全 文 ：2 9 0 0年 1月
第 46卷 第 1期
四 川 大学学报 (自然科学版 )
J o u r na lofS i e h ua nU niv s e rit y ( Na t u ra lS ei e ne e Ed it i o n)
Ja n
.
2 0 09
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46 N
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文章编号 : 04 9 0一 6 756 (2 9 0 0) 1 0一 02 3 3一 0 5
紫茎泽兰提取物抑制食源性致病菌的研究
王 靖 , 谢 明 , 苏文涛 , 钱俊伟 , 皮宁宁 , 苏东海 , 高 平
( 四 Jl 大学生命科学学院生物资源 与生态环境教育部重点实验 室 , 成都 6 1 0 0 6 4)
摘 要 : 用黄茂 ,苦参 , 狼毒提取物 为 阳性对照 对紫茎泽兰提取物进行抑菌活性比较 . 并利 用
液液萃取 、 色谱法对紫荆泽兰醉提物进行分离精制 . 结 果表明 , 紫茎泽兰 醇提物具有 明显抑 菌
效果 ,且效果优于狼毒提取物和黄茂提取物 ; 对紫茎泽兰醇提物进行分离精制及抑菌试验 , 结
果显示其 乙 酸 乙醋萃取物柱层析组分 S F 4一 2 抑菌活性最强 , 能显著抑制沙门 氏菌 , 蜡样 芽抱
杆菌 , 金黄色葡萄球菌和枯草芽抱杆菌生 长 , 可用 于食源性抗菌制 剂的开发利 用 .
关键词 : 紫茎泽兰 ; 抑菌活性 ;食源性致病菌 ; 柱层析
中图分类号 : Q 93 文献标识码 : A
A n t i b a e t e r i a l a c t i v i t i e s ( o n f o o d
一
b o r n e P a t h o g e n ) o f t h e e x t r a e t s f r o m
E u P a t o r i u m a d e n o P h o r u m S P r e n g
W A N G J i n g
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一
T a o
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G A O P i n g
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n is t r y o f E d
u e a t io n
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C o ll e g e o f L if e S e ie n e e s
,
S ie h u a n U n i v e r s i t y
,
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C h i
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A b s t r a e t : T h e a n t ib a e t e r i a l a e t i v i t i e s o f t h e e x t r a e t s f r o m E u P a t o
r i u m a d e n o P h o
r u m S p r e n g o n f o o d
-
b o r n e P a t h o g e n r e s e a r e h w e r e p e全f o r m e d , w h i l e t h e e x t r a e t s o f A s t r a g a l u s m e m b r a n a c e u s ( F i s e h . )
B u n g e
,
S o Ph o ar f l a v e s c e n s A i t
,
S t e l l e r a e h a m a ej a s m e L i n n w e r e u s e d a s p o s i t iv e e o n t r o l s
.
B e s i d e s
,
t h e
e x t r a e t o f E
.
a d e n o Ph o r u m w a s e r u d e l y s e p a r a t e d b y l i q u id
一
l i q u id e x t r a e t i o n a n d t h e n p u r i f i e d b y m e a n s
e o m b i n i n g s i l i e a g e l C o l u m n C h r o m a t o g r a p h y w i t h p o ly a m id e C o l u tn n C h r o m a t o g r a p h y
.
T h e
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a l a e t i v i t i e s o f e x t r a e t f r o m E
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a d e n o Ph o r u m w e r e s t r o n g e r t h a n t h e e x t r a e t s f r o m A s t
r a g a l u s m
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) B u n g e a n d S r e l l e ar c h a m a ej a s m e L i n n
, r e s p e e t iv e l y
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T h e s u b
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f r a e t io n S F 4
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a d e n o P h o
r u m s h o w e d t h e s t r o n g e s t a n t ib a e t e r i a l a e t i v i t i e s
.
W i t h i t
s r e m
a r k a b l
e a n t i b a e t e r ia l a e t i v i t y a
-
g a i n s t S t a P h少 l o c o c l u s a u r e u s , S a lm o n e l l a s P e n t e r i t i d i s , B a e i l l u s c e r e u s , B a c i l l u s s u b t i l i s , E . a d e n o -
P h o
r u m e x t r a e t s h o w e d g r e a t p o t e n t ia l t o b e a p r o m i s in g b a e t e r i a l i n h ib i t o r a g a i n s t f o o d
一
b o r n e p a t h o g e n
.
