全 文 ：第 34卷 第 6期 生 态 科 学 34(6): 3641
2015 年 11 月 Ecological Science Nov. 2015
收稿日期: 2015-05-04; 修订日期: 2015-06-05
基金项目: 华南农业大学国家级创新训练项目(编号: 201310564050)
作者简介: 罗琪宇(1993—), 女, 本科生, 主要从事转基因生物安全性评价研究, E-mail: 1359711536@qq.com
*通信作者: 王建武, 男, 教授, 主要从事转基因生物安全性评价及循环农业研究, E-mail: wangjw@scau.edu.cn
罗琪宇, 方扬, 张定鹏, 等. 转基因番木瓜 PCR 快速检测体系的优化[J]. 生态科学, 2015, 34(6): 3641.
LUO Qiyu, FANG Yang, ZHANG Dingpeng, et al. Optimization of PCR-based method for rapid detection of genetically modified
(GM) papaya[J]. Ecological Science, 2015, 34(6): 3641.
转基因番木瓜 PCR 快速检测体系的优化
罗琪宇 1,2,3, 方扬 1,2,3, 张定鹏 1,2,3, 朱鹏 1,2,3, 谈凤笑 1,2,3, 王建武 1,2,3,*
1. 华南农业大学农学院, 广州 510642
2. 华南农业大学农业部华南热带农业环境重点实验室, 广州 510642
3. 华南农业大学广东省高等学校农业生态与农村环境重点实验室, 广州 510642
【摘要】随着公众对转基因食品安全性的关注, 转基因番木瓜的快速检测技术成为关键问题。优化了番木瓜总 DNA
的提取方法, 选用木瓜蛋白酶基因(Papain)作为内源参照基因, 建立了转基因番木瓜 GM YK 和华农一号的双重 PCR
定性检测方法。通过对广州市超市和批发市场 222 个样品的检验, 并与 SN/T 2653—2010 行业标准对比, 证明该方法
具有污染少、速度快、成本低的优点。
关键词：转基因番木瓜; 品系鉴定; PCR 检测; DNA 提取
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2015.06.006 中图分类号：S158 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2015)06-036-06
Optimization of PCR-based method for rapid detection of genetically modified
(GM) papaya
LUO Qiyu1,2,3, FANG Yang1,2,3, ZHANG Dingpeng 1,2,3, ZHU Peng1,2,3, TAN Fengxiao1,2,3, WANG Jianwu1,2,3,*
1. College of Agriculture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
2. Key Laboratory of Agro-Environments in Tropics, Ministry of Agriculture, South China Agricultural University,
Guangzhou 510642, China
3. Key Laboratory of Agroecology and Rural Environment of Guangdong Regular Higher Education Institutions, South
China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: The safety of genetically modified (GM) food has attracted much attention recently. Demands for developing rapid
identification method of GM crops in food have been increased dramatically. In this study, a rapid method for detection of
genetically modified papaya by multiplex polymerase chain reaction (PCR) was developed. The method for the extraction of total
DNA method was optimized, the Papain was used as an endogenous reference gene, and a double PCR qualitative way to detect
GM papaya varieties ‘GM YK’ and ‘Huanong No.1’ was established. Through testing 222 papaya samples from supermarkets and
wholesale markets in Guangzhou, the new established double PCR qualitative detection method shows advantages of less pollution,
quicker detection and lower cost as compared with the results of industry standard SN/T 2653—2010.
