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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):131-139
嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferroox-
idans）是微生物浸矿过程中最有应用价值的一个种，
属革兰氏阴性菌，是专性化能自养菌，好氧嗜酸，
主要以 CO2 为碳源，同时吸收磷、氮等无机营养元
素来合成自身细胞所需物质［1］。它具有将亚铁氧化
成三价铁，将低价硫化物氧化成硫酸的能力，因而
能使金属从硫化矿中溶解，因此常用于浸矿菌种研
究。而且微生物浸矿具有生产成本低、能耗低、投
资少、设备简单、环境友好，特别是具有处理低品
位的或复杂的多金属矿物等优点。目前微生物浸矿
的应用正在引起传统矿物加工产业的重大变革，具
有广阔的应用前景［2-4］。而 A. ferrooxidans 因其自身
收稿日期 ：2015-07-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（51264029，41561094），内蒙古自治区青年科技英才计划项目（NJYT-14-B12），内蒙古自治区应用技术
研究与开发资金项目，内蒙古科技大学创新基金项目（2014QNGG05）
作者简介 ：郑春丽，女，博士，副教授，研究方向 ：资源与环境生物学 ；E-mail ：zhengchunli1979@163.com
嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫酸盐同化相关基因的鉴定与分析
郑春丽1，2  王丹1  张礼1  陈敏洁1  马宏伟1  姜志艳1，2
（1. 内蒙古科技大学数理与生物工程学院，包头 014010 ；2. 白云鄂博多金属资源综合利用省部共建国家重点实验室，包头 014010）
摘 要 ： 旨在鉴定和分析嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）ATCC 23270 硫酸盐同化相关的基因。首先利
用生物信息学的方法分析 A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组中可能参与硫酸盐同化的基因，通过反转录、凝胶电泳等技术手段对可
能参与编码半胱氨酸（Cys）操纵子的几个候选基因 cys JI、cys H、cys D-2、cys N、cys D-1 和 cys NC 进行共转录鉴定，并对其关键
的基因进行体外克隆、表达、纯化重组，同时进行功能验证和酶活测定。结果分析表明，半胱氨酸（Cys）操纵子的候选基因 cys D-1
和 cys NC 共转录，Cys JI、cys H、cys D-2、cys N 共转录。初步确定了 A. ferrooxidans ATCC 23270 硫酸盐同化可能的基本代谢路径，
探索了半胱氨酸（Cys）操纵子的调控机制。
关键词 ： 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ；硫酸盐同化 ；共转录
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.017
The Identification and Analysis of Sulfate-assimilation Related Genes in
Acidithiobacillus ferrooxidans
ZHENG Chun-li1，2 WANG Dan1 ZHANG Li1 CHEN Min-jie1 MA Hong-wei1 JIANG Zhi-yan1，2
（1. School of Mathematics，Physics and Biotechnology，Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010 ；2. The Jointed
State Key Laboratory for Baiyun Obo Polymetallic Resources Comprehensive Utilization by Province and Ministry，Baotou 014010）
Abstract: This work aims to identify and analyze the related genes of sulfate-assimilation in Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270.
Firstly, the genes involved in sulfate-assimilation in the genome of A. ferrooxidans ATCC 23270 were analyzed using bioinformatics. Then we
co-transcripted and identified the candidate genes cys JI, cys H, cys D-2, cys N, cys D-1, and cys NC probably involving in encoding cysteine
（Cys）operon by reverse transcription and gel electrophoresis. Further we cloned in vitro, expressed, purified and recombined the key genes, and
confirmed their functions and measured their enzyme activities. Results showed that among these candidate genes of Cys operon, cys D-1 and cys
NC were co-transcripted, and Cys JI, cys H, cys D-2 and cys N were co-transcripted. The possible basic metabolic pathway of sulfate-assimilation
in A. ferrooxidans ATCC 23270 was determined preliminarily, and the regulatory mechanism of Cys operon was explored.
