全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):39-47
MicroRNA（miRNA） 是 一 类 内 源 性 的 非 编 码
RNA，具有调控功能，广泛存在于真核生物中，其
大小长约 20-25 个核苷酸。多数 miRNA 还具有高
度保守性、时序性和组织特异性［1-3］。到目前为止，
在人类基因组中已发现超过 1 000 种 miRNAs［4］，因
其具有抑制靶 mRNA 转录、翻译或者能够剪切靶
mRNA 并促进其降解的功能，所以在人类多种生物
过程中起着至关重要的作用，如细胞生长、分化、
凋亡和增殖等过程［5］。现在许多研究表明，miRNAs
的异常表达与许多癌症相关，如肺癌、肝癌、胃癌、
乳腺癌、结肠癌和卵巢癌等［6］。这些 miRNAs 所起
的作用类似于抑癌基因和癌基因的功能［7］，因此有
收稿日期 ：2015-07-08
作者简介 ：陈珍珠，女，硕士，研究方向 ：生物医学工程 ；E-mail ：zzchen_seu@163.com
高选择性和高灵敏度的 microRNA 检测技术的
研究进展
陈珍珠  李蕊  田飞  沈彦婷  葛芹玉
（东南大学学习科学研究中心，南京 210096）
摘 要 ： microRNA（miRNA）是一类内源性的具有调控功能的非编码 RNA，在多种细胞过程中起重要的调节作用，如细胞
发育、脂肪代谢、器官生成、细胞分化及细胞凋亡等。研究表明，miRNA 的表达水平变化与肿瘤、糖尿病等多种疾病的发生发展
密切相关，因此对于 miRNA 表达水平进行准确快速的检测是对其进行深入研究的前提。目前 miRNA 的检测分析技术众多，但是
对于 miRNA 多态性和突变的检测技术还不甚成熟，而且生物样本中微量 miRNA 检测技术的灵敏度亦需要进一步的发展与突破。
就近年来 miRNA 的高选择性和高灵敏度的检测方法进行了综述，旨为相关的检测技术进一步研究提供重要帮助。
关键词 ： miRNA ；检测方法 ；高选择性 ；高灵敏度 ；基因调控
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.005
Research Progress on miRNA Detection Techniques with High
Sensitivity and High Selectivity
CHEN Zhen-zhu LI Rui TIAN Fei SHEN Yan-ting GE Qin-yu
（Research Center for Learning Science，Southeast University，Nanjing 210096）
Abstract: microRNAs（miRNAs），a class of small，endogenous and non-coding RNAs，play critical regulatory functions in many cell
processes such as cell development，fat metabolism，organs generation，cell differentiation and apoptosis，etc. Researchers have discovered
that the dysregulation of miRNA expression is closely associated with various diseases including human cancers and diabetes. Therefore，the
prompt and accurate detection of miRNA expression is the prerequisite for the further researches on it. Many assays for miRNA detection have
recently been developed，but the detection techniques for polymorphism and mutation of miRNA are not so mature. Furthermore，the sensitivity
for detection technology of microscale miRNA in biological samples also needs further development and breakthroughs. The new developed
miRNA detection techniques with high selectivity and high sensitivity are reviewed in this paper，and then this may provide important assistance
for further study on the related detection technologies.