K e y w o r d s
:
E u P a t o r i u m a d e n o P h o r u m S p r e n g
, a n t ib a e t e r i a l a e t i v i t i e s
,
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一
b o r n e p a t h o g e n
,
C o l u m n
C h r o m a t o g r a p h y
1 引 言
紫 茎 泽 兰 ( E u P at or iu m “ d en o p h or u m
S rP en g ) 原产于中美洲墨西哥 , 属菊科泽兰属 ,为
多年生 、 丛生状半灌木植物 , 叶对生 , 似桑叶 , 根
呈线索状 , 十分发达 lj[ . 从 70 年代 开始传人我 国
并酿成草害 . 紫茎泽兰可形成密集成 片的单种优
势群落 , 排斥其他植物的生长图 , 导致土壤肥力严
收稿日期 : 2 0 0 7一 1 1一 1 9
作者简介 : 王蜻 ( 19 8 2一 ) ,女 , 四川 大学生命学院在读硕士研究生 . E一m ial : iaj ng m e ie r@ 16 3 . co m
通讯作者 : 高平 . E一m a i l : g a o p in g 8 1 9 8@ s o h u . 。 o m
四川 大学学报 (自然科学版 )第 4 6卷
重下降 ,土地严重退化 , 给蔓延区的农林牧副业带
来了严重危 害 2j[ . 鉴于紫茎泽兰 已成为我 国危害
最为严重的外来人侵物种之一 , 在加强控制紫茎泽
兰蔓延措施的同时 , 积极展开其有益方面研究 ,力
图变害为宝 ,为其利用开辟途径 .
农业生产中畜禽经 口感染致病菌导致腹泻常
见且多发闭 ,其中大部分食源性疾病 由病源细菌污
染饲料引起 . 饲料在制作 ,加工 ,贮存过程中均可能
遭到致病性细菌感染闭 . 然而 , 由于抗生素类药物
残留 , 耐药性转移等问题可能导致动物食 品对人体
产生急慢性毒 副作 用等原因困 , 该类药物 直接添
加到饲料中的应用受到限制 . 研究低毒易降解的饲
料天然抑菌剂 ,从植物 中筛选新 的抑菌活性物质 ,
已成为 目前关注的热点困 .
国内外研究已发现许多植物提取物具有抑制
食源菌生长活性 . 苦参醇提物对抑制鸡 白痢沙门氏
菌和鼠伤寒沙门氏菌有一定效果叫 ,黄蔑水提物对
大肠杆菌 , 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效
果 8j[ . 狼毒具有抗 菌抗病毒作用闭 . 我国重要 的外
来物种紫茎泽兰经罗文 富等 ( 1 9 9 9) 研究表 明 ,其
汁液对烟草疫霉有较高的抑制效果 l0[ 〕 , 张培花等
( 2 0 0 5) 阐明紫茎泽兰汁液对马铃薯 晚疫病菌有一
定的抑制作用 〔’ `〕 . 本研究利用紫茎泽兰提取物进
行抑制食源性致病菌研究 ,筛选出具有抗菌活性的
植物源抑菌剂 ,为畜牧业抑菌剂研发提供参考 . 紫
茎泽兰对食源性细菌抑菌活性研究还未见报道 .
2 材料与方法
2
.
1 材 料
供试植物 : 黄茂 ,苦参购于成都市中药材市场 .
狼毒采集 自四川阿坝州 . 紫茎泽兰地上部分 , 采集
自四川省西 昌市 .
供试菌种 : 金 黄色葡萄球菌 ( st a P h刃oc 。 。 l us
a u r e u : C G M C C 1
.
8 9 )
、 蜡 样 芽抱 杆菌 ( B a c i l l u s
c e r e u 、 C G M C C 1
.
1 8 4 6 )
、 枯 草芽抱杆菌 ( B a 。 i l l u s
s u b r i l i : C G M C C 1
.
1 8 4 9 )
、 沙 门氏菌 ( S a l m o n e l -
l a s P
e n t e r i t i d i s C G M C C 1
.
1 17 4 )
.
( C G M C C
:
C h i
-
n a G e n e r a l M i e r o b i o l o g i e a l C u l t u r e C o l l e e t i o n
C e n t e r )
. 由本实验室保存 .
