全 文 ：第 35卷 第 1期 生 态 科 学 35(1): 124129
2016 年 1 月 Ecological Science Jan. 2016

收稿日期: 2015-01-23; 修订日期: 2015-11-03
基金项目: 十一五国家科技重大专项“海上油田化学驱油技术”(2011ZX05024-004)
作者简介: 王大威(1978—), 男, 2009 年毕业于东北石油大学油气田开发专业, 现任中海油研究总院采油工程师, 研究方向: 微生物采油等三次采油技
术研究, E-mail: wangdw3@cnooc.com.cn
*通信作者: 王大威, E-mail: wangdw3@cnooc.com.cn

王大威, 张健, 马挺, 等. 用 PCR-DGGE 方法分析渤海原油降解过程微生物群落结构变化[J]. 生态科学, 2016, 35(1): 124129.
WANG Dawei, ZHANG Jian, MA Ting, et al. Analysis of bacterial communities in Bohai heavy oil degradation by 16S
rDNA-PCR-DGGE[J]. Ecological Science, 2016, 35(1): 124129.

用 PCR-DGGE 方法分析渤海原油降解过程微生物群
落结构变化
王大威 1,2*, 张健 1,2, 马挺 3, 吕鑫 1,2, 何春百 1,2
1. 海洋石油高效开发国家重点实验室, 北京 100028
2. 中海油研究总院, 北京 100028
3. 南开大学生命科学学院分子微生物学与技术教育部重点实验室, 天津 300071

【摘要】 针对渤海油田原油粘度大、含水上升快、常规措施作用不明显的特点, 采用微生物采油技术开展提高稠油
采收率研究。通过室内物理模拟实验, 结合变性梯度凝胶电泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 技术及原
油粘度测定分析研究均质、非均质岩心驱替前后稠油采收率变化、微生物群落丰度结构变化、原油理化性质变化, 尝
试分析微生物提高稠油采收率机理。物模结果表明: 微生物采油体系能够有效提高稠油采收率, 在均质岩心和非均质
岩心驱替中, 微生物体系可分别提高采收率 14.4%、29.4%; DGGE 结果显示: 微生物体系出口端丰度明显高于注入端;
原油粘度测定显示: 出口端原油粘度明显下降。三者结合说明微生物体系能够利用稠油作为碳源, 在地层环境中生长,
菌种在地层中有较强的适应性, 同时能够降低稠油粘度, 提高其采收率。

