全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
民以食为天，食以安为先。近年来食品安全问
题的频频发生，给人民的日常生活带来巨大的影响。
目前影响食品安全的主要因素有 ：农业化学控制物
质、农药残留、食品添加剂、动植物天然毒素、真
菌毒素、食源性致病菌和病毒［1］。
据 世 界 卫 生 组 织（World health organization，
WHO）统计数据显示，全球每年发生的食源性疾病
病例数可达到 10 亿［2］。如日本发生的肠出血性大肠
杆菌 O157H7 中毒事件，最终导致万人以上食物
中毒［3］。据 2004-2007 年中国突发公共卫生事件报
告管理信息系统统计，由微生物引起的食物中毒事
收稿日期 ：2014-01-06
基金项目 ：广东省科技计划项目（2011B031500023）
作者简介 ：余倩，女，博士，副教授，研究方向 ：应用微生物 ；E-mail ：yuqianchina@126.com
三种食源性致病菌的多重 PCR 快速检测及应用
余倩  黄梦娜
（仲恺农业工程学院 轻工食品学院，广州 510225）
摘 要 ： 针对常见的 3 种食源性致病菌肠出血性大肠杆菌 O157H7 的 rfbE 基因、金黄色葡萄球菌的 nuc 基因及沙门氏菌
的 hilA 基因，使用 Primer 5.0 软件设计出相对应的特异性引物，预计 PCR 产物的分子大小为 287、354 及 468 bp。通过单一、双重
及三重 PCR 对样品进行检测，并对人工感染的鲜奶进行检测。结果表明，3 种食源性致病菌的单一、双重和三重 PCR 均能成功扩
增出与预计大小一致的片段，无非特异性扩增。人工感染食品的 PCR 检测也获得了目的菌的特异性片段，并且结果稳定。这说明
此 3 对引物可分别用于 3 个菌靶基因的 PCR 检测。
关键词 ： 食源性致病菌 肠出血性大肠杆菌 O157H7 金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 PCR
Detection and Application of Three Food-borne Bacterial Pathogens by
Multiplex PCR
Yu Qian Huang Mengna
（Zhongkai University of Agiculture and Engineering，Guangzhou 510225）
Abstract:  Food poisoning incidents have occurred by the pollution of food-borne pathogenic bacteria frequently. PCR meet the
requirements of the rapid detection of pathogenic bacteria. The three primers was designed by primer 5.0 software of Enterohemorrhagic
Escherichia coli O157H7 rfbE gene, Staphyloccocus aureus nuc gene, Salmonella hilA gene. Three amplified segments of rfbE gene, nuc gene,
hilA gene were 287 bp, 354 bp, 468 bp. The specificity and sensitivity of primers were verified by single, duplex and triplex-PCR reaction, and
by detecting the foods artificially infected with the three pathogens. The results showed that three food-borne bacterial pathogens were amplified
purpose fragments, and no non-specific fragments were amplified. It was obvious that there were the special fragments of the artificial food
infected with three pathogens by PCR test. The three primers could be used for PCR detection of target genes about three bacteria.