供试药剂 : 试剂 均为国产分析纯 . 硅胶树脂 ,
聚酞胺树脂购于成都长征公司 .
2
.
2 方 法
2
.
2
.
1 体外抑菌活性检测 本实验采用平皿打孔
法山〕 . 将灭菌后 的固体牛 肉膏蛋 白脏培养基倒人
直径为 90 m m 的平皿 中 , 待培养基冷却后再倒人
一层固体牛肉膏蛋 白脏培养基 . 将各菌悬液浓度稀
释为 10 , 个 / m L , 接种到培养基上 , 涂布器涂满整
个平面 . 打孔器在上层培养基打孔 (孔径 6 m m ) ,
各孔取供试提取物溶 于 10 %二 甲基亚枫 (药液浓
度为粗膏 10 0又 1 0一 , g /m L , 萃取物 10 0 X 10 一 ’ g /
m L
, 色谱柱流份 5 0 火 10 一 3 9 / m L ) , 每孔加 人 5 0
拼 L , 37 ℃培养 24 h ,用游标卡尺测量抑菌圈大小 ,
重复 3 次 ,计算其平均值和标准差 , 同时以 10 %二
甲基亚枫为空白对照 .
2
.
2
.
2 乙 醇粗提物 的 制备 将黄茂 、 苦参 、 狼毒 、
紫茎泽兰 4 种植物各取 50 9 , 晒干 , 打碎 , 过 2 0
目筛 , 以 5 , 1( 提取溶剂 /样品 , v/ w ) 的比例加人
9 5% 乙醇浸提 , 抽滤 . 滤 渣用相 同体积 95 % 乙醇
重复提取一次 , 抽滤 . 合并两次滤液 , 旋转蒸发浓
缩 ,挥干溶剂 乙醇 ,得到乙醇粗提物 ,取部分粗提物
重溶于 10 %二 甲基亚枫 ,进行体外抑菌活性检测 .
2
.
2
.
3 紫茎泽兰精提物的制备 将乙醇粗提物以
25 0 m L 体积分数为 20 %的乙醇溶解 , 用等体积石
油醚 (沸程 60 一 90 ℃ )萃取两次 ,合并两次上相得
到石油醚相 ; 合并 的下相以等体积乙 醚萃取两次 ,
合并两次上相 ,得到 乙醚相 ; 合并 的下相再与等体
积 乙酸乙酷萃取两次 ,得到上相为乙酸乙酷相及乙
酸乙醋沉淀相 . 旋转蒸发浓缩 , 挥干溶剂 ,得到各
相提取物 ,分别取部分各相提取物重溶 于 10 %二
甲基亚矾 ,进行体外抑菌活性检测 .
取具有最高抑菌活性 的萃取相组分用硅藻土
拌匀 , 过 2 0 一 3 0 目硅胶柱 , 洗脱剂 为石油醚和
乙酸乙醋配 比组合 ,通过调节石油醚和乙酸乙酷 比
例 ,逐步加大洗脱剂极性 , 分步洗脱收集流份 , 每
份 10 0 m L , 各流分经薄层层析检验 (硅胶 G F 25 4 ,
展开系统 乙酸 乙酷 /石油醚 /甲酸 一 6 , 3 , 1 , 2 54
n m 和 3 6 5 n m 紫外灯下检测 )指导合并为 8 个段 ,
依次标记为 F l ~ F S , 经减压浓缩 , 挥干溶剂 , 保
存 .
选取具有最高抑菌活性硅胶柱流份用聚酞胺
( 1 0 0 ~ 2 0 0 目 ) 拌匀 , 过聚酞胺 ( 1 0 0 一 2 0 0 目 )柱 .
洗脱剂为乙 酸乙醋 和乙 醇配 比组合 , 极性逐步加
大 , 最后用 0 . 01 m ol / L 氢氧化钠洗脱 . 收集各流
份 (每份 10 m L ) , 各流份经聚酞胺薄膜层 析检验
(展开系统乙酸乙酷 / 乙醇一 1 , 4 , 2 54 n m 和 3 65
n m 紫外灯 下检 测 ) , 指导合 并为 4 个 段 , 依 次为
S F 4
一
1 到 S F 4一4 ,减压浓缩 ,挥干溶剂 ,保存 .
