全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
收稿日期 ：2013-07-17
基金项目 ： 浙江省科技厅重大专项（2011C12023），国家质检总局科技计划项目（2011IK249），浙江省科技厅公益性项目（2011C22065），
浙江出入境检验检疫局科研项目（ZK200958）
作者简介 ：张明哲，男，高级农艺师，研究方向 ：分子生物学和植物检疫 ；E-mail ：mzzhang429@163.com
近年来，世界上转基因生物研发工作进展迅速，
2012 年全球转基因作物种植面积达到 1.703 亿 hm2，
比 2011 年的 1.6 亿 hm2 增长了 6%，较 1996 年增长
了 100 倍［1］。 但自从 1993 年世界上第一种转基因
作物问世以来，各界对转基因食品的安全性问题一
直争论不休［2，3］。人们对于转基因生物和转基因食
品的忧虑主要有两个方面，一是对人体健康是否有
害，二是对生态环境是否构成潜在威胁［4］。为了保
护人类自身的健康和生存的环境，许多国家相继制
定了对转基因生物的管理法规，对进口转基因食品
进行严格管理，要求出具转基因成分的检测报告，
对转基因食品采用标识制度。挪威是第一个要求对
转基因产品进行含量标识的国家，标识低限为 2% ；
醛基片 PCR 芯片技术在转基因玉米品系检测中的
应用研究
 张明哲1  张晓峰1  陈曦1  吴姗1  陈笑梅1  周圆2
（1. 浙江省检验检疫科学技术研究院，杭州 310016 ；2. 舟山出入境检验检疫局，舟山 316000）
摘 要 ： 针对 9 种转基因玉米品系 Bt11、TC1507、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、Mon88017、MIR604 进行醛
基片 PCR 芯片高通量检测和条件优化。特异性和灵敏度试验表明，醛基片 PCR 芯片的特异性较好，能应用于转基因玉米品系鉴定。
而该方法应用于转基因检测的灵敏度为 5%，有待于后续试验进一步优化。
关键词 ： 醛基片 PCR 芯片 转基因检测 品系鉴定
Specific Detection of GM Maize Events Using Aldehyde PCR Chip
Zhang Mingzhe1 Zhang Xiaofeng1 Chen Xi1 Wu Shan1 Chen Xiaomei1 Zhou Yuan2
（1. Zhejiang Academy of Science and Technology for Inspection and Quarantine，Hangzhou 310016 ；2. Zhoushan Entry-exit Inspection and
Quarantine Bureau，Zhoushan 316000）
Abstract:  In this study, 9 kinds of genetically modified maize events Bt11, TC1507, Bt176, MON810, MON863, GA21, NK603,
Mon88017, MIR604 were under high-throughput detection and condition optimization with aldehyde PCR chips. According to the specificity and
sensitivity experiments, it showed that the specificity of the aldehyde PCR chip is good enough to be applied in the identification of genetically
modified maize events. But the sensitivity of this method was 5%, if it is applied to the transgenic detection. It calls for further optimization in the
follow-up experiments.