Key words: miRNA ；detection method ；high selectivity ；high sensitivity ；gene regulation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.440
研究人员将 miRNA 命名为“oncomirs”。miRNAs 被
用于有价值的标志物在早期的癌症诊断和预后中，
研究 miRNA 的表达水平及其生物学功能，对探索生
物进化及防治人类疾病具有重要意义［8］。
在过去的一段时间，由于其特殊的生物学功
能，miRNAs 检测技术的研究受到了广泛关注，同
时亦有大量相关文章发表，从印迹杂交、微阵列芯
片检测到最近发展起来的一些基于信号扩增技术在
内的等一系列 miRNA 检测方法被大量报道。印迹杂
交技术（northern blotting）是用于 miRNAs 检测分析
的最为经典的方法之一［9-12］。很多专家学者对其进
行了发展优化，在一定程度上解决了 miRNA 在传统
northern blotting 时因其序列短，所引起杂交效率与
检测灵敏度的问题［13-15］。但是该方法存在一些缺点，
如灵敏度较低、操作过程繁琐、检测时间长、检测
范围窄、容易污染等。微阵列基因芯片技术［16，17］
是 20 世纪 90 年代发展起来的高通量检测技术，虽
然具有高通量、高灵敏度、高特异性等优点，但检
测所用试剂和设备费用高，且该方法对多个 miRNAs
的 量 化 存 在 困 难。 聚 合 酶 链 式 反 应（polymerase
chain reaction，PCR）技术［18］是体外快速扩增特定
基因最经典和最广泛应用的方法，其中反转录聚合
酶链式反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）在
miRNA 的检测中亦被广泛的研究及应用。目前主要
采用引物延伸 RT-PCR、茎环引物 RT-PCR［19，20］和
miRNA 加尾 RT-PCR［21，22］等方法进行 miRNA 的定
性和定量检测。尽管这些传统的检测技术基本能够
进行 miRNA 的检测，而且许多研究者从不同角度进
行了这样那样的优化研究，以此弥补传统检测技术
带来的缺陷。但是考虑到 miRNA 检测的特异性和灵
敏度的问题，这些已有的方法仍然需要进一步优化。
由于 miRNA 具有序列短、低丰度及家族成员
间的高度保守性等性质，致使其检测难度增加，同
时也增加了人们对于其检测方法进行深入研究的兴
趣。由于 miRNA 的检测对于医学及分子生物学都有
着非常重要的意义，在很多临床研究中，需要针对
一些与癌症相关的基因进行检测。由于 miRNA 在临
床研究中获取难度很大，而且 miRNA 的稳定性较差，
放置时间不宜过长，在一定程度上增加了其检测难
度，所以提高检测特异性和灵敏度是 miRNA 检测面
临的一大挑战［23］。同时，miRNA 的表达调控比较
精细，同一基因可能受不同 miRNA 的调节，对应的
同一 miRNA 也可能控制着多种基因的表达，如若想
更好的将 miRNA 应用于临床研究中，则需要精确地
区分 miRNA 的结构和长度等信息，这也成为了当前
miRNA 检测的另一大技术难题。
近年来已有大量的文章涉及了这方面的工作，
也有学者对 miRNA 的检测方法做了综述，但是关
于高选择性和高灵敏度的 miRNA 检测技术的概括
还不甚全面。本文主要从基于信号放大的等温扩增
技术和电化学检测技术用于高选择性和高灵敏度的
miRNA 的检测着手进行了系统性总结，以便于人们
对于其检测技术有更深层次的认识和了解，从而明
确 miRNA 的研究进展及研究方向，为更加充分的研
究和利用 miRNA奠定基础。
1 高选择性和高灵敏度的 microRNA 检测技
术
1.1 基于信号放大的等温扩增技术用于高选择性
和高灵敏度的microRNA的检测
由于 miRNA 检测的传统技术在选择性和灵敏