关键词：稠油; 微生物采油; DGGE; 降粘; 机理
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2016.01.019 中图分类号：TE122.14 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2016)01-124-06
Analysis of bacterial communities in Bohai heavy oil degradation by 16S
rDNA-PCR-DGGE
WANG Dawei1,2*, ZHANG Jian1,2, MA Ting3, LV Xin1,2, HE Chunbai1,2
1. State Key Laboratory of Offshore Oil Exploitation, Beijing 100028, China
2. China National Offshore Oil Corporation (CNOOC) Research Institute, Beijing 100028, China
3. Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology, Ministry of Education, College of Life Science, Nankai
University, Tianjin 300071, China
Abstract: Due to the reasons such as high viscosity of crude oil, quick increase of water, decrease of oil production, microbial
enhanced oil recovery (MEOR) technology was used for improving heavy oil recovery in Bohai oil field. In this study, the recovery,
moisture, pressure changes of homogeneous, non-homogeneous core flooding were studied by physical simulation experiments;
structural and abundance changes of microbial communities were studied by denaturing gradient gel electrophoresis (Denature
Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) technology; physical and chemical properties changes of crude oil were studied by oil viscosity
measurement, and the mechanism of microbial enhanced heavy oil recovery was analyzed. Flooding simulation results showed that
MEOR system could effectively enhance oil recovery, which could enhance oil recovery by 14.4% and 29.4%, respectively in
homogeneous and non-homogeneous core flooding experiments; DGGE results showed that microbial system abundance of the outlet
1 期 王大威, 等. 用 PCR-DGGE 方法分析渤海原油降解过程微生物群落结构变化 125
end was significantly higher than that of injection end; crude oil viscosity measurement results showed that oil viscosity of the outlet
end decreased. The results suggested that microorganisms could use heavy oil as carbon source, grow in the formation environment,
reduce the viscosity of heavy oil and improve recovery, so that this technology has broad application prospects in Bohai heavy oil
development .
Key words: heavy oil; microbial enhanced oil recovery; denature gradient gel electrophoresis; viscosity reduction; mechanism
1 前言
微生物采油技术(Microbial Enhanced Oil Recovery,
MEOR)发展至今已有90多年的历史, 目前MEOR技
术已经成功地应用于单井吞吐、调剖、降粘等方面,
该技术能够经济有效地延长油田开采周期, 提高近
枯竭油藏的采收率[1]。但目前该技术的应用受到一
定的限制, 主要原因在于微生物采油技术机理较为
复杂, 同时油藏作为“黑箱”体系, 科研人员用传统
培养方法所获得的微生物生态信息远不能反映油藏
环境中的实际情况, 无法有效获知微生物在地层中
运移、群落丰度变化、菌种种群变化等参数, 不能
合理对现场试验结果进行解释分析, 无法确定提高
采收率的主要机理, 因此影响微生物采油技术深入
发展的主要难点是缺乏有效的采油微生物群落结构
变化与采收率关系分析及动态变化的监测方法[2–5]。
近年来基因组学和现代分子技术的成熟, 逐渐
渗透到有关生命科学的整个领域, 也为微生物生态
学提供了新的研究方法和机遇。自1985年Pace等以
核酸测序技术研究微生物的生态和进化问题以来,
对微生物的多样性研究进入了一个新的阶段, 并逐
步发展形成了成型的微生物分子生态学(Molecular
Ecological Technology of Microorganisms)方法和
技术。变性梯度凝胶电泳(Denature Gradient Gel
Electrophoresis, DGGE)是由Fischer和Lerman于1979
年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术,
是一种通过分离微生物基因组DNA 来研究环境样
品中微生物群落的多样性及物种丰度的一种分子指
纹技术[6-8], 1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用
于分子微生物学研究领域, 并证实了这种技术在揭
示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面
具有独特的优越性。近年来运用分子指纹技术对油
藏微生物群落的研究已有不少[9–15], 但少有文献报
道在微生物物理模拟驱油实验过程中研究采油微生
物群落结构变化与采收率动态关系[16–18]。
本文尝试通过室内物理模拟实验, 结合变性梯
度凝胶电泳(Denature Gradient Gel Electrophoresis,
DGGE) 技术及原油粘度测定研究均质、非均质岩心
驱替前后稠油采收率、含水、压力变化、微生物群
落丰度结构变化、原油理化性质变化, 以分析微生
物提高稠油采收率机理, 为今后微生物采油现场应
用效果解释提供依据。
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 地层水、原油样品: NB35-2 A18井原油, 粘度
523.3 mPa·s, 沥青7.79%, 胶质20.25%; NB35-2 A18
井地层水。
2.1.2 发酵培养基 (gL–1): Na2HPO4 0.6, KH2PO4
0.2, NaNO3 2, FeSO4 0.02, MgSO4 0.3, 酵母粉 0.5,
蔗糖 1, pH 7.2。
2.1.3 菌种 : 产表面活性剂菌 T-1(Pseudomonas
aeruginosa, 铜绿假单胞菌属)、X-3(Bacillus Subtilis,
枯草芽孢杆菌), 由实验室分离保存; 稠油降解菌:
QB26(Bacillus licheniformis, 地衣芽孢杆菌)、QB36
(Geobacillus pallidus, 白色地芽孢杆菌), 由实验室
从 NB35-2 油田地层油水样分离保存。
2.1.4 微生物调剖剂: 黄原胶 0.2%、氯化铬 0.1 ML–1、
醋酸 1ml/L, 搅拌混合。
2.1.5 岩心
(1) 均质岩心参数
(2) 非均质岩心参数
2.2 方法
2.2.1 菌种对原油的降粘作用
利用 BROOK FIELD VISCOMETER LVDV-II+
表 1 均质岩心参数
Tab. 1 Homogeneous core parameters
孔隙度/% 长宽高/cm3 渗透率/(10–3μm2)
23.7 30.04.54.5 2300
126 生 态 科 学 35 卷
表 2 非均质岩心参数
Tab. 2 Heterogeneous core parameters
渗透层 厚度/cm 孔隙度/% 长宽高/cm3 渗透率/(10–3μm2) 平均渗透率/(10–3μm2)
高渗透层 1.5 3500
中渗透层 2.0 2200
低渗透层 1.0
25.4 30.0×4.5×4.5
800
2300