Key words: Acidithiobacillus ferrooxidans ；sulfate-assimilation ；co-transcription
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2132
的特殊性在生物冶金中具有重要作用，其中的硫酸
盐同化途径是由无机硫到有机硫代谢转化的关键过
程。硫酸盐经过一系列同化反应，以还原型硫的形
式被整合进入有机骨架，生成半胱氨酸（Cysteine，
Cys）。Cys 是众多具有重要生物学功能的代谢产物的
前体，也就是产生的半胱氨酸可进一步参与其他体
内代谢物质的合成。但是，目前我们对于 Cys 的具
体作用机制及其操纵子调控机制不是很清楚。因此
本研究以嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans）为
标准菌株 ATCC 23270 作为研究对象，采用基因组、
总 RNA 的提取与纯化，反转录，琼脂糖凝胶电泳技
术，SDS-PAGE，RT-qPCR 技术以及生物信息学分析
等实验方法或手段，对其硫酸盐同化相关基因的鉴
定与分析，旨在达到初步确定 A. ferrooxidans ATCC
23270 的硫酸盐同化可能的基本代谢路径和探索 Cys
操纵子调控机制的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
菌 株 嗜 酸 氧 化 亚 铁 硫 杆 菌（Acidithiobacillus
ferrooxidans，A. ferrooxidans） 为 标 准 菌 株 ATCC
23270（中南大学友情提供，购自美国菌种保藏中
心）。能源培养基则采用改进的 9K 培养基，在改进
的 9K 培养基的基础上，添加 S 5.0 g/L 或硫酸亚铁
44.2 g/L。改进的 9K 培养基、K2Cr2O7 标准液、硫磷
酸混合液、75% 乙醇（用 DEPC 处理过的水配制）、
QIAGEN RNase-free 水、RNase-free DNase I（QIAGEN，
Valencia，CA）、引物由上海生工生物工程有限公司
合成。北京艾德莱生物科技细菌基因组 DNA 快速提
取试剂盒、BioFlux 公司的 Simply P 总 RNA 提取试
剂盒、RNA 纯化试剂盒为 QIGEN，RNeasy Mini Kit。
HiTrap 从通用电气医疗集团有限公司购买，E. coli
菌株 BL21（DE3）感受态细胞来自英杰生命技术有
限公司，Taq DNA 聚合酶，T4 DNA 连接酶和限制性
内切酶来自 MBI Fermentas。
1.2 方法
1.2.1 生物信息学分析 A. ferrooxidans ATCC 23270
的全基因组的序列和注释从 NCBI（http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/genome/1014）获得。使用源自 UniProt 数
据库的 BLAST 对核苷酸和蛋白质序列进行序列相似
性搜索，得到可能参与硫酸盐同化的基因。
1.2.2 A. ferrooxidans 菌体培养与收集 菌株在含有
硫酸亚铁的能源培养基中传代培养（约 60-90 h），
以 Fe2+ 的氧化率来反应其菌体的生长状况，即重铬
酸钾滴定法测定细菌是否达到对数生长期，达到对
数期的菌液 4 000 r/min、4℃离心 20 min 收集菌体。
得到的菌体用 pH2.0 的硫酸溶液吹打混匀，重复洗
涤 3 次，去掉细胞表面的铁矾沉积物。
1.2.3 A. ferrooxidans 菌体的基因组、总 RNA 的提取
与纯化 A. ferrooxidans 菌基因的提取按照北京艾德
莱生物科技细菌基因组 DNA 快速提取试剂盒说明书
进行。总 RNA 提取步骤按 BioFlux 公司的 Simply P
总 RNA 提取试剂盒说明书进行。总 RNA 的纯化参
照 QIAGEN RNeasy Mini Kit 进行。Invitrogen 第一链
合成试剂盒反转录合成 cDNA。
1.2.4 RT-PCR 反应 使用 10% 的 cDNA（取上一步
骤 2 mL 反应产物）用于 PCR 反应。PCR 模板分别
为 ：空白、RNA、DNA 和 cDNA。
（1）RT-PCR 扩增引物 ：引物根据 GenBank 中