Key words:  Food-borne pathogenic bacteria Enterohemorrhagic Escherichia coli O157H7 Staphyloccocus aureus Salmonella
PCR
件为 652 起［4］。如 2012 年 8 月 19 日，百余名游客
在三亚某酒店进餐后，食用了被沙门氏菌污染的蛋
炒饭而引起食物中毒 ；2011 年下半年，我国各大速
冻食品厂的食品均被检出金黄色葡萄球菌超标。由
食源性致病菌引起的食品安全问题逐渐受到人民的
关注与重视。
由于传统的微生物检测方法步骤繁琐，消耗时
间长，工作量大，限制了它的使用。分子生物学方
法作为食品微生物学的主要检测方法之一，在近几
年得到广泛的运用，主要包括基因探针检测方法、
PCR 技术、基因芯片技术等［5-8］。
2014年第7期 65余倩等 ：三种食源性致病菌的多重 PCR 快速检测及应用
PCR 技 术 又 称 聚 合 酶 链 式 反 应（Polymerase
chain reaction，PCR），是从 20 世纪 80 年代中期发
展起来的体外核酸扩增技术，因具有特异性强、灵
敏度高、操作简便等优点而在生物医学领域中有
较好的发展［9］。随后又出现了逆转录 PCR、实时
PCR、巢式 PCR、多重 PCR、荧光定量 PCR 和不对
称 PCR 等，PCR 技术也成为了分子生物学最重要的
技术之一［10-12］。
本研究所采用的 hilA 基因为侵袭基因正调节蛋
白基因，是沙门氏菌的毒力基因［13］。O157H7 菌
体抗原特异合成酶 rfbE 基因是参与 O 抗原脂多糖的
生物合成基因，与 Stx、eae、hlyA 等其他毒力基因相比，
特异性更强，所有 O157H7 菌体进行 PCR 都可扩
增出该片段［14］。耐热核酸酶 nuc 基因是目前检测金
黄色葡萄球菌重要的靶基因［15］。针对以上 3 个基因
设计特异性引物，建立了可同时检测 3 种病原菌的
多重 PCR 方法，并对其在食品检测方面的应用进行
了初步的探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
菌种名称及编号，见表 1。
表 1 菌种名称及编号
菌种名称 菌种编号
沙门氏菌 为食品微生物实验室保藏菌种
肠出血性大肠杆菌 O157H7 GIM1.334
金黄色葡萄球菌 CMCC26003
1.2 方法
1.2.1 引物的设计与合成 根据沙门菌的 hilA 基
因、金黄色葡萄球菌的 nuc 基因和肠出血性大肠杆
菌 O157H7 的 rfbE 基 因， 应 用 Primer Premier 5.0
分别设计如下 3 对特异性引物（表 2），并送至生工
生物（上海）有限公司合成。
1.2.2 食 源 性 致 病 菌 的 培 养 和 基 因 组 DNA 的 提
取 从保藏斜面中挑取合适的菌落置于 LB 液体培养
基中，37℃恒温培养 24 h 后，再以 140 的比例转
接至新的 LB 培养液中 37℃恒温培养 24 h 进行活化。
最后以 140 的比例移接至新的 LB 培养液中 37℃
恒温振荡培养 2-4 h，至菌液 OD600 为 0.7-1.0，用细
菌 DNA 提取试剂盒分别提取 3 种菌的 DNA，-20℃
保存备用。
1.2.3 单重 PCR 反应体系的建立 单重 PCR 反应体
系（50 μL）：Taq 酶 0.25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，
dNTP Mixture 4 μL，模板 DNA 溶液 3 μL，引物（20
μmol/L）各 1 μL，加去离子水至 50 μL。
PCR 参数 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 40 s，
50℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，30 个循环 ；72℃
延伸 7 min。4℃保存。
1.2.4 多重 PCR 反应体系的建立及优化 将以上 3
对引物进行两两组合或三者混合，混合 3 种致病菌
的基因组 DNA 作为模板进行 PCR 反应，验证多重
PCR 反应的特异性及引物之间的相互作用。调整反