Pro 提桶式粘度计测定原油和菌种对原油作用后的
粘度变化。
2.2.2 菌种的富集培养
将T-1、X-3、QB26、QB36 4菌种在发酵培养基
中富集培养后, 按一定比例复配成微生物稠油降粘
体系, 体系粘度22.3mPa·s, 备用。
2.2.3 基因组DNA的提取与纯化
原始水样中菌体用孔径为0.22 μm的混合纤维
素酯滤膜抽滤1L水样来收集, 经培养后的菌体直接
取10mL培养液高速离心机上6000 rmin–1速度离心
10—15 min获得。具体操作步骤与文献[14]相同。基
因组DNA提取与纯化使用北京天为时代生物技术公
司的DNA 纯化试剂盒, 按照操作说明进行。
2.2.4 16S rDNA 的PCR扩增
采用可得到更多微生物多样性信息的 V9 区引
物进行细菌 16S rDNA PCR 扩增, 因要进行 DGGE
分析, 故此处的引物带 GC 夹子, 细菌 V9 区: 1406r-
GC: 5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC
CCG CCG CCC CCG CCCC ACG GGC GGT GTG
TAC-3’; 1055f: 5′-ATG GCT GTC GTC AGC T-3′。
PCR 体系
Premix Taq 酶 12.5 μL
引物 1406rGC 0.3 μL
引物 1055f 0.3 μL
模板 1 μL
ddH2O 加至总体系 25 μL
PCR 程序: 94 5min℃ ;
94 45℃ s ; 60 45℃ s ; 72 90℃ s; (×3 cycle)
94 45℃ s; 58 45℃ s ; 72 90℃ s ; (×3 cycle)
94 45℃ s; 56 45℃ s ; 72 90℃ s ; (×3 cycle)
94 45℃ s; 54 45℃ s; 72 90℃ s ; (×3 cycle)
94 45℃ s; 52 45℃ s ; 72 90℃ s ; (×3 cycle)
94 45℃ s; 55 45℃ s ; 72 90℃ s ; (×15 cycle)
72 10℃ min; 4 48℃ h.
琼脂糖凝胶电泳检测: 条带在 400~500bp 左右。
2.2.5 16S rDNA 序列DGGE分析
将纯化好的PCR 样品加入制备好的变性胶中,
进行电泳分离，并用YLN22000凝胶影像分析系统分
析, 观察每个样品的电泳图谱并拍照。
2.2.6 微生物驱油体系在岩心研究的增油效果
均质岩心实验: 研究不同油藏空隙体积下(PV
数)微生物段塞在均质岩心的提高采收率效果。水驱
含水 70%后, 倒换阀门, 分别注入微生物段塞(菌液
+营养液)0.3、0.6 PV。注入完成关闭岩心夹持器两
端阀门, 闷井 5 d, 同时做空白对照, 直接水驱至含
水 95%。
非均质岩心实验: 研究在非均质岩心实验中加
入调剖段塞对微生物采油体系的影响。当水驱油出
液量达到 0.1 PV 时, 水驱含水 70%后, 立即倒换阀
门转注 0.2 PV 调剖段塞(黄胞胶+镉离子交联)。当出
液量达到 0.2 PV 时, 立即倒换阀门转注 0.1 PV 微生
物段塞(营养液+菌液)防止成胶过后岩心注入端堵
塞, 出液量达到 0.1 PV 时, 立即关闭岩心夹持器两
端阀门约 3 h 等待成胶。成胶后继续注入 0.5 PV 混
合溶液(营养液+菌液)。注入完成关闭岩心夹持器两
端阀门, 焖井 5 d, 水驱至含水 95%。同时做空白对
照, 只加入微生物段塞 0.6 PV, 注入完成关闭岩心
夹持器两端阀门, 焖井 5 d, 水驱至含水 95%。
3 结果与讨论
3.1 微生物驱油体系在均质岩心中的增油效果
微生物驱油体系在均质岩心中的增油效果见图
1, 同时研究了不同大小的微生物段塞对采收率的
影响。
从图 1 可以看出, 微生物段塞大小对最终采收
率影响较大。0.3 PV 的微生物段塞最终采收率为
40.6%, 比水驱提高 3.8%; 将微生物段塞倍增后, 0.6
PV 的微生物段塞的最终采收率为 51.2%, 比水驱提
高 14.4%, 说明当微生物段塞的大小超过一定水平,
微生物在岩心中分布的范围更大, 可处理更多稠油,
1 期 王大威, 等. 用 PCR-DGGE 方法分析渤海原油降解过程微生物群落结构变化 127