Key words:  Aldehyde PCR chip Foreign gene detection Identification of genetic modified events
欧盟的限量标识低限为 1%。我国于 2001 年 5 月 23
日颁布了《农业转基因生物安全管理条例》，2001
年 9 月 5 日开始实施《出入境转基因产品检验检疫
管理办法》，2002 年 3 月 20 日开始贯彻实行《农业
转基因生物标识管理办法》。
随着转基因产品数量的不断增加，种类不断的
丰富［5-7］以及品系鉴定的提出［8，9］，无疑对口岸检
测部门的技术手段提出了更高的要求。针对以上的
这种情况，迫切的需要建立一种更有效率的、更快
速的检测方法，而基因芯片技术是解决这一问题的
新亮点。基因芯片［10］（gene chip）技术是 20 世纪
90 年代由美国 Affymetrix 公司首先发展起来的，直
至 1996 年制造出世界上第一块商业化的 DNA 芯
2013年第10期 67张明哲等 ：醛基片 PCR 芯片技术在转基因玉米品系检测中的应用研究
片（DNAchip）。现在，基因芯片技术已经成为生物
芯片技术的一个重要分支，它是在表面积较小的基
片表面有序地固定大量基因探针（probe），而形成
DNA 微阵列芯片上每一特定位置的核苷酸序列都是
已知的，与待测样品杂交后根据各点产生的信号强
弱，利用激光共聚焦扫描和电藕荷器件（CCD）成
像等方法对杂交结果进行检测，具有高度并行性、
高通量、微型化和自动化等优点［11-14］。醛基片 PCR
芯片是一种以醛基片为载体的 PCR 芯片，是把需检
测目的基因的下游引物通过氨基修饰固定在醛基芯
片上，而另一端自由的上游引物用 Cy5 染料标记。
本研究进一步对醛基片 PCR 芯片进行研究，通过芯
片上的 PCR 扩增反应扩增，最后经芯片扫描仪检测
荧光强度来进行判断，旨在为进一步转基因玉米品
系检测提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 转基因玉米品系 Bt11、TC1507、
Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、
Mon88017、MIR604，转基因大豆品系 GTS-40-3-2 ；
转基因油菜籽品系 GT73、T45 均购自欧洲标准局
（IRMM）；转基因大米品系 Bt63 为中国检验检疫科
学研究院馈赠 ；非转基因玉米和小麦购自市场。
1.1.2 仪 器 Sorvall micro21R 台 式 冷 冻 离 心 机
（Thermo）、S-1000PCR 仪（Bio-Rad）、Imager HP 核
酸电泳及凝胶成像系统（Alpha）；数显恒温水浴
锅（国华电器有限公司）；XS104 电子天平（Mettler
Toledo）；Nano Drop 3300 核 酸 测 定 仪（Thermo）；
Pixsys5500 点 样 仪（Cartician Tech）；LS300 Scanner
扫描仪（TECAN Group Ltd，Switzerland）；Milli-Q 超
纯 水 系 统（Millipore）；真 空 泵（Vacuum&Pressure
Pump，Auto Science）；MAXQ6000 摇床（Thermo）。
1.1.3 试 剂 DNA 提 取 试 剂 盒 为 QIAGEN Dneasy
Plant Mini Kit 试剂盒 ；引物和探针均由宝生物工程
（ 大 连 ） 有 限 公 司（TaKaRa） 合 成 ；普 通 PCR 反
应的试剂购于 TaKaRa 公司，其它分析纯试剂购于
Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 材料制备 将大豆、油菜籽、玉米、大米、
小麦等材料研磨（PHILIPS cucina blender HR2860）
至粉末状（0.2 mm 左右），其中玉米按比例混合转
基因和非转基因的材料，分别获得 10%、5%、1%
和 0.1% 含量的转基因样品（表 1）。
表 1 样品制备
样品 样品的制备 转基因成分含量（％）
1 取 100 mg A 100
2
取 1 000 mg A 和 9 000 mg B，充分
混合后随机取 100 mg
10
3
取 500 mg A 和 9 500 mg B，充分混
合后随机取 100 mg
5
4
取 100 mg A 和 9 900 mg B，充分混
合后随机取 100 mg
1
5
取 10 mg A 和 9 990 mg B，充分混
合后随机取 100 mg
0.1
A ：转基因样品粉末 ；B ：非转基因样品粉末
1.2.2 DNA 提取 DNA 提取都使用 QIAGEN Dneasy
Plant Mini Kit 试剂盒进行，DNA 浓度由核酸测定仪
（Nano Drop 3300）检测得到。
1.2.3 引物和探针 试验所用的引物主要来自于欧
盟转基因食品和饲料参考实验室方法（表 2），其中
上游引物 5 端标记 Cy5，下游引物 5 端进行氨基修
饰并固定在芯片上。
表 2 试验所用引物序列
