全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):48-62
食源性疾病是全球食品安全问题之首［1］。自
1993 年至今，食源性疾病的发病率呈现上升态势，
每年约数 10 亿例发生，每天有数百万人感染，仅
食物引起的腹泻性疾病每年就导致 220 万人死亡，
WHO 将控制食品污染和食源性疾病列为优先重点
战略工作领域［2］。一向以食品安全监管严格著称的
美国每年发生的食源性疾病达 7 600 万人次，住院
32.5 万人次，约 5 000 人死亡，年均发生食品安全
事件 350 起，经济损失达 1 520 亿美元［3］。其中，
由食源性致病菌导致的食源性疾病占 44%。
食源性致病菌是指能够污染食品并通过饮食传
播，引起人类疾病的病原菌，通常指的是细菌。它
收稿日期 ：2015-07-06
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划，2012AA101606），北京市科技新星计划（XX2014B069）
作者简介 ：解沛燕，女，硕士，研究方向 ：食品工程 ；E-mail ：495366514@qq.com
通讯作者 ：许文涛，男，副教授，博士生导师，食品安全分子检测及分子毒理、转基因生物安全 ；E-mail ：xuwentao1111@sina.com
适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
解沛燕1  朱龙佼1  许文涛1，2
（1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083 ；2. 中国农业大学食品科学与营养工程学院 食品安全检测与风险评估实验室，
北京 100083）
摘 要 ： 适配体建立在仿生学基础上，是在体外从单链核酸随机序列库中筛选出的对某种靶物质具有高亲和度的寡聚核苷
酸（DNA 或 RNA）片段。相较于食源性致病菌的常规检测手段，适配体具备特异性强、稳定性好及易于修饰等优点，因此在该领
域得到了关注和应用。但前人对适配体与靶物质结合的原理认识尚不够深入，对食源性致病菌的适配体筛选及应用总结还存在许
多不足。结合食源性致病菌的自身结构特点，介绍了该类物质的适配体筛选特点和检测领域中的最新研究进展，提出了目前存在
的问题及发展趋势。
关键词 ： 适配体 ；食源性致病菌 ；传感器 ；检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.006
Application Progress of Aptamers in the Detection of Food-borne
Pathogenic Bacteria
XIE Pei-yan1 ZHU Long-jiao1 XU Wen-tao1，2
（1. College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083 ；2. Laboratory of Food Safety
Detection and Risk Assessment，College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）
Abstract: Aptamers are artificial DNA/RNA oligonucleotides binding target ligands with high affinities，and they are selected from the
libraries of single-strand nucleic acid random sequence in vitro by SELEX. Compared with the traditional methods，application of aptamers has
the obvious advantages of high specificity，chemical stability and simplicity of modification in the detection of food-borne pathogenic bacteria，
thus it draws attentions and applications in this field. However，the combination principle of aptamers to the target has not been understood
clearly yet，and summaries on the selection of aptamers against food-borne pathogenic bacteria and its application are still deficient. Combined
with the characteristics of food-borne pathogenic bacteria，this article describes the selection characteristics of aptamers against them，and the
latest progress in the detection field. Finally，the existing problems and development trend are proposed.