Key words: GM papaya; cultivar identification; PCR test; DNA extraction
1 前言
番木瓜(Carica papaya Linn.) 属于番木瓜科番
木瓜属, 是热带亚热带重要的水果, 在我国南方尤
为受欢迎, 素有“岭南佳果”的美称。其果实可鲜食亦
可被烹饪成佳肴食用, 也可被加工成饮料、果冻、
6 期 罗琪宇, 等. 转基因番木瓜 PCR 快速检测体系的优化 37
果脯、木瓜膏等食品。
从上个世纪开始, 由于番木瓜环斑病毒(papaya
ringspot virus, PRSV)的危害, 世界各地的番木瓜生
产受到严重影响[1]。PRSV 属于马铃薯 Y 病毒属成
员, 通过非持久性传毒的蚜虫进行传播[2]。由于缺乏
天然的抗病资源, 通过传统育种方式难以获得抗病
毒木瓜品种[3,4]。转基因技术是培育抗病品种的有效
途径[5]。1990 年首例转 PRSV 衣壳蛋白(coat protein,
CP)基因番木瓜问世, 美国在 1991 年获得了首个转
基因番木瓜品系 Event 55-1, 商品名称为 SunUP(日
升)和 Rainbow(彩虹)[6], 它们在田间试验中表现出
对番木瓜环斑病毒的良好抗性, 并于 1998 年 5 月在
夏威夷正式投入商业化生产[7]。后于 2008 年, 美国
佛罗里达州立大学的研究人员获得了转基因番木瓜
株系 UFL-X17CP-6(X17-2) [8]。GM YK 为中国台湾
流行株系 PRSV YK 转化当地品种后获得的品系[9]。
到目前为止, 全世界已获准商业化种植的抗病毒转
基因番木瓜有 Event 55-1、X17-2 和华农一号三个品
系, 但正进行田间试验的转基因番木瓜种类众多
[10]。我国仅华南农业大学李华平等培育的高抗
PRSV 的转基因番木瓜“华农一号”在 2006 年通过农
业部的批准被允许在中国境内生产和销售[11]。
随着转基因番木瓜的不断商业化, 研究开发快
速高效、简便经济的多基因同时检测技术成为了现
实需要。现在已经建立的检测方法中以基于其中外
源 DNA 检测的 PCR 方法应用最广泛[12]。现有报道
中番木瓜总 DNA 的提取方法较为常用的是 CTAB
法和试剂盒法[13–17], 但是大都采用液氮手工研磨,
比较费时费力。本研究采用 FastPrep-24 仪器研磨提
取总 DNA, 避免了人工研磨样品破碎程度不同、
DNA 产率不一致、PCR 反应需要进行逐个调模板质
量浓度的烦琐操作等问题, 使番木瓜的 PCR 检测规
模化、标准化快速分析成为可能[18]。值得注意的是,
本研究在研磨之前先加入了DNA提取液, 以防止因
为研磨产生高温而导致DNA降解, 能高通量与高质
量的提取番木瓜 DNA, 为后续试验提供更好的样品
基础, 优化了番木瓜的总 DNA 提取方法。针对市场
上可能遇到的转基因番木瓜种类, 本研究选用木瓜
蛋白酶(Papain)基因作为内源基因、CaMV35S 启动
子作为转基因筛选检测基因, 结合现有的报道选择
55-1、GM YK 和华农一号品系 (Event)的特异 PCR
引物[10], 优化了 PCR 的条件, 建立了 3 个抗病毒转
基因番木瓜的品系共用的特异性双重PCR定性检测
方法。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品
试验所用的阳性参照、阴性参照和待测番木瓜
样品的种类和来源见表1、表2。除阳性参照与阴性
参照材料取自番木瓜植株的叶片外, 其余样品材料
均取自番木瓜皮。
2.1.2 试剂
Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液购自TaKaRa生
物有限公司; CTAB购自Promega公司; CWBIO新型
植物基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科技
有限公司 ; 其他常用试剂为国产分析纯。选用
CaMV35S启动子作为转基因筛选检测基因 [19], 以
Papain基因作为内参基因[20], 具体的引物参考《中
华人民共和国出入境检验检疫行业标准木瓜中转基
因成分定性 PCR 检测方法》(SN/T 2653—2010)的
引物信息[21](见表2), 所有引物由上海生工生物技术
有限公司合成。
2.1.3 主要仪器和设备
FastPrep-24样品快速制备系统(美国MP公司)、
高速离心机(Eppendorf公司)、170-9703型PCR仪(美
国Bio-Rad公司)、电泳仪(DYY-6C北京六一仪器厂)、