公布的 A. ferrooxidans ATCC 23270 标准菌株的全基
因组序列、通过 Primer 5.0 软件分析设计、由上海生
工生物工程公司合成。引物序列见表 1。
（2）RT- PCR 反应体系为 ：10×PCR 缓冲液 2.5
mL，50 mmol/L MgCl2 1.5 mL，10 mmol/L dNTP 混合
物 0.5 mL，上游扩增引物（终浓度 10 μmol/L）0.5
mL， 下 游 扩 增 引 物（ 终 浓 度 10 μmol/L）0.5 mL，
Taq DNA 聚合酶（5 U/mL）0.25 mL，模板 1 mL，灭
菌蒸馏水 16 mL。
（3）RT-PCR 反应程序设置为 ：94℃下预变性 3
min ；94℃变性 45 s，58℃退火 45 s，72℃延伸 90 s，
循环 35 次 ；72℃下延伸 10 min ；4℃下保存。
1.2.5 硫酸盐同化相关基因的表达和纯化 硫酸盐
同化途径相关基因包括来自 A. ferrooxidans 的腺苷酰
转移酶，ATP 硫酸化酶（CysD），腺苷酰硫酸还原酶
（CysH），亚硫酸还原酶（CysJI），丝氨酸乙酰转移
酶（CysE）和 O-乙酰丝氨酸巯解酶（CysM）。按照
文献［5-8］，表达和纯化重组基因 cys J、cys M、cys
H。重组蛋白的储备液用 20 mmol/L 的磷酸钾缓冲
液保存，pH 为 7.4，含有 5% 的甘油和 5 mmol/L 的
β-硫基乙醇，然后保存在 -80℃冰箱中。洗脱液用
2016,32(2) 133郑春丽等：嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫酸盐同化相关基因的鉴定与分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，使用
Laemmli 不连续缓冲体系。凝胶用考马斯亮蓝 R-250
染色。
1.2.6 酶活力的测定 将 ATPS 与荧光素酶耦合测
定酶的活力［9］，根据 Trüper 等［10］的方法测定 APS
还原酶的活力。根据 Warrilow 等［11］的方法测定半
胱氨酸合成酶的活力。根据改进的 Ostrowski 等［12］
的方法测定 R-FP 的活力。根据 Kredich 等［13］的方
法分析 R-FP 的活力。
2 结果
2.1 预测的A.ferrooxidans ATCC23270基因组中硫
酸盐同化相关的基因
在 A. ferrooxidans ATCC 23270 基 因 组 注 释 里，
有一些 ORF 被认为编码与硫酸盐同化相关的蛋白。
图 1 展示了所有这些假定的 A. ferrooxidans 基因，表
2 说明其中一些基因可能的作用及功能。根据他们
与已知基因的相似性，可以认为 3 个 ORF（cys D-1、
cys D-2、cys N）编码 ATP 硫酸化酶，两个 ORF（cys
NC-2 和 cys NC）编码潜在的腺苷酰硫酸激酶［14］。
在硫酸盐同化途径中，ATP 硫酸化酶催化无机硫酸
盐同化途径中的第一步，由 ATP 提供能量，通过酶
促反应活化硫酸盐，生成腺苷 5- 磷酰硫酸（APS）
和焦磷酸盐［15，16］，然后被腺苷 5- 磷酰硫酸（APR）
还原酶催化成亚硫酸盐，产物随即又被亚硫酸盐还
原酶催化，生成的硫代谢产物很快被整合入 O-乙酰
丝氨酸（O-acetylserine）的氨基酸骨架中，最后在
半胱氨酸合成酶催化下生成 Cys［16］。在 E. coli 和其
他细菌中这种活性需要两个蛋白，由 cys D 基因编码
的催化亚基和由 cys N 基因编码的调节亚基［17］。相
反，在真核细胞，古细菌和一些细菌（如 B. subtilis）
中这两个亚基是融合的。由 APS 激酶（cys C 基因编
码）催化的 ATP 依赖的 APS 磷酸化反应，进一步生
成 3- 磷酸腺苷 -5- 磷酰硫酸（PAPS）［18］。在包括
Mycobacterium 和 Pseudomonas 的一些有机体中，cys
C 和 cys N 的产物是融合的［19］。
其中一个 ORF 可能编码 APS 还原酶或者 PAPS
还原酶（CysH），然而在这条代谢途径中有很多变
体，并非所有的有机体都还原 APS。植物，藻类和
表 1 共转录引物
编号 引物序列（5-3） 片段长度 /bp