Key words: aptamer ；food-borne pathogens ；biosensor ；detection
2016,32(4) 49解沛燕等：适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
们在食品中生长代谢会引起食品的腐败和变质，有
些病原菌会产生特定的有毒物质，直接或间接地导
致人患病。常见的细菌类食源性致病菌包括金黄色
葡萄球菌、沙门氏菌属、志贺氏菌、致病性大肠杆
菌（特别是出血性大肠杆菌 O157∶H7）、致病性弧
菌（包括 ：霍乱弧菌、副溶血性弧菌）等［4］。
在全球，每年食源性致病菌（如沙门氏菌、李
斯特菌、大肠杆菌 O157 和弧菌等）的检测量约 2.24
亿个，花费约 14 亿美元［3］。由卫生部、工业和信
息化部、商务部、工商总局、质检总局、粮食局和
食品药品监管局联合制订的《2015 年国家食品安全
风险监测计划》中，对食源性疾病监测以及致病菌
的检测制定了全面而详细的监控计划［5］。目前，我
国检测食源性致病菌大多采用常规检测方法，存在
耗时长、检测范围小等问题，而适配体在该领域的
运用弥补了传统手段存在的诸多不足。
1 食源性致病菌的常规检测方法
目前，食源性致病菌的常规检测方法主要有平
板分离法、化学分析法、分子生物学方法和免疫学
检测法等。
1.1 平板分离法
平板分离法是根据食源性致病菌的生理生长特
性存在差异对其进行鉴定的方法，通常包括増菌、
分离、生化分析及血清学鉴定等步骤。该方法原理
易懂、操作简便且检测结果稳定性好，我国将其定
为食源性致病菌的常规检测手段。然而，平板分离
法的前期増菌和分离步骤通常需要 1-2 d，且后续生
化检测繁琐，整个周期要 3-5 d，耗时较长，无法满
足对食源性致病菌快速检测的需求。
1.2 化学分析法
化学分析法是根据不同的食源性致病菌在自身
组分及代谢产物上存在差异，往往有属于该类菌的
标志性化学组成，利用气相色谱或高效液相色谱分
析样品中所包含的化学成分，达到检测食源性致病
菌的目的。该方法操作灵敏度高，结果可靠，但对
样品的前处理要求较为苛刻，并且需要使用昂贵的
大型仪器设备，不适合应用于现场的检测。
1.3 分子生物学方法
分子生物学方法是利用不同的食源性致病菌在
核酸层面上存在的差异来进行检测分析。电泳技术、
分子杂交技术、PCR 技术以及 DNA 序列测序分析技
术等搭配使用，可以对样品中食源性致病菌进行定
性定量分析。其中，应用最广泛的是 PCR 技术。该
技术检测食源性致病菌的优势在于检测时间短，检
测程序简单。但不同种类的 PCR 技术自身也存在
一定的缺陷，例如，普通 PCR 仅能用于单一致病
菌的检测，而通过扩增食源性致病菌中的信使 RNA
（mRNA）来检测分析逆转录 PCR 只能够检测活细菌
细胞。
1.4 免疫学检测法
免疫学检测法是以全菌或菌的某一部分，如菌
毛蛋白、脂多糖及细菌毒素等为抗原，利用相应的
抗体与其特异性结合，实现对食源性致病菌的检测。
该类方法主要以抗体为识别元件，通过酶催化底物
反应产生颜色变化，进行定性、定量分析。此法具
有良好的特异性和稳定性，是目前我国基层检测单
位应用最多的快检方法。由于抗体属于蛋白类物质，
通常在动物体内筛选，制备成本较高，并且检测及
储存对环境的要求较高，导致使用酶联免疫吸附反
应检测食源性致病菌时存在一定的局限性。
适配体的出现，弥补了以往方法检测食源性致
病菌时的不足。与平板培养法相比，适配体在检测
时能从复杂环境中找到靶物质，检测周期短 ；与仪
器分析法相比，样品的前处理简便 ；与抗体相比，
适配体在体外筛选获得，制备周期短且成本较低。
2 适配体简介
2.1 适配体的起源
1990 年，Tuerk 和 Gold 和 Ellington 和 Szostak
发现了一类能与蛋白的单链核酸序列，两者的结合
特异性及亲和度极高，他们将这类核酸序列命名为
适配体（Aptamer）——由拉丁文“aptus”（意为“合
适”）及德文“meros”（意为部分、分离）两者结合
衍生而来［6］。在此之后，涌现出大量针对不同靶物
质的适配体研究，人们通过适配体与其他材料的搭
建，发明出各种生物传感器，应用于药物生产、医
学检测等领域。
2.2 适配体的特点
适配体是能特异性识别某种靶物质且具有高度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.450
亲和力的核酸序列（DNA 或 RNA），通常含有 15-
40 个碱基，其分子量大致为 5-25 kD［6］。追根溯源，
适配体是在仿生学的基础上发展应用的，如 RNA 适
配体，其实质是对非编码 RNA 的一种模仿。与抗
体等检测元件相比，适配体具有以下 4 个显著的特
点 ：（1）筛选周期短 筛选适配体不需要进行动物实
验，在体外即可获得目标序列。最常见的适配体筛
选技术——指数富集的配基系统进化技术（systematic
evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）
通常在 8-15 轮的筛选后得到与靶物质结合亲和性和
特异性良好的适配体序列，整个周期在 1-2 个月左
右。而最近诞生的 Non-SELEX 技术筛选周期更短，
与毛细管电泳仪共同使用时可将筛选周期控制在 1 d