2
.
2
.
4 数据处理 用 S P S S 软件对实验数据进行
第 1期 王睛等 :紫 茎泽兰 提取物抑 制食源性致病 菌的研究
统计分析 ,计算观察指标的均数与标准差 ,进行方
差分析和各组间 t 检验 . 尸 < 0 . 05 ,判为差异显著 .
3 结果与分析
3
.
1 四种植物乙醇提取物对食源菌的抑制效果
分别测定 了 4 种植物 95 % 乙醇提取物的抑菌
活性 (表 1 , 图 1) . 实验表明 , 4 种植物的 95 %醇提
物均对 4 种食源菌有不同程度的抑制作用 ,与空白
组相比 , 抑制作用显著 . 其 中黄蔑 , 苦参 , 狼毒提取
物对枯草芽抱杆菌和蜡样芽抱杆菌抑制效果 优于
其他两种细菌 , 而紫茎泽兰对沙门氏菌抑制效果较
好 , 显著高于其他三种植物提取物的抑制作用 . 比
较四种植物提取物粗膏对除沙 门氏菌外的其余 三
种食源性细菌的抑制作用 , 紫茎泽兰提取物抑菌活
性低于苦参提取物 , 显著高于黄茂提取物 ,也 高于
狼毒提取物 .
表 1 4 种植物提取物抑制食源性细菌效果研 究
T a b
.
1 A
n t i b
a e t e r i a l
a e t iv i t ie s o f
e t h
a n o l e x t r a e t s f r o m f o u r P ]a n t s
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e t e r o f i n h ib i t i o n
z o n e ( m m )
B
a e t e r i u m 黄蔑 苦 参 狼毒
B a
c i l l u s s u b t i l王s
S a l m o n
e l l a s P
e n t e r 乞t id王s
6 “ c i l l u s e e er u s
S t a P h 夕 l o e o e l u s a u r 已 u s
8士 0 . 5 4
7士 0 . 7
8士 0 . 6 2
7士 0 . 8
1 3士 1 1
1 0士 0 . 5 4
1 6士 1 . 2 5
1 2士 0 . 7 8
1 0士 0 . 2 5
7士 0 . 6
1 0士 0 . 2 2
1 3士 0 . 42
紫茎泽 兰
11士 0 . 9
14士 1 . 3
11士 1 , 1
1 0士 0 . 8
”
n o i n h ib i t io n d
e t e e t e d , N
: n e g a t i
v e e o n t r o l ; 12 i n e l
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( 6 m m ) ; v
a
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e s a r e g i v o n a s m e
a n 士 5 . D o f
t r ip l i
e a t e e x p e r im e n t
.
图 1 四 种提取物对 四种食源 性细 菌的抑制作 用
F ig
.
1 A n t i b
a e t e r i a l
a e t iv i t ie s o f e t h a n o l e x t r a e t s f r o m f o u r P la n t s
A
: 黄蔑提取物 ; B : 苦参提取物 ; C : 狼毒提取物 ; D : 紫茎泽兰提取物 ; E : 空 白对照
3
.
2 紫茎泽兰乙醇各萃取相的抑菌效果
分别测定了紫茎泽兰 95 % 乙醇提取物经液液
萃取后各萃取相 的抑菌活性 (表 2) . 实验表 明 , 紫
茎泽兰各萃取相对 4 种细菌均有不同程度的抑制
作用 ,与空 白相比差异显著 , 沉淀相未见抑菌作用 .
抑菌活性 比较 , 乙酸 乙醋相优 于乙醚相 , 乙醚相优
于石油醚相 . 且 乙酸 乙醋 相抑菌效果 优于 乙 醇粗
膏 . 选择乙酸乙酷相进行活性跟踪 .
四川 大学学报( 自然科学版 )第4 6卷
表 2紫茎泽兰乙 醇各萃取相抑制食源性 细菌研究
T ab
.