1. AFE_2970（cys D-1）-AFE_2971（cys NC）
F1 ：CATGACAGCTCCGGCTCCATG
R1 ：TAATGCCCTGCTCACGCTCCG
261
2. AFE_3121（cys J）-AFE_3122（cys I）
F2 ：GGGCGGTACATCAATCCCTG
R2 ：TGCCGTGGAACTTGATGACC
256
3. AFE_3122（cys I）-AFE_3123（cys H）
F3 ：TGTGCGGCGACAGGATTTAT
R3 ：TGTTTCGCAATCAGGTCCGT
202
4. AFE_3123（cys H）- AFE_3124
F4 ：CGCCAAGCCAGTAACACCAC
R4 ：GCAGCACCAGCGAATCCTTG
199
5. AFE_3123（cys D-2）-AFE_3125（cys N）
F5 ：CGCCATGACCAAAATCACCG
R5 ：CGTCCAACTGGTCGGCAAAAAT
253
6. AFE_3121（cys J）-AFE_3123（cys H）
F6 ：GGGCGGTACATCAATCCCTG
R6 ：TGTTTCGCAATCAGGTCCGT
1941
7. AFE_3121（cys I）-AFE_3123（cys D-2）
F7 ：TGTGCGGCGACAGGATTTAT
R7 ：GCAGCACCAGCGAATCCTTG
962
8. AFE_3123（cys H）-AFE_3125（cys N）
F8 ：CGCCAAGCCAGTAACACCAC
R8 ：CGTCCAACTGGTCGGCAAAAAT
1134
9. AFE_3121（cys J）-AFE_3123（cys D-2）
F9 ：GGGCGGTACATCAATCCCTG
R9 ：GCAGCACCAGCGAATCCTTG
2701
10. AFE_3121（cys I）-AFE_3125（cys N）
F10 ：TGTGCGGCGACAGGATTTAT
R10 ：CGTCCAACTGGTCGGCAAAAAT
1897
注 ：AFE_2971（cys NC）：AFE_2971 为引自 GenBank 中最新的基因编码 ；cys NC 为基因名称
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2134
光合细菌利用 APS，而细菌和真菌利用 PAPS［20］。
Kelley 等［21］利用萤火虫的敏感的生物荧光系统，在
Thiobacillus ferrooxidans 中并没有得到 PAPS 与硫同
化的代谢相关的证据。因此，我们尝试性地将其确
定为 APS 还原酶。
两 个 ORF 可 能 编 码 亚 硫 酸 盐 还 原 酶（SIR，
CysJI），在 E. coli 中，这个复杂的酶由两种不同的
多肽链组成，即 α（CysJ）和 β（CysI），并含有一
个 α8β4 结构。黄素蛋白 α8，包含 4 个 FAD 和 4 个
FMN 辅因子，并含有 NADPH-细胞色素 c 还原酶的
活性。CysI 是一个血红素蛋白，包含一个［4Fe-4S］
簇和一个西罗血红素。黄素蛋白接受来自 NADPH
的电子，并将其传递到 CysI，然后将亚硫酸盐还原
为硫化物［22］。
半胱氨酸合成的最后一步与丝氨酸乙酰转移酶
（SAT）和半胱氨酸合成酶相关，有两个 ORF 可能编
码丝氨酸乙酰转移酶，cys E1 和 cys E2，它们都负责
N-乙酰 -L-丝氨酸的生成，并可能在 Cys 操纵子的调
节中扮演重要角色。一个 ORF 可能编码 OASS cys M
基因，OASS 利用吡哆醛 -5- 磷酸（PLP）作为辅因子，
glt
hyp
glgB
iscAA
iscAA iscU iscS-3 iscR cysE-2 trmH ip hyp ispZ
nifU iscS-2 nifV cysE-1 nifW niR arp cdp
hyp SPFH pgl cysM hyp hyp hyp rumA
cobA cysN cysD-2 cysH cysI cysJ mep hyp
cpx hyp cysQ trp cysNC cysD-1 hyp glt
白色箭头代表所有的预测的与硫酸盐同化相关的 ORF
图 1 A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组中预测的硫酸盐同化基因