左右。（2）高亲和性和高特异性 适配体是在容量约
为 1013-1015 的核酸文库中进行 5-13 轮的阳性筛选，
最终得到的适配体与靶物质共同孵育时，其解离常
数可达 nmol 甚至 pmol 水平。由此可见，适配体与
靶物质的结合能力极强。同时，适配体也具有高特
异性，以食源性致病菌为例，研究者通常会选择菌
上某个特异性组分，如标志性蛋白、致病毒素等作
为筛选靶物质，从根本上保证了筛选出的适配体具
有特异性，当靶物质是全菌时，研究者会在阳性筛
选结束后选择 3-5 种与该菌结构或致病性相似的菌
种进行阴性筛选，使筛选出的适配体具有极高的特
异性。（3）适用范围广 由于适配体包含 15-40 个随
机碱基序列，用于筛选适配体的文库容量极大，因
此几乎所有的靶物质都能从文库中找到能与其特异
性结合的适配体序列。随着研究者的不断探索，适
配体已经应用于食品中危害因子检测、医学药物研
发、疾病诊断和治疗等众多研究领域。以检测食品
中的危害因子为例，适配体在重金属［7-9］、农药残
留［10-12］、兽药残留［13，14］以及食源性致病菌［15-28］
等的检测中都有突出作用。（4）对检测环境要求低
作为核酸类物质，适配体能耐高温、耐酸碱性，并
且易于储存。与常规检测方法相比，适配体在使用
时对检测环境要求低。再者，适配体具有标记稳定性，
可在序列末端标记巯基、生物素等基团，因而广泛
用于各类生物传感器的搭建。
3 适配体的筛选
3.1 筛选技术
目 前， 用 于 适 配 体 的 筛 选 技 术 有 很 多， 如
亲 和 层 析 SELEX、 毛 细 管 电 泳 SELEX（Capillary
electrophoresis SELEX）、均衡混合物的非均衡毛细管
电泳 SELEX（Non-equilibrium capillary electrophoresis
of equilibrium mixtures SELEX）、全细胞 SELEX（whole
cell-SELEX）等方法。根据筛选过程中是否有序列
扩增富集，可以将现有的筛选技术分为 SELEX 筛选
和 Non-SELEX 筛选两大类。
3.1.1 SELEX 筛选 大多数的适配体筛选技术属于
指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution
of ligands by exponential enrichment，SELEX）， 主 要
包括（图 1）：建立文库、与靶物质孵育、洗脱分离、
扩增富集等步骤［29］。
适配体的筛选文库一般由含有 15-40 个随机碱
基的序列组成，容量约为 1013-1015，两端为固定序
列，便于 PCR 扩增。在适配体文库与靶物质孵育阶段，
研究者会根据靶物质的特点选用合适的结合缓冲液，
这也是筛选过程中需要优化的条件之一。
分子量不同的靶物质，其洗脱分离步骤操作
差异较大。其中，大分子物质的常用分离方法有 ：
（1）硝酸纤维素膜印迹法［30-35］：可将靶物质固定在
硝酸纤维素膜上，随后通过分子印迹分析得到能与
靶物质结合的随机单链。“适配体”概念的提出者、
SELEX 方法的创始者 Tuerk 等［30］最早应用硝酸纤
维素膜筛选得到噬菌体 T4 DNA 聚合酶的适配体，
使得该方法在适配体筛选，特别是蛋白类靶物质的
筛选中得到广泛应用。Savory［32］在筛选小树肝脏上
某种蛋白的适配体时，借助硝酸纤维素膜完成适配
体的洗脱分离步骤，该研究建立了复杂机制中靶物
质的适配体筛选模型。（2）离心沉淀法［36，37］：能结
合上靶物质的随机单链可随靶物质一同被离心沉淀
下来，该方法具有耗时短、操作简单等优点，通常
用于大分子靶物质，如全菌，适配体的筛选。Hari
等［36］在筛选鼠伤寒沙门氏菌适配体时，以全菌作
为靶物质，与核酸序列文库室温下共同孵育 45 min
后，将混合物在 1 500×g 下离心 10 min，去除未与
2016,32(4) 51解沛燕等：适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
靶物质结合的 DNA 单链。经过 8 轮阳性筛选及 2
轮阴性筛选后，研究者挑选出 1 条能与鼠伤寒沙门
氏菌特异性结合的适配体单链。（3）微孔板筛选技
术［38-40］：将靶物质加入微孔板内，经过一段时间孵
育后加入核酸文库序列，能与靶物质结合的随机单
链可留在微孔板上。该方法利用聚苯乙烯材料特有
的吸附作用固定靶物质，稳定性较好，多用于以菌
的表面大分子为靶物质的适配体筛选中。Han 等［39］
筛选金黄色葡萄球菌适配体时，以菌表面的磷壁酸
为靶物质，将其包被在 96 孔板上，加入 RNA 序列
文库后室温下孵育 20 min，用缓冲液冲洗后，能与
靶物质特异性结合的 RNA 单链留在微孔板中，最后
分离出的适配体单链也与金黄色葡萄球菌结合。
小分子物质的分离方法：（1）磁珠分离法［41-43］：
小分子靶物质可以固定在磁珠上，与适配体序列文
库共同孵育后在外加磁场的作用下可以实现分离，
而后通过加热或加碱等方法使适配体序列与靶物质
分开。Mann 等［41］首次以分子量很小的乙醇胺（Mr
= 61.08）为靶物质，将其固定在磁珠上。加入核酸
序列文库后振荡孵育 30 min，利用磁性材料的分离
富集效应去除未与乙醇胺结合的核酸序列，而后加
入含有尿素及 EDTA 的缓冲液提取结合在靶物质上
的核酸序列，进入下一步扩增富集，最终筛选出 6
