菌 , 也有可能为藻
类的生长提供了氮源促进了藻类生物量提高, 同
时藻类代谢产生的某些糖类或者是酸类为根瘤菌
提供了代谢底物。根瘤菌对衣藻的代谢有何影响,
衣藻与根瘤菌的细胞活性、分布格局及生态关系,
这些问题还有待遇于通过进一步检测共培养体系
中的物质及细胞活性来解决, 这也是我们正在进
行工作。前期的数据为利用藻菌共培养及转基因
的方法提高微藻光合生物制氢效率提供重要实验
基础。
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