2 Ant ib ae te r i ale at iv it ie s ofv r ai ou sfe r at i on sfr om E u P at or ium ade n o Phu r om S pe r ng
Inh ib it i on :one of fr
ae t i n os( 10 0 0 X 1 一 “g /m L )m m ( )
Bae te r ium He x
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S al扭 on已 l l as P巴几t 巴r 饭艺艺 d戈 s
B
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S t aPh 夕 loe oc lu s“u e ru s7 士1 . 5 2
1 2士0 .7
13 士0 .7 8
3 1 士0 .3 8
1 1 士0 . 6
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14 士0 .7 5
7 1 士0 .7 8
17 士0 . 62
, ,一 ” n o i n h ib i t i o n d e t e e t e d ; N : n e g a t i v e e o n t r o l ; 12 i n e l u d e s d i a m e t e r o f d i s e ( 6 m m ) ; V a lu e s a r e g i v e n a s m e a n 士 5 . D o f
t r ip l i e a t e e x P e r im e n t
3
,
3 紫茎泽兰萃取相硅胶柱层析各流份抑菌活性
测定
将紫茎泽兰的乙酸乙醋萃取相过硅胶柱层析
分离 ,共得到 8 个组分 . 将这 8 个组分分别按打孔
法检测抑菌活性 ,结果表明各组份对四种细菌均有
抑制作用 , 与空 白比较差异显著 (表 3 ) . 枯草芽抱
杆菌最 敏感 , 其中组分 S F 4 和 S SF 对枯草芽抱杆
菌的抑制作用较其他组分更强 , 差异显著 . S F 4 对
金黄色葡萄球菌的抑制作用与其他组分相比 , 效果
更好 , 差异显著 . S F 4 对其他两种菌 的抑制作用也
较强 . S F 4 对 四种细菌的抑菌效果高于未分离前的
乙酸乙醋萃取相 . 因此选择流份 S F 4 做抑菌活性
跟踪 .
表 3 紫茎泽 兰萃取相硅胶柱层析各流分抑制食源性细菌效果研究
T a b
.
3 A n t ib
a e t e r ia l
a e t iv i t i e s o f
v a r io u s s u b
一
f
r a e t io n s f r o m a e e t i e e t h e r l a y e r
I n h ib i t i o n
z o n e o f s u b
一
f r a e t i o n s o f e t h y l a e e t a t e la y e r ( 50 X 10 一 “ g / m L ) ( m m )
B a e t e r iu m
S F I S F Z
16士 0 .
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15士 1
S F 3 S F 4 S F S S F 6 S F 7 S F S N
B
a c i之l u s s u b t i l i s
S a lm o 刀 e l l a s P e左 t e r ￡t i d ` s
刀u e i l l u s c e r e u s
所 a P h夕 l o e o c l “ s “ u 犷 e u s
1 6士 1
1 4士 2 . 1
1 2士 0 . 72
1 0士 0 . 6 12士 0 . 6
14士 0 . 3 7
1 4士 1
1 4士 0 . 3
1 3士 0 . 8
2 0士 0 . 5 4
15士 3
1 4士 0 . 2 6
1 7士 0 . 45
2 0士 0 . 2 1
16士 0 . 6 6
1 3士 0
1 3士 0 . 74
12士 0 . 5 4
1 4士 0 . 3 2
1 0士 0 . 5
1 2士 O
1 5士 0
1 4士 0 . 4
1 4士 O
1 3士 0 . 3
1 2士 0 . 6 4
1 3士 0 . 6 8
1 0士 0 . 4
1 0士 0 . 4
75
3
9
“ 一 ` , n o i n h ib i t i o n d e t e e t e d ; N : n e g a t i v e e o n t r o l ; 12 i n e lu d e s d i a m e t e r o f di s e ( 6 m m ) . V a l u e s a r e g i v e n a s m e a n 士 5 . D o f t r i Pl i e a t e e x -
P e r lm e n t
-
3
.
4 紫茎泽兰硅胶柱流分 S F 4 聚酞胺柱层析各 个组分分别通过打孔法检测抑菌活性 , 表明各流份
流分抑菌活性 对 四种细菌均有抑制作用 , 与空 白相 比差异显著 ,
由于流份 S F 4 在硅胶薄层上点样得到的点 R f 其 中 S F 4一 2 组分最为有效 (表 4) . S F 4一 2 抑制食源
值极其相近 ,不易分开 . 将硅胶柱层析得到的流份 性 细菌 效果 优 于其他 组分 , 也 优 于未分 离前 的
S F 4 过聚酞胺柱层 析分离 ,得 到 4 个组分 . 将这 4 S F 4 . 且对枯草芽抱杆菌的抑制效果最好 .