条性能良好的适配体。（2）柱层析分离法［44-49］：将
靶物质结合在树脂层析柱上，适配体序列文库与靶
物质孵育后，能特异性结合的序列可以留在层析柱
上，达到分离的目的。Cruz-Aguado 等［44］将靶物质
伏马毒素 B1 固定在凝胶树脂亲和层析柱上，注入
含有核酸序列文库的溶液，用结合缓冲液反复冲洗
层析柱，成功分离出与伏马毒素 B1 结合解离常数为
100 ± 30 nmol/L 的适配体序列。
3.1.2 Non-SELEX 筛选 Non-SELEX筛选技术是相
较于 SELEX 筛选技术提出的。传统的 SELEX 技术
在经过洗脱分离步骤后，要使用 PCR 等技术富集能
与靶物质结合的核酸序列，扩增出的产物将进入下
一轮阳性筛选过程，从而提高适配体序列在核酸序
列文库中所占有的比例，最终筛选出解离常数低的
适配体序列。与 SELEX 不同的是，Non-SELEX 无需
进行 PCR 等核酸序列扩增步骤，经过 2-3 次分离、
分析筛选步骤后直接得到适配体序列（图 2）。
图 1 SELEX 技术筛选适配体流程图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.452
Berezovski 等［50］ 首 次 提 出 Non-SELEX 技 术 的
概念，并使用该技术筛选 h-RAS 蛋白适配体。他们
将平衡混合物的非平衡毛细管电泳（non-equilibrium
capillary electrophoresis of equilibrium mixtures，
NECCM）引入适配体的筛选中，以 h-RAS 蛋白和适
配体文库的平衡混合物为样品，利用 h-RAS 蛋白和
核酸序列两者结合后出现特异性峰形，进而针对这
种非线性拟合对反应的解离速率常数进行求解，经
过 3 轮分离、分析后得到能特异性结合 h-RAS 蛋白
的核酸序列。
随后，Non-SELEX 技术在适配体筛选中得到了
发展和应用［51-54］。Ashley 等［51］利用非平衡毛细管
电泳，以溶菌酶，胰蛋白酶原，糜蛋白酶原 A 和肌
红蛋白为靶标进行阴性筛选，经过 3 轮 Non-SELEX
过程出了能特异性结合牛过氧化氢酶的适配体。Yu
等［52］运用数学模型分析了在不同条件，如蛋白浓度、
分离效率不同对 Non-SELEX 筛选过程的影响，为后
续研究者的实验设计提供了参考依据。
与筛选周期通常为 1-3 个月的 SELEX 筛选技术
相比，Non-SELEX 筛选技术可在几天甚至几小时内
完成适配体筛选全过程，大大缩短了筛选周期。但
由于后者需借助毛细管电泳仪进行筛选，筛选靶物
质结合核酸序列前后应在电泳迁移率方面有明显变
化，因此具有一定的局限性，即 Non-SELEX 技术大
多用于大分子物质的适配体筛选。
2013），本文介绍了国标中规定的食源性致病菌的致
病特点，并总结了目前国内外文献中筛选出的食源
性致病菌适配体序列（表 1）。
以全细胞作为筛选靶物质的研究大多集中在适
配体应用于食源性致病菌检测领域的起步阶段，但
随着研究的不断深入，致病菌上特异性组分和毒素
成为了选择的热门。相较于用整个致病菌为靶物质，
后者具有一定的优势 ：（1）可不做或少做阴性筛选，
实验周期得到缩短 ；（2）以整个细菌作为筛选靶物
质会污染操作环境的可能性较大，会带来一定的安
全隐患，选择某个组分为靶物质则大大降低了这种
风险 ；（3）以致病菌上的某个特异性部分为靶物质
筛选出的适配体可用于整个致病菌的检测，且清楚
地了解与致病菌的结合位点，对基于适配体的生物
传感器的搭建十分有利。
3.2.1 全细胞 作为大分子物质，全细胞的表面复
杂且结构同源性较高，因此在完成阳性筛选后，通
常会选择 3-6 种与靶致病菌具有相似结构或能导致
相似疾病的细菌进行阴性筛选，确保筛选出的适配
体能够特异性地识别靶致病菌。Cao 等［26］在筛选金
黄色葡萄球菌适配体时，将经过 11 轮阳性筛选后留
下的适配体序列与表皮葡萄球菌、嗜热链球菌以及
大肠杆菌 DH 5 共同孵育，反向筛选适配体。
3.2.2 表面组分 筛选适配体的靶物质也可以是致
病菌表面的某个特异的功能性部分，如脂多糖、蛋
白等。 Li 等［17］在筛选肠毒素大肠杆菌 K88 适配体时，
以能吸附宿主肠道黏膜上皮细胞，从而一起宿主肠
道疾病的菌毛蛋白为靶物质 ；Bruno 等［18］在筛选大
肠杆菌 O111∶B4 适配体时，以菌膜上具有抗原性
的内毒素脂多糖为靶物质。同样地，在筛选原生生
物、病毒等的适配体时，大多也会选择使用该类病
原微生物上的特异性蛋白作为靶物质，如针对甲、乙、
丙型肝炎，已经筛选出以核心蛋白、3C 蛋白酶、囊
膜糖蛋白 E2、NS3 螺旋酶为靶标的核酸适配体。
3.2.3 毒素 真菌毒素是真菌在食品或饲料里生长所
产生的代谢产物，对人类和动物都有害，而用于适
配体筛选的毒素通常指的是真菌毒素，如黄曲霉毒
素、赭曲霉毒素及玉米赤霉烯酮等。2008 年，Cruz-
Aguado 和 Penner 首先通过免疫亲和柱筛选得到了与
OTA 高亲和识别的 DNA 适配体，并且成功设计了以
图 2 SELEX 技术与 Non-SELEX 技术筛选适配体流程对
比示意图
3.2 筛选靶物质
食源性致病菌的筛选靶物质可以分为 3 大类 ：
全细胞、表面组分以及毒素。参照我国《食品安
全国家标准——食品中致病菌限量》（GB 29921-