均质体系 1: 0.3PV 微生物段塞; 均质体系 2: 0.6PV 微生物段塞
图 1 均质岩心模型驱替实验数据
Fig. 1 Result of homogeneous cores physical model simulations

A、空白; B、均质体系 1; C、均质体系 2
图 2 均质岩心驱替后截面图
Fig. 2 Sectional view of homogeneous core flooding
降低稠油粘度, 降低油水流度比, 后续水驱能更大
程度的启动剩余油, 对采收率具有较大的影响。
对比驱替后的岩心截面可看到, 空白实验的岩
心内部尚残留大量原油未被驱出, 而注入 0.3 PV 和
0.6 PV 微生物段塞的岩心被驱替的比较充分, 说明
微生物注入到均质岩心中, 通过降解稠油和产生乳
化剂, 降低了油水流度比, 提高了稠油采收率。
3.2 微生物驱油体系在非均质岩心的增油效果研究
微生物驱油体系在非均质岩心中的驱油效果见
图 3, 研究在非均质岩心中加入生物聚合物前置段
塞对采收率的影响。
从图 3 可以看出, 生物聚合物段塞的加入对采
收率作用明显, 不加聚合物段塞的最终采收率为
40.8%, 比水驱提高 22.4%, 加入段塞的最终采收率
为 47.9%, 比水驱提高 29.4%, 聚合物段塞的加入有
效调节吸水剖面, 封堵高渗条带, 一方面能够使注
入体系进入中低渗层位, 提高波及效率, 另一方面