表 4 S F 4 聚酞胺柱 层析各流分抑制食源性细菌效果研 究
T
a b
.
4 A
n t ib
a e t e r ia l a e t i v i t i e s o f v a r i o u s s u b
一
f r a e t i o n s f r o m S F 4
In h叹b i t亏o n z o n e o f s u b一 f r a c t i o n s o f SF 4 ( 5 0 X 1 0一 “ g /m L ) ( m m )
B a e t e r i u m —S F 4一 l S F 4一 2 N3 3458B a c 艺l l u s s u b乙111 5S a l m o n e l l a s P e n t e r i t id i sB a e 饭l l u s c e r e u sS t a P h夕 l o c o c l u s a u er u s 2 0士 0 . 351 2士 0 . 61 5士 0 . 671 0士 0 . 4 2 2士 0 . 51 5士 01 5士 Q . 3 42 0士 0 S F 4一 314士 0 .9士 .0 49士 0 . 3 49士 0 S F 4一 41 2士 09士 .01 4士 0 .1 1士 0n o i n h ib i t i o n d e t e e t e d ; N : n e g a t i v e e o n t r o l ; 12 i n e lu d e s d i a m e t e r o f d i s e ( 6 m m ) . V a lu e s a r e g i v e n a s m e a n 士 5 . D o ft r ip li e a t e e x P e r im e n t .
第 1期 王蜻等 :紫 茎泽兰提取 物抑制食 源性致病菌的研究
4 讨 论
紫茎泽兰作为我国重要的外来人侵生物 , 以密
集成片的生物学特性和惊人的繁殖能力排斥其他
植物生长 , 对我国农牧业 生产 起到 巨大的破坏作
用 l[ 3〕 , 引起多种环境问题 l[ 4〕 . 而将机械挖除的紫茎
泽兰焚烧或掩埋 ,既造成环境污染也不利于资源的
再利用 15[ 〕 . 因此将紫茎泽兰变废为 宝已成为 目前
国内外研究热点 . 本文选择供试菌种均为农业生产
中常见的导致动物腹泻的致病菌种〔 ’ 6一川 , 比较紫
茎泽兰与其他植物源提取物抗菌活性效果 , 追踪紫
茎泽兰有效活性成分 ,为紫茎泽兰作为农用抑菌剂
的开发利用提供参考 .
通过抑菌实验 , 表明紫茎泽兰抑菌活性 略弱
于苦参提取物 ,强于狼毒提取物和黄茂提取物 . 这
四种植物提取物对革兰 氏阳性菌和阴性菌均有抑
制作用 . 黄蔑 ,苦参 ,狼毒各植物提取物和紫茎泽兰
经液液萃取和柱层析分离后得到的各组分对革兰
氏阳性菌抑制效果强于阴性菌 . 这也与国内外的报
道一致 . P al o m b o( 2 o o l) 研究证明革兰氏阴性菌外
层细胞壁起到阻拦作用 , 使得许多外界物质包括抗
生素无法进人 , 因而 比阳性菌有更强的抗杀灭作
用 [ 20〕 .
利用生物活性跟踪法 ,将紫茎泽兰的醇提物逐
步分离纯化 . 随着不断的精制和抗菌活性物质的富
集 ,其抗菌活性逐步增强 . 实验表明 , 紫茎泽兰的抗
菌活性物质分布在萃取相中的乙醚相和乙酸乙醋
相部分 , 且乙酸乙酷相活性强于乙醚相 . 随着色谱
柱的分段 洗涤 , 抗 菌活性 物质主要集 中在 S4F 一2
段 , S F 4一 2 段的物质成分有待进一步研究 .
紫茎泽兰分布广泛 , 材料易得 , 并且高平 ,刘
燕萍等 ( 2。。 5) 报道紫茎泽兰 95 % 乙醇提取物对 昆
明种小鼠 L D S。大于 5 0 0 0 m g / k g , 大白兔急性毒性
实验为阴性 . 说明紫茎泽兰醇提物对哺乳动物基本
无毒 l2[ 口 ,作为农用动物抑菌剂安全可靠 . 可为紫茎
泽兰进一步利用开发提供参考 .
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[责任编辑 : 白林含〕
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