2016,32(4) 53解沛燕等：适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
OTA 适配体为识别模式的荧光偏振检测方法［43］，这
也是 OTA 适配体在分析检测上的第一次应用。王文
凤等［55］借助磁珠筛选得到了黄曲霉毒素 B1 和 B2
的适配体，随后将适配体搭载纳米金颗粒，实现对
表 1 食源性致病菌适配体汇总表
目标细菌 细菌特征 菌型 筛选靶
物质
适配体序列 序列
数目
参考
文献
大肠杆菌 肠杆菌科、埃希氏菌属，革兰氏
阴性。大多数大肠杆菌定居在人
和动物的肠道中，不会导致宿主
患病，但是一些特殊的血清型会
引起人和动物，尤其是婴儿和幼
畜，出现腹泻和败血症。
大肠杆菌
O157∶H7
全菌 UGAUUCCAUCUUCCUGGACUGUCGAA
AAUUCAGUAUCGGGAGGUUACGUAUU
UGGUUUAU
4 条 ［15］
脂多糖 CCGGACGCTTATGCCTTGCCATCTACAG
AGCAGGTGTGACGG
1 条 ［16］
大肠杆菌 K88 菌毛蛋白 GGCGACCCCCGGGCTACCAGACAATGT
ACGCAGCAAGAGTGACGGTCGTACCTC
GGAGTC
4 条 ［17］
大肠杆菌
O111∶B4
脂多糖 ATCCGTCACCCCTGCTCTCGTCGCTATG
AAGTAACAAAGATAGGAGCAATCGGGT
GGTGTTGGCTCCCGTAT
16 条 ［18］
大肠杆菌
O55∶B5
脂多糖 TAGCCGGATCGCGCTGGCCAGATGATA
TAAAGGGTCAGCCCCCCA
1 条 ［19］
大肠杆菌 8739 外膜蛋白 ATACGGGAGCCAACACCATGGTACAAG
CAAACCAATATTAGGGCCCAGACATCG
AGAGCAGGTGTGACGGAT
25 条 ［20］
大肠杆菌
NSM59
全菌 GGGAGGGGCGGCGAAGGAGTGGCG 6 条 ［21］
沙门氏菌 肠杆菌科细菌，革兰氏阴性。菌
型繁多，在全球已确认的 2500
多种血清塑中，常见的危害人畜
健康的约有 30 多种，且多为条
件致病菌。
鼠伤寒沙门氏
菌
外膜蛋白 CCGCCTTTACTAAATTGACGAACATAGG
AATCAATGAAGC
4 条 ［22］
IVB 型菌
毛
UCACUGUUAUCCGAUAGCAGCGCGG
GAUGA
9 条 ［23］
沙门氏菌 O8 全菌 TGATCCGGGCCTCATGTCGAACCCACAC
CCCACAACCACCCAGCCCCAGCCCGCT
ATTGAGCGTTTATTCTGAGCTCCCA
19 条 ［24］
肠炎沙门氏菌 全菌 GGGUUCACUGCAGACUUGACGAAGCU
UGAGAGAUGCCCCCUGAUGTGCAUUCU
UGUUGUGUUGCGGCAAUGGAUCCACA
UCTACGAAUUC
1 条 ［25］
金黄色葡
萄球菌
葡萄球菌属，革兰氏阳性菌。人
类化脓感染中最常见的病原菌，
可引起局部化脓感染，也可引起
肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，
甚至败血症、脓毒症等全身感染。
金黄色葡萄球
菌 8325-4
全菌 GCGCCCTCTCACGTGGCACTCAGAGTGC
CGGAAGTTCTGCGTTAT
5 条 ［26］
单增生李
斯特氏菌
革兰氏阳性短杆菌，是一种人畜
共患病的病原菌，感染后主要表
现为败血症、脑膜炎和单核细胞
增多。
全菌 TGGGGGGTGGTTGGGGGTAGTATATCG
GGTCAGTGGTGCG
10 条 ［27］
副溶血性
弧菌
革兰氏阴性杆菌，进食含有该菌
的食物可致食物中毒，也称嗜盐
菌食物中毒。临床上以急性起病、
腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主
要症状。
全菌 TAGAGATATGACAGCGGGGAAGGTTAA
GAGGCGCTAGGAG
5 条 ［28］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.454
靶物质的检测。
4 适配体的性能鉴定
研究者通常对筛选出的适配体进行两方面的性
能鉴定 ：适配体与靶物质结合的亲和性以及特异性。
4.1 亲和性
亲和性是指适配体与靶物质结合力的大小，通
常用解离常数进行表征。在自然状态下，适配体呈
现多种不确定的空间构象，当加入靶物质存在时，
适配体会改变自身构象，通过范德华力、氢键、盐桥、
静电吸附等作用力嵌入在靶物质表面的结合位点［4］，
实现两者结合，其解离常数可达 nmol 甚至 pmol 水
平。由此可见，适配体与靶物质的亲和性很高。
4.2 特异性
特异性是适配体与靶物质及非靶物质比较，结
合力的强弱是否存在明显差异。就食源性致病菌而
言，通常使用与靶物质有相似结构和相同致病性的
病原菌或病原菌结构（如鞭毛蛋白等）进行特异性
分析。解离常数也是评价适配体特异性的指标，当
与靶物质孵育时，Kd 值极低，而与其他物质孵育时，
Kd 值较高，两者相差 1-2 个数量级，则该适配体序
列与靶物质结合的特异性较高。
4.3 亲和性与特异性的关系
适配体与靶物质的亲和性与特异性是必要不充
分的关系。核酸序列对靶物质的亲和性要求该序列
很容易与靶物质结合 ；而核酸序列的特异性则要求
该序列能且仅能与靶物质结合。通常情况下，筛选