GelDoc XR型全自动凝胶成像系统(美国Bio-Rad公
司)、DK-8D型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有
限公司)。
2.2 方法
2.2.1 不同番木瓜总 DNA 提取方法的比较
各取约0.3 g新鲜番木瓜皮分别作5种处理。处理
一: 样品放入2 mL冷冻管后直接在FastPrep-24仪上
研磨至粉末状后, 添加CTAB缓冲液; 处理二: 样品
表 1 番木瓜阳性与阴性对照样品
Tab. 1 Positive and negative samples of papaya
样品
编号 样品名称 来源 备注
1 转基因番木瓜 GM YK系列(叶片) 华南农业大学 阳性参照
2 转基因番木瓜华农一号(叶片) 华南农业大学 阳性参照
3 非转基因番木瓜
Malaysia(叶片) 华南农业大学 阴性参照
38 生 态 科 学 34 卷
表 2 广州市采集的番木瓜待测样品
Tab. 2 Papaya samples collected from Guangzhou
鲜木瓜 加工品
采样地点 数量/个 奶制品类/份 果蔬类/份
江南水果批发市场(白云区) 60 风行木瓜牛奶 地扪糖水热带杂果
天平架水果批发市场(天河区) 27 香满楼木瓜牛奶 特别好热带杂果
花都水果批发市场(花都区) 26 晨光木瓜牛奶饮品 都乐热带杂果
水果土特产一条街(南沙区) 16 晨光岭南食尚木瓜牛奶饮品 鹰金钱红枣莲子炖木瓜
新垦综合市场(南沙区) 12 卡士木瓜酸乳 鹰金钱冰糖雪耳木瓜
大沙综合批发市场(黄埔区) 11 鲜键木瓜牛奶饮品 嘉丽果木瓜汁
东城水果批发市场(番禺区) 7 维记木瓜牛奶 papaya juice
增城水果批发市场(增城市) 9 伊利大果粒风味发酵乳 果汁先生木瓜苹果汁
河东水果批发市场(从化市) 6 阿莎力木瓜牛奶 阜康木瓜干(中国台湾)
芳村水果批发市场(荔湾区) 1 燕塘食膳养生木瓜牛奶 泰奥琪木瓜干
市桥水果批发市场(番禺区) 1 燕塘木瓜酸奶 卡弗木瓜干
华润万家超市(龙洞店) 1 多美鲜水果坚果奶酸 春光速溶木瓜粉
百佳超市(正佳广场店) 2 伊利味可滋木瓜奶昔乳饮品 素玛哥木瓜味果冻(马来西亚)
卜蜂莲花超市(长兴店) 3 果享学生奶粉 南国木瓜糕
吉之岛超市(天河城店) 1 - 恒寿堂密炼木瓜茶
世纪联华超市(九洲店) 1 - 多美乐蜂蜜木瓜茶
家乐福超市(康王店) 2 - 统一木瓜椰子饮品
人人乐超市(增城店) 2 - -
沃尔玛超市(龙口西店) 1 - -
大润发超市(番禺店) 2 - -
总计 191 14 17
表 3 抗病毒转基因番木瓜及内源基因的扩增引物
Tab. 3 Primer sequences of GM papaya specific genes and endogenous reference genes for PCR amplification
PCR 体系 引物名称 引物序列(5’-3’) 检测基因 产物长度/bp
Papain f tgcttgactgcgacagac 内源基因
Papain r ctttctcccttgagcgac
Papain gene 144
CaMV 35S f acgcacaatcccactatc
PRSV cp r cacatc(a/g)tttccgtcacta
55-1/GM YK 品系特异基因 322/243
CaMV 35S f acgcacaatcccactatc
特异性检测
PRSV rep r gcttcctcattacactcc
华农一号品系特异基因 213
与CTAB缓冲液共同加入2 mL冷冻管再置于FastPrep-
24仪上研磨至粉末状; 处理三: 样品加入2 mL冷
冻管后直接在FastPrep-24仪上研磨木瓜皮至粉末状
后加试剂盒中的Buffer LP1试剂; 处理四: 将样品与
试剂盒中的Buffer LP1试剂共同加入2 mL冷冻管,
置于FastPrep-24仪上研磨至粉末状; 处理五: 采用
液氮手工研磨木瓜皮至粉末状后加CTAB缓冲液
(FastPrep-24仪震荡时间为60 s, 震荡强度为6)。后
续的DNA抽提步骤按照赵琳娜改进CTAB法 [16]或
新型植物基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物
科技有限公司)使用说明书进行操作。所得的总
DNA以w=1%琼脂糖凝胶电泳(0.5×TAE) 检测所
提取DNA的质量。从中选出最适合的方法用作其
余番木瓜样品、阳性参照与阴性参照的DNA提取。