表 2 Acidithiobacillus ferrooxidansATCC 23270 硫酸盐同化基因可能的作用及功能
位点 基因名称 基因功能 分子功能
AFE_2970 cys D-1 sulfate adenylyltransferase，small subunit Nucleotidyltransferase
AFE_2971 cys NC sulfate adenylate transferase，large subunit-adenylylsulfate kinase Kinase ；transferase
AFE_3123 cys H adenylylsulfate reductase，thioredoxin dependent Oxidoreductase
AFE_3121 cys JI sulfate adenylyltransferasesulfite reductase（NADPH）hemoprotein Oxidoreductase
AFE_2832 cys M Cysteine synthase B Transferase
AFE_1505 cys E1 serine O-acetyltransferase acyltransferase
是许多生物中 PLP 依赖的酶中 β 家族中的一员。
2.2 基因组DNA的提取
由图 2 所示，嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因组条带
在 10 kb Marker 的上方，大小符合理论值，条带完整、
明亮、清晰、无拖尾现象而且无 RNA 污染，表明 A.
ferrooxidans 的基因组可用于下游实验。
2.3 RNA 提取结果
由图 3 所示，嗜酸氧化亚铁硫杆菌的总 RNA
为清晰、完整的 3 个条带，符合原核生物的为 23S
RNA、16S RNA 与 5S RNA，总 RNA 提取纯化过程
2016,32(2) 135郑春丽等：嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫酸盐同化相关基因的鉴定与分析
片段长度为 2 701 bp，说明 cys J、cys I、cys H、cys D-2
一起转录。图 4-J 显示，目的片段长度为 1897 bp，
说明 cys I、cys H、cys D-2、cys N 一起转录。
2.5 A. ferrooxidans ATCC 23270的硫酸盐同化基因
的重组
用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的关键基因编码的
相应蛋白质分的子量分别是，CysD-1 为 33.228 kD，
CysH 为 28.203 kD，CysJ 为 66 kD，CysI 为 60 kD，
CysE 为 28 kD，CysM 为 31.682 kD，大小与理论预
测值相符，电泳分析结果（图 5）显示，其无明显
杂带，表明其蛋白纯度较好，因此所纯化基因可用
于后续的检测。
2.6 酶活分析
根 据 我 们 前 文 的 预 测 和 分 析［24］，ATP 硫 酸
化 酶 由 许 多 亚 基 组 成， 其 中 结 构 基 因 可 能 是 cys
D-1。我们纯化并测定了这个基因的活性，结果低
于（3.0×102±10.91）U/mg。ATP 硫 酸 化 酶 的 活 性
可能是由亚基共同构成的。APS 还原酶的活力是
（5.0×103±25.68）U/mg。亚硫酸盐的比活力（α 亚
基 CysJ）为（24.03±0.76）U/mL，将 α 亚基与 β 亚
基（CysI）融合后，比活力提高到了（39.52±1.17）
U/mL。丝氨酸乙酰转移酶（CysE-1）的比活力为
（18.08±0.55）U/mL。O-乙酰丝氨酸巯解酶（CysM）
的活力为（5.0×104±52.68）U/mg。根据酶的特性，
纯化的关键基因具有相关酶的活性，但是活力很低，
尤其是由许多亚基构成的酶。然而，这些数据能够
有效地说明这些关键基因编码的酶表现出了半胱氨
酸合成的催化功能。
2.7 A. ferrooxidans ATCC 23270可能的硫酸盐同化
途径
根据对 A. ferrooxidans 硫酸盐同化基因的分析和
描述绘制出的可能的硫酸盐同化途径（图 8）。硫被