得到的适配体能从复杂基质中特异地与靶物质结合，
则两者之间相互作用力一定很强。反之则不成立，
经过多轮阳性筛选得到的适配体通常与靶物质具有
较好的亲和性，但由于两者间的结合位点可能不是
靶物质特有的组分，阳性筛选出的适配体序列不一
定具有与靶物质较好的特异性，这一特点在以全细
胞为靶物质的适配体筛选中尤为突出，因此全细胞
筛选一般配合阴性筛选。
5 适配体与靶物质的结合表征
5.1 靶物质的结合位点
研究筛选出的适配体与靶物质的结合位点有助
于优化检测体系。段诺等［28］在以副溶血性弧菌为
靶物质筛选得到适配体后，使用提取试剂盒提取了
副溶血性弧菌表面的外膜蛋白和脂多糖两类组分，
比对解离常数和琼脂糖凝胶电泳图，分析了该适配
体对膜外两种物质的结合情况，最终得出筛选出的
适配体与副溶血性弧菌的结合位点在外膜蛋白上的
结论。针对不同靶物质的适配体筛选研究有很多，
但对筛选出来的适配体与靶物质，尤其是以菌种上
某个特异性组分作为靶物质，结合位点研究的较少。
出现这种情况的可能的原因有如下两点 ：（1）适配
体序列与靶物质结合时通常会折叠缠绕改变构象，
而这一过程可能会受到靶物质上某些物质的作用，
机理复杂 ；（2）靶物质作为一个复杂的大分子物质，
其表面能与核酸序列结合的位点较多，探究两者结
合的具体作用位点必须将靶物质进行切割分离，难
度较大。
5.2 适配体的功能片段
研究者在探究适配体序列上能与靶物质结合的
功能片段时，通常会根据适配体序列的结构特点，
找到保守序列，即筛选出的核酸序列中共有的片段，
再根据茎环、支撑臂等结构将其分解为若干部分，
探讨各部分与靶物质的结合情况，从而确定该适配
体序列的功能片段。
Lee 等［15］ 在筛选大肠杆菌 O157∶H7 的 RNA
适配体时，选取与靶物质结合率最高的适配体序列，
将其分解为 3 个部分，而后用 3 个序列片段及全序
列分别与靶物质进行孵育，用 Kd 值评价两者结合
的亲和性。结果表明，保守序列部分与靶物质结合
的亲和性最佳，此结果能很好地反映适配体与靶物
质结合的有效片段，后续研究者在使用适配体检测
大肠杆菌 O157∶H7 时可直接合成功能序列，既能
提高检测效率，又可以节约成本。
6 适配体检测应用
6.1 菌种的样品前处理
在检测之前，需要对样品中的菌种进行前处
理，即选择合适的培养基扩增菌种使其达到对数期，
通过离心去除杂质，加入筛选适配体时用到的结合
液重悬，使菌种在数量和质量上都处于良好的待检
状态［56］。
以菌上某个特异性组分，如膜外蛋白、脂多糖
2016,32(4) 55解沛燕等：适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
等作为待检物质时，可在菌种扩增完成后使用对应
组分的提取试剂盒进行提取［28］。
6.2 适配体光学传感器
基于适配体的光学传感器是利用适配体检测食
源性致病菌中应用最广泛的模型，其优势在于光学
元件种类繁多且适配体易于修饰，两者结合还可以
搭建可视化颜色改变的生物传感器，这对现场检测
来说至关重要。常见的有比色传感器［16，56，57］、化
学 发 光 传 感 器［58-61］、 荧 光 传 感 器［62-66］、 表 面 等
离子共振传感器［67-69］以及表面增强拉曼光谱传感
器［70-72］。各种传感器模型间是相辅相成的，研究者
会同时引入多种材料，如纳米材料与荧光材料并用
等，从而提高反应体系的灵敏度，降低检测限。
6.2.1 比色传感器 适配体搭载可发生颜色变化的
新型纳米材料，构成比色传感器。新性纳米材料在
溶液中处于分散状态，当靶物质出现时，适配体与
之结合，从而拉近粒子间的距离产生色差。研究者
以颜色变化为信号，对靶物质进行定性定量检测。
Wu 等［16］利用聚二乙炔（polydiacetylene，PD-
A）纳米球在不同状态下会产生颜色变化来检测大
肠杆菌。10，12- 二十五碳二炔酸在紫外灯下照射可
形成 PDA 纳米球，经过氨基修饰的大肠杆菌 O157 :
H7 脂多糖特异性结合的适配体可以与羧基化的 PDA
形成肽键，从而将两者结合在一起。PDA 纳米球在
分散状态下呈现蓝色，修饰完适配体后仍旧保持分
散状态，不发生颜色变化。当大肠杆菌 O157 : H7 存
在时，适配体会迅速改变自身构象与之结合，从而
导致 PDA 纳米球出现聚集，呈现出红色（图 3）。当
大肠杆菌 O157 : H7 存在时，该体系可产生肉眼可
见的颜色变化，具有较大的优势，比色反应可在 2 h
内完成，借助紫外可见分光光度计可实现定量分析。
但由于反应体系中使用的材料单一，方法的灵敏度
较差，其检测区间为 104-108 CFU/mL。
DNA 酶也是常见的搭建比色传感器的元件。
EDC/NHS
PDA vesiclered form PDA vesicleblue form E. coli O157:H7 OOOOOOOC NCO OH O PH7N C NH O OOP 3˃3˃
图 3 PDA 搭载适配体检测大肠杆菌 O157 : H7 的原理示意图［16］
DNA 酶具有生物催化作用，而血红素与富含 G 碱基
的适配体结合后形成的超分子复合物具有类似过氧
化物酶活性，可以催化过 H2O2 化 ABTS 的反应，产
物 APTS+ 是一种有色物质，可利用其作为传感信号，
搭载适配体序列组成比色传感器。
Teller 等［57］ 运 用 DNA 酶 比 色 发 光 传 感 器 实
现了对 AMP 和溶菌酶的检测。研究者设计了两条