非均质岩心体系 1: 0.6 PV 微生物段塞; 非均质岩心体系 2:0.2 PV 生
物聚合物调剖段塞+0.6 PV 微生物段塞
图 3 非均质岩心模型驱替实验数据
Fig. 3 Result of heterogonous cores physical model
simulations
采油微生物进入中低渗透层后利用其中存在的剩余
油, 降低稠油粘度, 提高了驱油效率, 这两方面均
是提高采收率的基本机理, 因而聚合物段塞的加入
能明显提高稠油采收率。
由图 4 所示, 非均质岩心在驱替完成后出现大
片淡黄色斑纹, 说明微生物在油藏环境下能够很好
的降解原油, 产生表面活性剂, 同时启动了中低渗
层的稠油, 为后续水驱提供了良好的条件, 进一步
提高采收率。
3.3 驱替实验前后样品的 DGGE 条带分析
将 T-1、X-3、QB26、QB36 四株菌种培养物、
注入体系(空白 1)、产出液、地层水(空白 2)分别提
取DNA, 通过DGGE对不同体系中菌种浓度进行分
析, 结果见图 5。从图中可以看到, QB26 作为对稠油
降粘起作用的优势菌种, 产出液中的含量高于注入
体系, 同时也高于其他采油菌种, 说明QB26在岩心
中可利用稠油作为碳源进行生长, 因其利用稠油和
营养的能力更强 , 在菌群分布中处于统治地位 ;
QB36 同样作为稠油降解菌, 产出端菌浓也高于注
入端, 但明显低于QB26产出端菌浓, 可能是由于其
在地层中利用稠油和注入营养液的能力与 QB26 相
比低下, 因此造成其生长速度低于 QB26, 说明
QB26 在稠油降粘中起主导作用; T-1、X-3 菌种产


图 4 非均质岩心驱替后截面图(非均质岩心体系 2)
Fig. 4 Sectional view of heterogeneous core flooding (heterogeneous core system 2)
128 生 态 科 学 35 卷