度上需要进一步提高，所以一些学者在提高 miRNA
的选择性和灵敏度上做了大量的工作，也报道了
一些相关文献，如表 1 所示。这些新的检测技术将
miRNA 的检测提高到了一种新的层次，从而推动了
miRNA 在临床中的应用。
一些学者在已有的 miRNA 检测技术上做了改
进，从而大大提高了 miRNA 检测的特异性和灵敏度。
Cui 等［24］提出了在 T7 核酸外切酶协助下利用滚环 -
循环酶双扩增法（RCA-CEAM）检测 miRNAs，如
图 1 所示。RCA-CEAM 法是将 RCA（滚环扩增）与
CEAM（循环酶扩增）结合起来的一种高选择性和
高灵敏度的 miRNA 检测方法。该方法为了减少背景
信号，在 CEAM 环节中采用特定设计的线性分子信
标（linear molecular beacon，LMB）作为报告探针。
其检测限低至 12 fM，而传统的 RCA 法的检测限为
10 pM。与此同时，这种方法成功的应用于肝癌细胞
和正常肝细胞的 let-7a 的表达水平的检测，很好地
证明了其在早期癌症诊断中的潜在应用。Ge 等［25］
提出基于靶细胞引发的滚环扩增 - 荧光原位检测
2016,32(4) 41陈珍珠等 ：高选择性和高灵敏度的 microRNA 检测技术的研究进展
法（TPRCA-FISH）。该方法采用 circular DNA 作为
探针与 miRNA 靶细胞进行原位杂交，随后 miRNA
游离的 3 末端引发了原位 RCA 反应，扩增产物可
以与荧光探针进行杂交，以此来高灵敏度的指征
靶 miRNA 的存在。该技术中 RCA 反应只能由成熟
miRNA 的游离的 3 末端引发，从而消除了 miRNA
前体或 mRNA 的干扰作用。这种方法被用于在人类
肝癌细胞 SMMC-7721 和肝细胞 L02 中的 miR-222 表
达水平的检测，显示其高灵敏性和强选择性的检测。
此外，该方法中 RCA 产物与荧光探针杂交，产生的
信号很强，能够很容易的从背景信号中区分出来，
可利用普通的荧光显微镜检测，能够很好地检测低
图 1 RCA-CEAM 双扩增技术用于 miRNA 的高灵敏检测的工作原理图［24］
丰度的 miRNA。
恒温指数扩增模式（IEXPAR）是利用线性扩
增的寡核苷酸产物来产生更多与引物序列相同的寡
核苷酸序列，从而产生指数放大效果，该方法扩增
效率高。在此基础上 Yin 等［26］提出了采用分子信
标的方法用于 miRNA 的检测，这是一种新发展起
来的简单且可一步完成的反应。这种方法是运用荧
光分子信标（MB）固有的信号传导机理，构成一个
表 1 基于信号放大的等温扩增技术用于 miRNA 的检测
序号 简述 目标 miRNA 检测限 参考文献
1 基于化学杂交反应与杂交信号放大链反应相结合用于 miRNA 的等温无酶检测 miR-141、miR-200 家族 0.55 fmol ［28］
2 基于目标引发的三向连接结构和聚合酶 /Nicking 酶协同作用的等温二次 DNA
机用于 miRNA 的检测
let-7 家族 2 amol ［29］
3 通过循环酶修复的等温核酸扩增技术用于 miRNA 的检测 miR-21 0.1 fM ［30］
4 基于发夹荧光探针的等温扩增技术用于 miRNA 的检测 Let-7a 8.5 fM ［31］
5 基于 double-nicked 信标介导等温扩增（BAMP）用于核酸检测 Let-7a 0.1 zmol ［32］
6 在 T7 核酸外切酶协助下的滚环 - 循环酶双扩增法（RCA-CEAM） let-7a 12 fM ［24］
7 基于靶细胞引发的滚环扩增 - 荧光原位检测法（TPRCA-FISH） miR-222 无 ［25］
8 基于锁式探针的恒温指数滚环扩增技术（P-ERCA）用于 miRNA 的检测 Let-7a 0.24 zmol ［27］
9 基于发夹探针的信号增强的等温扩增用于 miRNA 的检测 miR-21 400 aM ［33］