DNA 杂交链，其中一条为“识别序列”，同时包括
靶物质适配体和血红素适配体，另一条为“阻碍序
列”，与“识别序列”中的两段适配体序列分别有 9
个碱基互补。当靶物质存在时，“识别序列”中与其
对应的适配体序列会结合上去，从而打开双链，另
一端的血红素适配体形成 G4 结构，催化 H2O2 化
ABTS 的显色反应（图 4）。该方法原理简单易懂，
操作步骤较少，建立了一种可以推广的 DNA 酶比色
传感器模型。但其方法中需要设计两条含有茎环结
构的 DNA 杂交链，因此对适配体序列长度的有一定
要求。
6.2.2 化学发光传感器 化学发光是物质在进行化
学反应过程中伴随的一种光辐射现象。因其具有灵
敏度高、检测区间宽及装置简单等优点，化学发光
被广泛用于蛋白、毒素等分子的检测。在适配体序
列上标记化学发光因子［58，59］，或引入 DNA 酶催化
鲁米诺与 H2O2 反应
［60，61］，是目前最常见的化学发
光传感器体系。
Mun 等［61］首次以适配体代替酶联抗体，用竞
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.456
争法检测黄曲霉毒素 B1。研究者在黄曲霉毒素 B1
适配体的末端连接了类辣根过氧酶的 DNA 序列，当
待检样品中存在黄曲霉毒素 B1 时，竞争性地与适配
体结合，固定在 96孔板上的黄曲霉毒素 B1-卵蛋白
失去 DNA 序列，在孔中加入 H2O2 和鲁米诺后不再
出现化学发光（图 5）。该方法用于玉米样品中黄曲
霉毒素 B1 的检测，其检测限为 0.11 ng/mL。与酶联
抗体相比，适配体竞争法大大降低了检测限。
段颖芬等［62］搭建检测鼠伤寒沙门氏菌的荧光
传感器时，以氧化石墨烯为平台，将荧光染料标记
的鼠伤寒沙门氏菌适配体作为分子识别探针，加入
纳米材料氧化石墨烯后，荧光探针会吸附在其表面
导致荧光淬灭。当鼠伤寒沙门氏菌存在时，适配体
与靶物质结合使荧光信号再度恢复（图 6）。根据荧
光信号恢复的强弱可以实现对鼠伤寒沙门氏菌的定
量检测。该方法的淬灭效率高、背景值低，其检测
限为 102 CFU/mL，在检测食源性致病菌的荧光传感
器中属于检测限较低的体系。由此可见，纳米材料
的引入大大提高了反应的灵敏性。该方法的淬灭效
率高、背景值低，其检测限为 102 CFU/mL，在检测
食源性致病菌的荧光传感器中属于检测限较低的体
系，由此可见纳米材料的引入大大提高了反应的灵
敏性。
Lyso
Lyso
Lysozyme aptamer
G-quadruplex
AMP
AMP
AMP aptamer
G-quadruplex
A B
图 4 DNA 酶比色传感器检测 AMP、溶菌酶示意图［57］
Chemiluminescence No Chemiluminescence
AFB1 AFB1 Aptamer-DNAzyme AFB1-OVA
Luminol
Washing
Negative Positive
图 5 DNA 酶化学发光传感器检测黄曲霉毒素 B1 示意图［61］
6.2.3 荧光传感器 荧光适配体生物传感器主要是
用荧光基团标记核酸适配体，基于目标分子与适配
体作用后产生的荧光偏振或荧光强度的改变来检测
食源性致病菌［62-66］；或者将荧光基团或淬灭基团分
别标记在核酸适配体的两端，加入靶物质后引起适
配体自身构象改变，从而产生荧光信号上的差异［57］。
targ
et
blank
FAM-aptamer Graphene oxide S. typhimurium

图 6 氧化石墨烯搭载荧光标记适配体检测鼠伤寒沙门氏菌
的原理示意图［62］
6.2.4 表面等离子共振传感器 表面等离子共振
（surface plasmon resonance，SPR）是一种物理现象，
2016,32(4) 57解沛燕等：适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
当入射光以临界角入射到两种不同折射率的介质界
面（比如玻璃表面的金或银镀层）时，可引起金属
自由电子的共振，由于共振致使电子吸收了光能量，
从而使反射光在一定角度内大大减弱。将适配体修
饰在等离子共振装置表面，靶物质的出现会导致等
离子共振装置的折射率发生位移。
Tombelli 等［68］使用 SPR 适配体传感器来检测
艾滋病病毒 HIV-1Tat 蛋白。使用生物素链霉亲和
素将适配体固定在芯片表面，流动注射不同浓度的
HIV-1Tat 蛋白时，检测折射角的信号变化，检出限
为 0.12 mg/L。Lei 等［69］在构建 SPR 传感器检测沙
门氏菌时，在链霉亲和素的适配体末端加入与沙门
氏菌侵袭蛋白 A 基因互补的核酸序列，将其作为信
号放大体系引入 SPR 传感器中（图 7），该方法的检
测限可达到 60 CFU /mL。SPR 传感器不需任何标记
物，可用于生物分子的无损检测。
Probe 1 BSA
Target
ssDNA
MCH S S S S S S S
S S S S S S SS S S S S S SS S S S S S S
Probe 2SA
图 7 SPR 传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的原理示意图［69］
6.2.5 表面增强拉曼光谱传感器 拉曼光谱是光子
与分子相互碰撞发生方向和能量改变，出现散射光
频率变化的联合散射光谱。拉曼散射效应是一个非