应体系中的引物浓度和模板浓度等，优化多重 PCR
反应体系，反应程序同 1.2.3。
1.2.5 人工模拟样品的 PCR 检测 分别制备沙门氏
菌、肠出血性大肠杆菌 O157H7 和金黄色葡萄球
菌的菌悬液，将 3 种培养液单独接种鲜奶培养 24 h，
或任意两两等量混合然后取少量接种到鲜奶中培养
24 h。对人工染菌的食品样品先进行增菌，而后用
试剂盒提取致病菌基因组 DNA 进行 PCR 检测。以
未染菌的食品作为阴性对照。
2 结果
2.1 菌种及靶点在NCBI的编号
针对试验所用的沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌
O157H7、金黄色葡萄球菌这 3 个菌种，及筛选确
表 2 设计的引物汇总表
菌种 靶基因 引物名称 引物（5-3） Tm（℃） 扩增长度（bp）
沙门氏菌 hilA hilA-f1 AAACCCGAGCCCGTAGAA 50.2 468
hilA-f2 ACCGATAGCCCTGTCCGT 52.5
肠出血性大肠杆菌 O157H7 rfbE rfbE-f1 CACTTTATGACCGTTGTTTA 45.5 287
rfbE-f2 TTCCTCTCTTTCCTCTGC 47.5
金黄色葡萄球菌 nuc nuc-f1 GATTGATGGTGATACGGTT 46.6 354
nuc-f2 TCTTTTTTTGCTTGTGCT 41.1
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期66
定出的靶基因，从 NCBI 网站上下载 3 种菌的基因
组及其特异性靶点的序列。
表 3 菌种及靶点在 NCBI 上的编号
菌种名称 NCBI 编号 靶点基因 NCBI 编号
沙门氏菌 NC_017046.1 hilA U25352.1
肠出血性大肠杆菌 O157H7 NC_007414 rfbE JN641286.1
金黄色葡萄球菌 NC_007793 nuc NC_007793.1
2.2 单重PCR反应体系验证结果
分别使用 3 种食源性致病菌所特有的特异性引
物进行单重 PCR 反应，均能扩增出与预计大小相
符的目的条带（图 1），且无非特异性条带和二聚
体 ；肠出血性大肠杆菌 O157H7 的 rfbE 基因 287
bp ；金黄色葡萄球菌的 nuc 基因 354 bp ；沙门氏菌
的 hilA 基因 468 bp ；Marker 和 PCR 产物的上样量均
为 400 ng。回收 3 个 PCR 产物进行测序，并在线与
NCBI 数据库中的相应种的序列进行比对，比对结果
显示序列同源性均在 99% 以上。
2.4 多重PCR反应体系的建立
分别将沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌 O157
H7、金黄色葡萄球菌的基因组 DNA 等量混合为模板，
按优化的多重 PCR 反应体系进行扩增，结果（图 2）
显示，双重 PCR 反应后在相应大小位置处出现了两
条特异性条带，三重 PCR 反应后，在 354、287 和
468 bp 处分别出现了明显的特异性目的条带，且无
非特异性条带和引物二聚体的形成，Marker 和 PCR
产物的上样量均为 400 ng。经过多次试验，确定多
重 PCR 的 反 应 体 系 为 ：（50 μL）：Taq 酶 0.25 μL，
10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，模板 DNA
溶液 3 μL，引物（20 μmol/l）各 1 μL，加去离子水
至 50 μL。
1 2 3 M
500
200
bp
M ：DNA Marker DL 2000 ；1 ：肠出血性大肠杆菌 O157H7 ；
2 ：金黄色葡萄球菌 ；3 ：沙门氏菌
图 1 单重 PCR 反应
2.3 PCR反应特异性实验
将 3 种致病菌的基因组 DNA 等量混合为模板，
分别用一对引物进行 PCR 反应，结果显示肠出血性
大肠杆菌 O157H7 引物只能扩增出肠出血性大肠
杆菌 O157H7 中 287 bp 大小的条带，没有非特异
性条带和引物二聚体 ；金黄色葡萄球菌引物只能扩