10 基于 G- 四联体 DNA 酶催化的等温指数扩增技术用于 miRNA 的检测 miR-200 家族、miR-141、
let-7b
1 fM ［34］
11 采用 DNA 聚合酶与 Nicking 核酸内切酶的信号放大反应用于 miRNA 的检测 miR-141 1 fM ［26］
12 由哑铃探针所介导的级联等温扩增反应用于 miRNA 的检测 let-7a 1 zmol ［35］
13 一个自制 DNA 回收机的输出作为输入 miR-122b 20 amol ［36］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.442
“生物回路”，包含两个反应 ：由 Nicking 核酸内切
酶协助的等温扩增反应和用于引发 MB 扩增反应及
信号传导的链置换聚合反应。该反应的检测动态限
为 1 fM-100 nM，具有较高的灵敏性和特异性。Liu
等［27］提出了基于锁式探针的恒温指数滚环扩增技
术（P-ERCA）用于 miRNA 的检测，其中该锁式探
针由与 miRNA 的杂交序列和 Nicking 核酸内切酶的
Nicking 位点组成，大大提高了反应的特异性和灵敏
度，其检测限降至 0.24 zmol。
1.2 电化学检测技术用于高选择性和高灵敏度的
microRNA的检测
生物传感器利用生物物质作为识别元件，将特
异性的生化反应转换成可识别的信号，从而能够进
行生命物质和化学物质检测和监控的器件［37］。电化
学生物传感器具有高效、灵敏快速、简便等特点，
因此基于电化学技术的 miRNA 生物传感器具有独特
的优势。电化学生物传感器是将肽核酸固定在硅纳
米线（SiNWs）的表面上作为检测 miRNA 的探针，
当与 miRNA 进行杂交时，将会引起 SiNWs 界面电
阻的变化，其变化值与 miRNA 浓度相关［38］。对于
电化学生物传感器，控制识别探针在表面的密度和
位置是一大挑战 ；信号扩增的效率和灵敏度是电化
学检测技术的另一大挑战。表 2 列出了近年来研究
者提出并发展的一些基于电化学技术的 miRNA 检测
方法。
1.2.1 基于纳米粒子放大的电化学检测技术 Cheng
等［39］ 提出了一种基于 CdTe 纳米晶体和 Au 纳米
簇（AuNCs）的电化学能量共振转移技术，在连接
酶的作用下进行 miRNA 的检测，如图 2 所示。其中
CdTe 纳米晶体作为电化学发光的供体，而 AuNCs
作为电化学发光的受体。其基本原理为 ：首先合成
AuNCs 功能化的发夹结构的 DNA，然后在玻璃碳
表 2 电化学检测技术用于 miRNA 的检测
序号 简述 目标 miRNA 检测限 参考文献
1 在 Au 电极上的变构分子信标电化学生物传感器 Let-7a 13.6 aM ［46］
2 铟锡氧化物包覆的玻璃电极电化学生物传感器 无 2 fM ［47］
3 CdTe 纳米晶体和 Au 纳米簇（Au NCs）的电化学能量共振转移生物传感器 无 21.7fM ［39］
4 Hg2+ 介导的构象的分子信标和以 Ag 纳米簇（AgNCs）为荧光团的生物传感器 无 1fM ［40］
5 采用四面体 Au 纳米结构探针的电化学生物传感器 miR-122b 10aM ［41］
6 无标记的功能化变构分子信标用于的 miRNA 检测的电化学生物传感器 Let-7a 3.4fM ［42］
7 第三代 E-DNA 传感器 miR-141 1fM ［43］
8 基于拱形探针所介导的等温指数放大反应的电化学生物传感器 miR-21 5.36 fM ［44］
9 DNA 酶捕获探针的磁珠上裂解下来的电化学生物传感器 Let-7 家族 0.8 aM ［45］
10 一种无标记的电化学生物传感器用于 miRNA 的检测 let-7 家族 2 fM ［48］
11 基于 DNA 催化和 miRNA 介导形成的绝缘聚合物薄膜的一种 miRNA 检测传感器 let-7 家族 5 fM ［49］
12 一种可控磁性电化学生物传感器用于 miRNA 的检测