基因名称 上游引物（5-3） 下游引物（5-3）
Adh（玉米内源） cgtcgtttcccatctcttcctcc ccactccgagaccctcagtc
Bt11 gcggaacccctatttgttta tccaagaatccctccatgag
Bt176 gacttcagcctgccggtact gtgcatcaatggaggagagaac
Mon810 gatgccttctccctagtgttga ggatgcactcgttgatgtttg
Mon863 gtaggatcggaaagcttggtac tgttacggcctaaatgctgaact
GA21
cttatcgttatgctatttgcaact-
ttaga
tggctcgcgatcctcct
NK603
atgaatgacctcgagtaagctt-
gttaa
aagagataacaggatccactcaa-
acact
TC1507 tagtcttcggccagaatgg ctttgccaagatcaagcg
Mon88017 gagcaggacctgcagaagct tccggagttgaccatcca
MIR604 gcgcacgcaattcaacag ggtcataacgtgactcccttaattct
以上引物均采用自欧盟转基因食品和饲料参考实验室方法（European Union
Reference Laboratory for GM Food and Feed）
1.2.4 PCR 反应 扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；
94℃变性 40 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，40
个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 反应体系见表 3。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期68
表 3 PCR 反应体系
成分 体积（μL）
上引物（20 μmol/L） 0.4
下引物（20 μmol/L） 0.4
10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus） 2
dNTP Mixture（各 2.5 μmol/L） 1.6
TaKaRa Ex Taq（5 U/μL） 0.25
模板 2
H2O 补至 20
1.2.5 醛基片 PCR 芯片
1.2.5.1 点样固定模板 醛基片的制备 ：将下游引
物的 5 端进行氨基修饰并将其固定在芯片上，点样
量设定为 50 pmol/点。水化 8 h，70℃干燥 2 h，洗
液（2×SSC，0.5% SDS）洗两次，每次 5 min，水洗
两次，每次 5 min，吹干片子 4℃保存，备用。
1.2.5.2 芯片上的 PCR 反应 芯片预处理。将制备
好的芯片浸泡在小牛血清（BSA，10 mg/mL）中，室温，
0.5-1 h ；磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）冲洗数变 ；
灭菌水冲洗数变 ；干燥 ；在芯片引物阵列外围粘上
原位框（25 μL），形成 PCR 加样区，备用。PCR 加
样和 PCR 程序 ：在芯片的 25 μL 体系中，加入 PCR
缓 冲 液，MgCl2，dNTP，Taq 酶， 及 需 要 检 测 基 因
的上游引物（该引物的 5 端用 Cy5 染料标记，引物
的量控制在 50 pmol 左右），需检测样品的高质量的
DNA，加水补足 25 μL。加样完毕后，加盖密封 PCR
反应区。PCR 反应程序为 ：95℃ 1 min ；95℃ 30 s，
60℃ 150 s，72℃ 60 s（分别进行 10、40、60 个循环）；
72℃，10 min。
1.2.5.3 芯片检测 PCR 程序完成后，用含 0.1% 吐
温 20 的 5×SSC 缓冲液清洗芯片数次，在芯片扫描
仪上检测 Cy5 荧光强度，读取和分析数据。
2 结果
2.1 PCR扩增验证
以转基因大豆品系 GTS-40-3-2、转基因油菜籽
品 系 GT73、T45、 转 基 因 大 米 Bt63、 转 基 因 玉 米
Bt11、TC1507、Bt176、MON810、MON863、GA21、
NK603、Mon88017、MIR604、非转基因玉米、非转
基因小麦所提取的 DNA 为模板，对所采用的 9 种引
物进行逐一 PCR 扩增验证。结果表明，Adh1 基因引
物只能对非转基因玉米和转基因玉米进行有效扩增，
而 Bt176 品系基因引物只能检测 Bt176 转基因玉米
（图 1）。同样，其他品系基因的引物只能检测对应
品系的转基因玉米，说明所采用的引物具有专一性。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M
1 ：转 基 因 玉 米 Bt176 ；2 ：转 基 因 玉 米 Bt11 ；3 ：转 基 因 玉 米 TC1507 ；
4 ：转基因玉米 MON810 ；5 ：转基因大豆 GTS-40-3-2，6 ：转基因油菜 GT73 ；