增出金黄色葡萄球菌的 354 bp 大小的条带，无非特
异性条带和引物二聚体 ；同样沙门氏菌引物也只能
扩增出沙门氏菌 468 bp 大小的条带，无其他非特异
性条带。这说明所设计的引物具有高度特异性。
1 2 3 4M
500
200
bp
M ：DNA Marker DL2000 ；1 ：三重 PCR 反应结果 ；2 ：沙门氏菌和肠出血性
大肠杆菌 O157H7 ；3 ：沙门氏菌和金黄色葡萄球菌 ；4 ：肠出血性大肠杆
菌 O157H7 和金黄色葡萄球菌
图 2 双重、三重 PCR 反应
2.5 人工模拟样品的PCR检测
将沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌 O157H7 和
金黄色葡萄球菌的培养液单独接种至鲜奶中或任意
两两等量混合取少量接种至鲜奶中培养。经增菌后
提取致病菌基因组 DNA 进行 PCR 反应，结果（图
3）显示，未加致病菌的鲜奶不能检测出特异性条带，
而接种相应致病菌的鲜奶均能检测出对应的特异性
目 的 条 带，Marker 和 PCR 产 物 的 上 样 量 均 为 400
ng。以上结果说明本研究所建立的多重 PCR 检测方
法可应用于食品中的肠出血性大肠杆菌 O157H7、
金黄色葡萄球菌和沙门氏菌 3 种致病菌的检测，且
该方法均有较高的特异性。
3 讨论
在经济发展的现代，健康成为人们越来越关
注的问题，食品的安全问题成为社会关注的焦点。
2014年第7期 67余倩等 ：三种食源性致病菌的多重 PCR 快速检测及应用
PCR 快速检测技术因为其特异性强和灵敏度高，操
作简单，消耗时间和试剂少，现已用于肝炎、艾滋病、
疱疹病毒感染诊断 ［16］，也成为了食源性致病菌的重
要检验方法之一。在 PCR 检测技术基础上发展起来
的多重 PCR 技术也广泛地应用于食品检测方面。
目前用于检测沙门氏菌的靶基因的引物基因
主 要 有 invA、invB、invC、invD、invE、hilA、fimA、
hns、spv 和 16S rRNA，血清群特异性引物基因 rfb
基因和血清型特异性引物基因 fliC、fljB 和 via 基因
等［13］。目前用于检测肠出血性大肠杆菌 O157：H7 时，
主要的毒力基因有 ：编码志贺毒素 stx1 和 stx2 基因、
编码与细菌黏附作用有关的蛋白 eaeA 基因、编码溶
血素 hly 基因［14］。目前，用于检测金黄色葡萄球菌
肠毒素 SE 的相关靶基因有 sea、seb、sec、sed、see、
seh、sei 和 sej 基因［13］，以及编码耐热核酸酶基因
nuc，编码血浆凝固酶 coa 基因 ［15］。通过实验，本
研究所设计的沙门氏菌的引物 hilA-f 可有效扩增出
468 bp 的特异性基因片段，肠出血性大肠杆菌 O157
H7 的引物 rfbE-f 可有效扩增出 287 bp 的特异性基
因片段，金黄色葡萄球菌的引物 nuc-f 可有效扩增出
354 bp 的特异性基因片段，这 3 对引物可成功用于
致病菌的多重 PCR 快速检测，此前未见报道。
在食品中人工添加 3 种致病菌沙门氏菌、肠出
血性大肠杆菌 O157H7 和金黄色葡萄球菌，利用
本实验所设计的 3 对引物可成功的进行多重 PCR 的
快速检测。本研究所建立的 PCR 反应系统具有较好
的特异性，为食品中常见致病菌的检测提供了一种
快速、简便、准确的方法，具有重要的理论意义及
实践意义。
同时多重 PCR 可以与其他技术相结合，如荧光
定量 PCR 相结合，可提高检测效率。或是与其他检
测方法相结合，如基因芯片、实时 PCR 等，可以创
造一个更完整的体系。
4 结论
本研究针对常见的 3 种食源性致病菌肠出血性
大肠杆菌 O157H7 的 rfbE 基因、金黄色葡萄球菌
的 nuc 基因及沙门氏菌的 hilA 基因，设计出相对应
的特异性引物，单重 PCR 结果显示能扩增出与预计
大小一致的片段，没有非特异性扩增。使用设计的
引物对人工感染的鲜奶进行检测，结果表明未加致
病菌的鲜奶不能检测出特异性条带，而接种相应致
病菌的鲜奶均能检测出对应的特异性目的条带。
参 考 文 献
［1］史贤明 , 刘慧 , 刘烈刚 , 等 . 食品安全与卫生学［M］. 北京 ：
中国农业出版社 , 2013 ：30-48.