常弱的过程，研究者将分子吸附在粗糙表面，如
金属和纳米粒子，形成表面增强拉曼光谱（surface
enhanced raman spectroscopy，SERS），可用于分子水
平的检测［70-72］。
Zhang 等［70］利用 SERS 传感器同时检测鼠伤寒
沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。研究者将特异性识别
两种菌的适配体固定在 Fe3O4 磁性纳米粒子上，形成
捕获探针。拉曼分子巯基乙酸（MBA）与鼠伤寒沙
门氏菌适配体、拉曼分子 5，5- 二硫代二（2-硝基苯
甲酸）（DNTB）与金黄色葡萄球菌适配体分别修饰
在金纳米粒子表面，形成信号探针（图 8）。当反应
体系存在两种菌时，捕获探针中的适配体可特异性
地与靶物质结合，加入信号探针形成夹心结构。两
种拉曼分子可形成不同的表面增强拉曼光谱，实现
对细菌的检测和鉴定。该方法对鼠伤寒沙门氏菌的
检测限为 15 CFU/mL，金黄色葡萄球菌的检测限为
30 CFU/mL，具有简单快捷、灵敏度高等优点，引入
多种拉曼分子，可实现对多种致病菌的同时检测。
6.3 适配体电化学传感器
基于适配体的电化学传感器起步较晚，但由于
优势明显，在近几年得到了迅速发展，常见的有电
极修饰传感器［73-75］及纳米管传感器［76-80］。
6.3.1 电极修饰传感器 电极修饰传感器由固定了
适配体的电极和电化学活性传感元件构成。在加入
待检样品后，适配体与靶物质结合，导致电极表面
结构改变，通过检测电流、电阻等的变化定性定量
检 测 靶 物 质。Luo 等［74］ 将 大 肠 杆 菌 O111 适 配 体
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.458
与捕获探针相连，固定在金电极表面，当大肠杆菌
O111 存在时，适配体脱离捕获探针，与靶物质结合。
识别探针与裸露的捕获探针连接留在金电极表面，
加入识别元件链霉抗碱性磷酸酶后引起电势改变（图
9）。该方法可用于牛奶中大肠杆菌 O111 的检测，其
检测限为 305 CFU/mL，3.5 h 可完成检测分析。
6.3.2 纳米管传感器 纳米管电化学传感器与电极
修饰传感器原理相似，是将适配体修饰在纳米管
内壁上，通电后记录初始电势，当靶物质通过纳
米管时会引起电势信号的改变。常用于电化学检
测的纳米管有硅纳米孔［76］及单壁碳纳米管［77-80］。
Gustavo 等［77］利用单壁碳纳米管同时检测大肠杆菌
O157∶H7 及单增李斯特菌两种菌（图 10）。研究
者将大肠杆菌 O157∶H7 及单增李斯特菌的适配体
分别修饰在单壁碳纳米管壁内部，当两种菌或其中
一种存在于样品中时，与其对应适配体与靶物质结
合，通电的单壁碳纳米管会产生电势变化，实现对
两种菌的实时定量检测。该方法的检测区间为 2-103
CFU/ mL，灵敏度较高。但受到单壁碳纳米管内径大
小的限制，其检测上限较低，即当样品中的靶物质
浓度较高时，可能会出现假阴性的试验结果。
6.4 适配体压电晶体传感器
压电晶体是非中心对称晶体，在机械力作用下
可产生形变，使带电质点发生相对位移，从而在晶
体表面出现正、负束缚电荷，极轴两端产生的电势
差可作为检测信号。其中，石英晶体微天平（quartz
crystal mierobalance，QCM）是最常见的压电晶体传

图 8 SERS 传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的原理示意图［70］

图 9 电极修饰传感器检测大肠杆菌 O111 原理示意图［74］

图 10 单壁碳纳米管传感器检测大肠杆菌 O157 : H7 原理
示意图［77］
2016,32(4) 59解沛燕等：适配体在食源性致病菌检测中的应用进展
感［68，58］。Ozalp 等［81］将特异性识别致病菌的适配
体修饰在 QCM 传感器上，当样品中出现靶物质时，
两者的结合可导致 QCM 传感器发生形变，出现电势
差（图 11）。研究者利用这一原理检测了牛奶中沙
门氏菌的含量，方法的检测限为 100 CFU/ mL。该方
法装置简单，每个晶体能重复使用多次，可用于实
际样品的批量检测。
图 11 石英晶体微天平传感器检测细菌原理示意图［81］
7 结语
适配体对靶物质可特异性识别且结合力很强，
同时适配体还具有分子小、易合成、易修饰、相对
稳定等优势，作为一类分子识别元件易于搭载各种
传感元件组建不同类型的生物传感器，满足当下对
食品中可能存在的食源性致病菌的现场检测要求。
但是，目前适配体的发展还存在着一些局限性：
（1）针对不同食源性致病菌，尤其是真菌类物质，
适配体种类有限 ；（2）缺乏对适配体与靶物质结合
的位点系统研究 ；（3）同时检测多种食源性致病菌
的生物传感器模型较少。
针对目前存在的不足，适配体检测食源性致病
菌可以从以下 3 个方面进行深入研究 ：（1）筛选更
多种类的食源性致病菌适配体 ；（2）借助生物信息
学手段，精准定位适配体在靶物质上的结合位点；（3）
建立能检测食源性致病菌的高通量、高特异性、高
灵敏度的适配体传感器。此外，适配体与磁珠等结
合可以抓取复杂机制中的靶物质，也为实际样品中
食源性致病菌的分离提取提供了新的思路。
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（责任编辑 狄艳红）