7 ：转基因油菜 T45 ；8 ：转基因大米 Bt63 ；9 ：非转基因小麦 ；10 ：非转基
因玉米 ；M ：DNA Marker
图 1 玉米转基因品系 Bt176 的检测
2.2 醛基片PCR芯片检测及条件优化
以转基因玉米 Bt176 品系所提取的 DNA 为模板，
进行醛基片 PCR 芯片检测并进行条件优化，检测结
果（图 2）表明在 10 个循环扩增的情况下，Bt176
的阳性杂交信号没有出现，而在 40 和 60 个循环扩
增的情况下，Bt176 的阳性杂交信号都有出现，但是
在 60 个循环扩增的情况下，同时也出现了假阳性的
信号，因此采用 40 个循环扩增作为最优扩增条件。
A B C
图中从上到下分别为 Bt176 品系探针和阳性探针。A ：10 个循环扩增 ；
B ：40 个循环扩增 ；C ：60 个循环扩增
图 2 醛基片 PCR 芯片条件优化
2.3 特异性研究
为了验证醛基片 PCR 芯片检测转基因玉米品系
方法的特异性，随机选取了 Bt11、TC1507、Bt176、
MON810、MON863 品系阳性样品进行检测，结果
如图 3 所示。图 3-A 为 5 种阳性样品混合检测，结
果 显 示，5 种 目 标 品 系（Bt11、TC1507、Bt176、
2013年第10期 69张明哲等 ：醛基片 PCR 芯片技术在转基因玉米品系检测中的应用研究
MON810、MON863）对应的位点（2-6）和阳性对
照（12） 均 出 现 阳 性 杂 交 信 号，4 种 非 目 标 品 系
（GA21、NK603、Mon88017、MIR604） 对 应 的 位
点（7-10）和阴性对照（11）均没有信号出现。图
3B-F 分别为单个品系的阳性样品单独检测，可以看
到在不同的位点出现对应的阳性杂交信号，如图 3-C
为 TC1507 品系的阳性样本检测，仅在 3 号位点出现
阳性杂交信号。检测结果表明 PCR 芯片的特异性较
好，同时背景信号值和特异信号值均比较稳定，检
测结果准确可靠。
本试验中醛基片 PCR 芯片检测转基因玉米品系的灵
敏度为 5%。
3 讨论
醛基片作为一种芯片载体，其基片上的活性醛
基会与寡核苷酸或者 PCR 扩增产物 5 端的修饰氨基
发生脱水反应，形成 Shiff 氏碱，从而实现共价键连
接，牢固地固定在基片上。固定后的 DNA 分子可以
进行杂交、洗涤、显色、加热等一系列操作，而不
会脱落，为高通量的基因分析检测提供了方便。与
氨基基片、多聚赖氨酸基片相比，醛基基片具有更
牢固的固定效果。
而从芯片检测角度来说，由于醛基片 PCR 芯片
是一种半固相 PCR 芯片，它的优势在于固相载体表
面的引物阵列适合于多个不同扩增反应的同步进行，
从而实现高通量检测。但另一方面由于醛基片 PCR
芯片的其中一条引物序列固定在载体上，影响了与
DNA 模板的结合，因此在低浓度（如 1% 含量）转
基因检测时，导致扩增效率下降，检测结果重复性
不好和信号较弱。在后续的试验中我们将进一步改
进载体结构（如形成三维凝胶小球），这样有利于扩
增反应的进行，从而提高检测的灵敏度。
4 结论
本研究针对 9 种转基因玉米品系 Bt11、TC1507、
Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、Mon88-
017、MIR604 进行醛基片 PCR 芯片高通量检测和条
件优化。特异性和灵敏度试验表明，醛基片 PCR 芯
片的特异性较好，能应用于转基因玉米品系鉴定。
而该方法应用于转基因检测的灵敏度为 5%，有待于
后续试验进一步优化。
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1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A B C D E F
1 ：Adh1 基因探针 ；2-10 ：Bt11、TC1507、Bt176、MON810、MON863、
GA21、NK603、Mon88017、MIR604 品 系 基 因 探 针 ；11 ：阴 性 探 针 ；
12 ：阳性探针
图 3 醛基片 PCR 芯片特异性检测
2.4 灵敏度分析
本试验进行了醛基片 PCR 芯片检测转基因玉米
品系的灵敏度分析。结果显示玉米内源基因 Adh1 信
号值基本稳定，能有效满足品系基因检测的需要。
Bt176 品系基因检测发现，10%、5%、1% 浓度的转
基因玉米都有阳性信号出现，其中 1% 浓度的信号
较弱（图 4），而 0.1% 浓度的转基因玉米则无阳性
信号。3 次重复检测显示，5% 和 10% 的检测结果
基本稳定，而 1% 浓度的检测结果重复性不好。对
其他品系芯片检测也发现同样情况，因此我们认为
A B C
A ：10% 含量 ；B ：5% 含量 ；C ：1% 含量
图 4 醛基片 PCR 芯片灵敏度分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期70
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（责任编辑 马鑫）