1、QB26; 2、T-1; 3、X-3; 4、QB36; 5、注入体系; 6-7、非均质岩心体
系 1(0.6 PV); 8、均质岩心体系 2(0.6PV); 9、均质岩心体系 1(0.3 PV);
10-11、非均质岩心体系 2(0.6 PV+0.2 PV 聚合物); 12-13、A18 井水样
图 5 16S rDNA 扩增产物的 DGGE 电泳图
Fig. 5 DGGE profile of 16S rDNA amplified products
出端条带亮度低于注入端, 说明产出端菌浓比注入
端低, 原因在于 T-1、X-3 菌种为产表面活性剂菌种,
主要为专性好氧菌, 由于地层深部氧气含量低, 专
性好氧菌在与 QB26、QB36 等兼性好氧稠油降解菌
的竞争中处于下风, 其菌种浓度呈下降趋势, 主要
作用物-表面活性剂(乳化剂)的产生是在发酵罐中进
行的, 地层中相应也会产生表面活性剂(乳化剂), 但
含量较低。
从不同岩心实验结果看, 均质岩心实验中, 均
质岩心体系 2(0.6 PV)对比均质岩心体系 1(0.3 PV),
优势菌 QB26 菌浓前者明显高于后者, 且菌种种类
也有所增加, 这说明增大注入体积可提高菌液在岩
心中的分布, 促进菌种利用更多剩余油, 结果是一
方面增加了菌液浓度, 一方面提高了稠油采收率。
非均质岩心实验中, 非均质岩心产出端优势菌
QB26 菌浓均高于均质岩心, 同时非均质岩心产出
端菌种种类多于均质岩心, 分析原因在于: 均质岩
心水驱程度较高, 岩心内剩余油含量低, 微生物驱
油体系可利用的稠油较少, 而非均质岩心由于存在
渗透率级差, 水驱主要动用高渗层位稠油, 而中低
渗层位稠油大部分未被启动, 可作为稠油降解菌的
碳源, 故非均质岩心中 QB26 菌浓高于均质岩心。从
非均质岩心实验中不同段塞结果来看, 加入聚合物
段塞的岩心实验产出端 QB26 菌浓高于未加入聚合
物段塞的岩心。分析原因在于: 尽管注入体系本身
具有一定粘度, 但未加入聚合物段塞无法有效调整
岩心吸水剖面, 造成注入体系只进入高渗层位, 但
高渗层位中的稠油水驱后剩余油含量较低, 同时采
油菌因进入中低渗层位较少, 因此无法有效启动剩
余油; 加入聚合物段塞后, 有效控制了吸水剖面,
注入体系能够进入中低渗层位, 并启动这些部位的
剩余油, 微生物可以稠油为碳源生长, 因此其菌浓
高于未加入聚合物段塞的岩心实验结果。
3.4 驱替实验前后稠油界面张力、粘度测定
3.4.1 驱替实验前后界面张力变化
驱替实验结束后, 将微生物驱油体系作用后的
原油乳状液破乳, 得到脱油水, 其界面张力见表 3。
从表可以看到, 与地层水样和注入体系相比, 产出
端样品的界面张力分别下降 71.7%和 31.4%, 同时
pH 值也有所降低, 分别由地层水样的 7.2 和注入体
系的 7.0 降低到 6.2, 这说明菌株在岩心内能够繁殖,
同时代谢过程中产生了表面活性物质和有机酸等物
质, 结合 DGGE 结果, 进一步说明稠油降解菌在表
面活性剂的协助下, 利用加入的营养剂作用于稠油,
产生表面活性物质和有机酸等降粘物质。
3.4.2 驱替实验前后稠油粘度变化
驱替实验结束后, 测定产出油水乳状液粘度,
然后对乳状液进行破乳, 得到脱水油, 测定其粘度
见表 4。由表 4 可知, 模拟油在 55 ℃下的粘度为
210.6 mPa·s, 产出乳状液粘度为 47.5 mPa·s, 经过微
生物体系作用后的脱水油粘度为 155.1 mPa·s。说明
微生物作用稠油主要机理有二: 一为产生表面活性
物质, 乳化稠油; 二为降解稠油中的胶质、沥青质等
烃重质组分, 改变原油品质, 降低原油粘度, 使其
表 3 微生物作用前后界面张力及 pH 值变化
Tab. 3 Interfacial tension and pH changes after micro-
organisms degradation
样品号 界面张力/
(mNm–1)
界面张力降
低率/% pH 值
地层水样(空白) 29.3 - 7.2
微生物注入体系 12.1 58.7 7.0
非均质岩心 2 产出
端脱油水 8.3 71.7 6.2
表 4 微生物作用前后粘度变化
Tab. 4 Viscosity changes after microorganisms degradation
样品号 粘度/(mPas) 降粘率/%
模拟油(空白) 210.6 -
非均质岩心 2 产出端乳状液 47.5 77.4
非均质岩心 2 产出端脱水油 155.1 26.4
1 期 王大威, 等. 用 PCR-DGGE 方法分析渤海原油降解过程微生物群落结构变化 129
在后续水驱过程中更易流动, 这其中稠油乳化是主
要机理, 同时稠油中重组分降解因其不可逆性也十
分重要。
实验最初拟将驱替实验产出端原油进行四组分
分析, 以进一步研究稠油降解菌对稠油的降解作用,
但由于饱和用油为模拟油(柴油和稠油的混合体系),
无法反应油藏的实际情况。
4 结论
本实验结合 DGGE、原油粘度测定, 针对均质
岩心、非均质岩心物理模拟驱油实验中, 采油微生
物对原油粘度和采收率的影响及其作用机理进行了
研究, 结果显示: 一方面, 微生物注入岩心后, 稠油
粘度降低, 采收率明显提高, 同时菌株浓度也相应
升高, 说明采油微生物能够利用岩心内稠油作为碳
源生长, 其降解稠油和产生生物乳化剂作用对改善
原油粘度和提高采收率具有显著效果, 该驱油体系
在稠油开发中具有一定的应用前景; 另一方面说明
DGGE 技术作为一种微生物生态结构、丰度的检测
手段, 具有快速、灵敏的特点, 结合现场实际条件,
其应用对今后微生物采油中培养基优化、菌种筛选、
配伍性研究、现场跟踪监测具有重要指导意义。
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