将提取的番木瓜总DNA溶液放置于–80 ℃冰箱中
保存备用。
2.2.2 设置对照
阳性参照以含有转基因序列的番木瓜叶 DNA 为
模板, 阴性参照以非转基因番木瓜叶的 DNA 为模板,
并设有PCR反应的空白对照(以蒸馏水代替DNA模板)。
6 期 罗琪宇, 等. 转基因番木瓜 PCR 快速检测体系的优化 39
2.2.3 PCR 检测方法比较
采用TaKaRa公司的PCR试剂, 使用引物papain
f/papain r、CaMV 35S f/PRSV cp r 和 CaMV 35S
f/PRSV rep r为引物(表 2)进行 PCR特异性扩增检测,
比较单重 PCR 和双重 PCR(利用两种引物组合
Papain f/Papain r 与 GM YK 35S f/PRSV CP r、Papain
f/Papain r与GM YK 35S f/PRSV Rep r)检测方法, 确
定番木瓜基因组中是否含有转基因成分。PCR 扩增
检测体系总体积为 25 uL。所用的 PCR 反应条件均
为: 94 ℃预变性 5 min; 94 ℃变性 45 s, 54 ℃退火
60 s(预备实验采用退火温度为 50-60 ℃, 最后确定
最佳退火温度为 54 ℃), 72 ℃延伸 60 s, 29 个循环;
72 ℃延伸 5 min。经比较选择出较优的方法用于其
余样品的 PCR 检测。PCR 产物经 1.5%的琼脂糖凝
胶电泳 EB 染色后, 在凝胶成像仪上观察结果。
2.2.4 PCR 产物的序列测定
取上述 PCR 产物 7 份送至 Invitrogen 公司进行
克隆序列测定。将获得的序列在 NCBI 中进行序列
同源性比对。
3 结果
3.1 番木瓜的总 DNA 提取
番木瓜总 DNA 提取方法的结果比较见图 1。从
图中可以看出: (1)研磨方法采用 FastPre-24 仪器研
磨比液氮手工研磨更好, 处理四 4 比处理五获得的
总 DNA 量更多, DNA 降解更少, 更大缩短实验时
间。(2)先加 CTAB 缓冲液或试剂盒中的 Buffer LP1
后研磨比直接研磨更好, 处理二、处理四比处理一、
处理三获得的总 DNA 更集中, 拖带更少, 效果更
好。(3)试剂盒法比 CTAB 法更好, 处理三、处理四
比处理一、处理二与处理五提取出的基因组的完整
性更好, 稳定性更高。
3.2 番木瓜样品的双重 PCR 分析
转基因番木瓜单重 PCR 和双重 PCR 检测结果
见图 2。单重 PCR 结果表明: (1)以阳性参照 GM YK、
华农一号和阴性参照非转基因番木瓜的 DNA 为
模板, 利用引物 papain f/papain r 能扩增出清晰条
带, 且片段大小与预期相符, 表明用于番木瓜内源
基因(Papain)检测的引物具有良好的特异性, 可用
于 PCR 反应的质量控制(图 2); (2)以待测样品的
DNA 为模板, 用引物 CaMV 35S f/PRSV rep r 扩增
华农一号, 华农一号转基因品系均出现了条带, 条
带大致位于 200 bp 到 300 bp 之间, 片段大小与预期
相符(克隆序列测定后确定为 213 bp), 表明引物具
有良好的特异性(图 2); (3)同理, 引物 CaMV 35S
f/PRSV cp r 用于 GM YK 扩增品系转基因番木瓜
时也具有良好的特异性(图 2)(克隆序列测定后确
定为 243 bp)。已有报道显示引物 CaMV 35S
f/PRSV cp r 同样也适用于 55-1 品系转基因番木
瓜(扩增片段大小应为 322 bp)[15]。
图 1 5 种方法提取的番木瓜果皮总 DNA 电泳图
Fig. 1 Gel electrophoresis of papaya peel total DNA extracted with five methods
注: M 为 200 bp DNA ladder。泳道 1-5 来自样品 1, 泳道 6-10 来自样品 2。泳道 1、6 为处理一:样品(FastPrep-24 仪研磨)+CTAB 缓冲液; 泳
道 2、7 为处理二: CTAB 缓冲液+样品(共同在 FastPrep-24 仪研磨); 泳道 3、8 为方处理三: 样品(FastPrep-24 仪研磨)+试剂盒 Buffer LP1; 泳道
4、9 为处理四: 试剂盒 Buffer LP1+样品(共同在 FastPrep-24 仪研磨); 泳道 5、10 为处理五: 样品(液氮手工磨样)+CTAB 缓冲液。
40 生 态 科 学 34 卷
图 2 抗病毒转基因番木瓜单重 PCR 和双重 PCR 检测结果