hsa-miR-200a、hsa-miR-
142-3p hsa-miR-93 等
0.22 aM ［50］
13 高选择性和高灵敏度的电化学生物传感器直接用于血清中 miRNA 的检测 let-7 家族 1 fM ［51］
14 基于生物条形码和氯化血红素 /G- 四联体 DNA 酶对于 miR-21 的电化学检测 miR-21 6 fM ［52］
15 基于导电聚合物纳米结构的碳纳米管的电化学检测法用于 miRNA 的检测 miR-141 8 fM ［53］
16 基于 DNA 串联体的高灵敏性电化学检测技术 miRNA-21 100 aM ［54］
17 碳纳米管场效应晶体管的电化学检测技术 miRNA-122a 1 aM ［55］
18 基于四通连接构造的高灵敏度的电化学检测技术用于 miRNA 的检测 miR-122 2 aM ［56］
19 通过连接酶链反应和量子点条形码结合用于 miRNA 检测的电化学分析技术 miR-155、miR-27b 12 fM ［57］
20
基于多功能金纳米粒子，酶和氧化还原循环反应的三重信号扩增的电化学检测技
术用于 miRNA 的检测
miRNA-21 3 fM ［58］
21 基于模拟的酶催化体系的电化学生物传感器用于 miRNA 的检测 miR-159a 170 fM ［59］
22 基于磁珠的杂交分析的电化学检测技术用于 miRNA 的检测 miRNA-522 无 ［60］
23 基于 miRNA 介导的聚苯胺的沉积作用的高灵敏性的电化学生物传感器 let-7b 0.50 fM ［61］
2016,32(4) 43陈珍珠等 ：高选择性和高灵敏度的 microRNA 检测技术的研究进展
电极上通过酰胺反应结合到羧酸化的 CdTe 纳米晶
体上。当只有 miRNA 存在时，杂交作用可直接将
发夹结构的 DNA 打开，这时由于 CdTe 纳米晶体和
AuNCs 之间的距离很近，使得能量传递受到影响，
进而致使电化学发光信号很弱。而当 miRNA 和协助
DNA 同时存在时，连接酶能够选择性连接两者到发
夹结构的 DNA 链上，以形成长的 DNA-RNA 异源杂
交双链。较长的链抑制了 CdTe 纳米晶体和 AuNCs
之间的能量传递，从而大大增强了电化学发光信号，
很好的提高了 miRNA 的检测灵敏度。该检测方法的
线性范围达到 6 个数量级，检测限低至 21.7 fM，而
且具有很高的特异性。
Dong 等［40］提出了采用耦合的 Hg2+ 介导的构象
的分子信标（MB），用 Ag 纳米簇（AgNCs）作为荧光团，
在核酸内切酶辅助下进行的扩增反应用于 miRNA 的
检测。其中 Hg2+ 能够有效地淬灭 AgNCs 的荧光信号，
在特定的温度下，Hg2+ 介导的特定构象的 MB 不能
与靶标分子杂交。在协助探针分子存在的情况下，
靶标分子和 MB 探针退火，形成 Y 型结构，随即通
过释放 Hg2+ 对 AgNCs 产生高的荧光淬灭效率。该技
术的检测限低至 1 fM，同时消除了复杂的温度控制
和复杂的标记，在临床诊断中具有重要的应用前景。
Ge 等［41］提出了运用四面体 Au 纳米结构探针
与杂交链反应相结合的方法进行 miRNA 的检测，
其中三维四面体 DNA 纳米结构作为支架用于固定
DNA 识别探针，检测信号通过杂交链反应进行放大。
因为超级三明治结构的分子虽然被广泛用于信号扩
增，但是在构建该结构的过程中，其表面修饰及目
标分子消耗难以精确控制，从而影响了扩增效率。
而该检测方法通过特定的引发剂或目标分子来引发
DNA 杂交链扩增反应，其产物为双螺旋结构，能够
捕获大量的信号分子，从而大大增加了扩增效率，
与传统的超级三明治扩增法相比，提高了 3 个数量
级，使 miRNA 的检测限降低至 10 aM。
1.2.2 基于酶的电化学检测技术 最近，基于酶的
电化学检测技术用于 miRNA 的检测研究越来越广
泛，由于在其催化作用下可将单个杂交分子转化成
大量的检测分子，这也大大的提高了检测的灵敏性