［2］苏莉莉 . 从食源性疾病的发生看食品安全的重要性［J］. 中国
医药指南 , 2007（4）：115-118.
［3］姚敬业 , 金庆 .1996 年发生在日本的肠出血性大肠杆菌 O157
H7 食物中毒［J］. 安徽预防医学 , 2000, 6（1）：79-80.
［4］金连梅 , 李群 . 2004-2007 年全国食物中毒事件分析［J］. 疾病
监测 , 2009, 6（24）：459-462.
［5］刘雨潇 , 刘士敏 , 王民 , 等 . 分子生物学方法在食品微生物检测
中的应用［J］. 生物技术通讯 , 2009, 20（3）：451-452.
［6］翁思聪 , 朱军莉 , 励建荣 . 水产品中 4 种常见致病菌多重 PCR
检测方法的建立及评价［J］. 水产学报 , 2011（2）：305-314.
［7］Li J, Qi SX, Zhang C, et al. A Two-tube multiplex reverse transcrip-
tion PCR assay for simultaneous detection of sixteen human respira-
tory virus types/subtypes［J］. Biomed Research International,
2013, 327620.
［8］王慧 , 朱瑞良 , 谭燕玲 , 等 . 多重 PCR 检测三种重要食源性
致病菌方法的建立及应用［J］. 中国农业科学 , 2011（11）：
2334-2340.
［9］Chandler D, Wagnon C, Boltonh J. Reverse transcriptase（RT）in-
hibition ofPCR at low concentrations of template and its implications
for quantitative RT-PCR［J］. Appl Environ Microbiologic, 1998,
64（2）：669-672.
1 2 3 4 5 6 7 M
500
200
bp
1 ：无致病菌的牛奶 ；2 ：沙门氏菌和肠出血性大肠杆菌 O157 ：H7 ；3 ：肠
出血性大肠杆菌 O157 ：H7 和金黄色葡萄球菌 ；4 ：沙门氏菌和金黄色葡萄
球菌 ；5 ：沙门氏菌 ；6 ：金黄色葡萄球菌 ；7 ：肠出血性大肠杆菌 O157 ：
H7 ；M ：DNA Marke DL 2000
图 3 人工模拟样品的 PCR 检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期68
［10］姜彦君 , 都启晶 , 赵宏坤 . 食源性致病菌多重 PCR 检测方法
的建立与应用［J］. 中国食品学报 , 2013（10）：162-169.
［11］李丁玲 , 任敬 , 马晓燕 , 等 . 多重 PCR 检测食源性致病菌的研
究［J］. 食品工业 , 2012（10）：159-163.
［12］ Yang MJ, Luo L, Nie K, et al. Genotyping of 11 human papillomav-
iruses by multiplex PCR with a GeXP analyzer［J］. J Med Virol,
2012（6）：546-560.
［13］陈诺 , 唐善虎 , 岑璐伽 , 等 . 多重 PCR 技术在食品微生物检测
中的应用进展［A］. 中国畜牧兽医 , 2010, 37（10）：72-75.
［14］平凡 , 张守勇 , 武盛 . 国内外乳品微生物限量标准的比较［J］.
乳品工业 , 2006（8）：58-60.
［15］范一灵 , 潘峰 , 史贤明 . 金黄色葡萄球菌分子检测技术的常用
靶基因［J］. 微生物学杂志 , 2003, 3（28）：72-76.
［16］赵红庆 , 苑锡铜 , 黄留玉 . 多重 PCR 技术在病原检测中的应
用［J］. 生物技术通讯 , 2007, 18（5）：863-865.
（责任编辑 狄艳红）