Fig. 2 Single and double PCR amplifiable results of virus-resistant GM papaya
注: M 为 100 bp DNA ladder。图 2-A: 引物 Papain f/Papain r 的扩增结果(泳道 1—4 为 GM YK、华农一号、非转基因番木瓜、空白对照); 图
2-B: 引物 GM YK 35S f/PRSV CP r 的扩增结果(泳道 5—8 为 GM YK、华农一号、非转基因番木瓜、空白对照); 图 2-C: 引物 GM YK 35S f/PRSV
Rep r 的扩增结果(泳道 9—12 为 GM YK、华农一号、非转基因番木瓜、空白对照); 图 2-D: 双重 PCR 检测结果(泳道 13、14 为引物组合 Papain
f/Papain r 与 GM YK 35S f/PRSV CP r 扩增 GM YK 和非转基因番木瓜, 泳道 15-17 为引物组合 Papain f/Papain r 与 GM YK 35S f/PRSV Rep r 扩
增华农一号、非转基因番木瓜、空白对照)。
在此基础上, 利用两种引物组合Papain f/Papain
r与GM YK 35S f/PRSV CP r、Papain f/Papain r与GM
YK 35S f/PRSV Rep r 建立双重PCR定性检测方法。
结果表明, 双重PCR产物的电泳条带清晰, 根据引
物扩增产物的大小能区分各片段 , 能鉴定出GM
YK、华农一号2种品系转基因番木瓜(待测样品没有
检测到55-1品系)。进一步对抽取的样品扩增产物进
行克隆测序分析, 结果表明所获得的样品序列与阳
性参照序列同源性达到100%, 并且经NCBI的
BLAST同源性比对证实所获得的序列为GM YK和
华农一号品系的转基因番木瓜品种。图3进一步表明
该双重PCR定性检测方法适用于本研究中其余番木
瓜样品的快速检测。
4 讨论
已有报道表明番木瓜的不同组织、不同公司的
DNA提取试剂盒对番木瓜总DNA获得量也有影响。
本研究曾对番木瓜果皮、果肉和番木瓜加工品的总
D N A提取进行对比 , 也对比使用C TA B法、
FOREGENE试剂盒法(成都福际生物技术有限公
司)、CWBIO试剂盒法[13–17]。结果也显示了与前人
类似的结果, 即在相同的总DNA提取方法下, 番木
瓜果皮比果肉的总DNA含量更高。而不同总DNA提
取方法下, 赵琳娜的改进CTAB法和CWBIO试剂
图 3 部分样品的双重 PCR 电泳图
Fig. 3 Gel electrophoresis of double PCR
注: M 为 100 bp DNA ladder。图 3—A: 市售 GM YK 品系转基因番木瓜的电泳结果(泳道 1—4 为 1 号阳性参照、3、4、5 号番木瓜样品);
图 3—B: 市售华农一号品系转基因番木瓜的电泳结果(泳道 1-4 为 2 号阳性参照、6、7、8 号番木瓜样品)。
6 期 罗琪宇, 等. 转基因番木瓜 PCR 快速检测体系的优化 41
盒法提取的果皮总 DNA 质量较好, 能为后续 PCR
特异性检测提供质量保障。因此, 本研究推荐使用
FastPrep-24 仪结合试剂盒法(先加试剂盒中的 Buffer
LP1 再用仪器研磨)提取番木瓜总 DNA。目前番木瓜
加工品多为木瓜乳制品 (在广州连锁超市中占
45.16%), 但本研究实验表明以上方法匀不适用于木
瓜奶加工品中的番木瓜总DNA的提取, 这将是今后
的番木瓜转基因品系鉴定需要重点突破的技术问
题。阮小蕾等[22]建立了对转基因番木瓜进行三重
PCR 和四重 PCR 定性检测。本研究表明同一反应体
系中采用双重 PCR 检测即可以区分出 GM YK、华
农一号 2 种品系的转基因番木瓜, 既缩短了检测时
间、降低了成本、提高了检测效率。杨永存等[23]检
测出深圳市主要的转基因番木瓜品系为华农一号和
GM YK。而本研究的其余待测样品也没有检测到
55-1 品系的转基因番木瓜。综上所述, 本研究获得
的最优番木瓜总DNA提取法是预先加入CWBIO试
剂盒中的 Buffer LP1 后再用 FastPrep-24 仪器研磨
果皮样品。本研究所建立的转基因番木瓜的双重
PCR 定性检测体系适用于目前国内市场上的番木
瓜品系鉴定的需要。
致谢：感谢华南农业大学农学院李华平教授提
供阳性参照与阴性参照的样品材料。本研究由大学
生国家级创新训练项目(编号: 201310564050)基金提
供资助, 特此感谢。
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