和特异性，同时为电化学生物传感器用于 miRNA 的
检测开辟了一条新的途径。近年来，关于这方面的
报道也日益增多。
基于此，Cai 等［42］曾设计了非标记的特殊结构
的分子信标用于的 miRNA 检测的电化学生物传感
器。该生物传感器所采用的非标记的功能化变构分
子信标（aMBs）在目标物存在的情况下，能够高效
的与链霉亲和素过氧化物酶聚合物结合，进而通过
催化反应产生可检测的电信号。该传感器消除抗原
抗体相互作用需要复杂的 DNA 修饰这一缺点。该
aMB 电化学生物传感器用于 miRNA 的检测具有高选
择性和高特异性，其检测限低至 3.4 fM。另外该传
感器可成功用于 10% 的血清样本的检测。
Lin 等［43］ 报 道 了 第 三 代 E-DNA 传 感 器 用 于
图 2 基于 CdTe 纳米晶体和 Au 纳米簇（AuNCs）的电化学能量共振转移分布 miRNA 检测分析原理图［39］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.444
miRNA 的检测，该设计主要采用 DNA 四面体来确
保茎环结构能够被很好地控制。茎环结构 DNA 的
热力学稳定性降低了反应的背景信号，增加了反应
的特异性。随后用生化酶进行电化学信号扩增。该
E-DNA 传感器对于 miRNA 的检测低至 1 fM，能够
很好地区分高相似的 miRNA 家族成员。
Yu 等［44］提出了基于拱形探针（arched probe）
所介导的等温指数扩增反应的一种简单且非标记的
电化学生物传感器的 miRNA 检测技术，如图 3 所示。
该探针是在电极表面的由两条在两端彼此部分互补
的特殊的探针分子。目标 miRNA 可以与拱形结构的
互补序列进行杂交，产生的不完整的双链 DNA 分子
可以与引物结合，通过置换反应或切割来获得更多
的 miRNA 分子，以实现指数循环扩增。反应过程中
产生的单链 DNA 分子在钾离子存在的情况下与血红
素结合形成 G-四联体 DNA，产生的电化学信号可被
高效的检测。释放到溶液中的另一条链触发 EXPAR
循环和再生目标分子。该技术的检测限低至 5.36
fM，其检测线性范围为 3 个数量级。
Deng 等［45］提出了一种新的 miRNA 检测技术，
该技术首先是靶标分子 miRNA 分子与固定在磁珠上
的特异性探针（DZ-CPs）进行杂交，然后利用双链
特异性核酸酶对其进行切割，通过磁铁去除未反应
的 DZ-CPs 和磁珠，溶液中获得的 DNA 分子能够作
为催化剂在过氧化氢存在的情况下催化 3，3，5，5-
联苯胺发生反应，可以通过比色法进行高灵敏度检
测。这种方法的检测限低至 0.8 aM。
2 结语
miRNA 的检测对疾病的分子诊断和新型生物医
药制剂的研发具有重要意义，近年来，有研究表明
miRNA 可作为一些癌症治疗的潜在靶向药物用于临
床治疗［62］。尽管目前为止，只有一部分 miRNA 的
生物学功能得到了解释，但是人们对于 miRNA 的研
究仍在不断努力。 miRNA 的研究方法正在不断发展，
越来越多的报道阐明了检测 miRNA 在不同组织、不
同时期、不同疾病状态下的表达水平。miRNA 检测
技术也越来越受到人们的关注，与此同时各种各样
的新发展起来的检测技术已被运用到 miRNA 的检测
之中，基于以前一些传统方法的基础上，miRNA 的
检测选择性和灵敏度有了很大的提高。随着新技术
新方法的迅速发展，科研人员在定量检测 miRNA 方
面有了更多的选择，但仍需要专家学者不断努力，
争取提出更完善的技术方法。
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图 3 基于聚合酶和 Nicking 核酸内切酶的由拱形探针所介导的 EXPAR 技术用于 miRNA 检测的原理图［44］
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（责任编辑 狄艳红）