转运进细胞后，首先以磷酸腺苷硫酸（APS）的形
式被 ATP 硫酸化酶（由 cys D 和 cys N 编码）同化。
然后 APS 被 APS 还原酶（由 cys H 编码）还原为亚
硫酸盐，亚硫酸盐被 NADPH-亚硫酸盐还原酶（由
cys JI 编码）还原为硫化物。最后，硫化物与 O-乙
酰丝氨酸反应，被 O-乙酰丝氨酸巯解酶（由 cys M
编码）还原为 H2S，O-乙酰丝氨酸是丝氨酸乙酰转
10 kb
1 kb
图 2 A.ferrooxidans 基因组 DNA 电泳图
中无明显的 RNase 作用导致的降解，经 Nano Drop
紫外分光光度计检测，在波长为 260 nm 和 280 nm
处的消光系数 OD260 与 OD280 的比值均在 1.80-2.00，
说明总 RNA 的完整性与纯度均较好，mRNA 降解较
少，可用于后续实验研究。
3000
bp
M RNA
1000
23 S
16 S
5 S100
图 3 A. ferrooxidans RNA 电泳图
2.4 RT-PCR 共转录鉴定
结果如图 4 所示。其中，图 4-A 显示，目的片
段长度为 261 bp，泳道 4 出现了扩增条带说明进行
了共转录。图 4-B 显示目的片段长度为 256 bp，说
明 cys J 与 cys I 进行了共转录。图 4-C 显示，目的片
段长度为 202 bp，说明 cys I 与 cys H 进行了共转录。
图 4-D 显示，目的片段长度为 199 bp，说明 cys H 与
cys D-2 进行了共转录。
图 4-E 显示，目的片段长度为 253 bp，说明 cys
D-2 与 cys N 一起转录。图 4-F 显示，目的片段长度
为 1941 bp，说明 cys J、cys I、cys H 一起转录。图
4-G 显示，目的片段长度为 962 bp，说明 cys I、cys H、
cys D-2 一起转录。
图 4-H 显示，目的片段长度为 1 134 bp，说明
cys H、cys D-2、cys N 一起转录。图 4-I 显示，目的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2136
移酶（由 cys E 编码）利用乙酰辅酶 A 将丝氨酸乙
酰化所得。
3 讨论
通过生物信息学的分析，发现了 6 个可能的硫
酸盐同化途径相关的关键基因 cys JI、cys H、cys D-2、
cys N、cys D-1 和 cys NC。在微生物的基因组中，功
能相关的基因往往处于同一个转录元件中。原核生
物中，功能相同的基因往往位于基因组的相邻位置
成簇出现，甚至一同转录，如色氨酸操纵子和乳糖
操纵子都是研究的比较清楚的操纵子。因此，我们
用 Reverse transcriptase PCR 技术对 Cys 操纵子进行
了研究。Cys 操纵子是 A. ferrooxidans 中与重金属抗
性密切相关的基因簇，它们可能编码了一个多功能
酶或者他们的表达是相连的，本研究通过 Reverse
transcriptase PCR 技术从转录水平上验证了 Cys 操纵
子上相关基因的共转录情况。实验中以反转录形成
的 cDNA 为模板，对 Cys 操纵子上的相关基因进行
A ：cys D-1 与 cys NC 共转录 ；B ：cys J 与 cys I 共转录 ；C ：cys I 与 cys H 共转录 ；D ：cys H 与 cys D-2 共转录 ；E ：cys D-2
与 cys N 共转录 ；F ：cys J、cys I、cys H 共转录 ；G ：cys I、cys H、cys D-2 共转录 ；H ：cys H、cys D-2、cys N 共转录 ；I ：
cys J、cys I、cys H、cys D-2 共转录 ；J ：cys I、cys H、cys D-2、cys N 共转录。M ：DNA Marker ；1 ：不添加任何模板的空白
对照 ；2 ：以 RNA 为模板的阴性对照 ；3 ：以 DNA 为模板的阳性对照 ；4 ：以 cDNA 为模板的样品
图 4 RT-PCR 电泳图
1500
bp
1 2 3 4 M 1 2 3 4M 1 2 3 4 M 1 2 3 4M
1000
500
100
1500
bp
1 2 3 4 M
1000
500
100
1500
bp
1000
500
100
10
kb
1 2 3 4 M 1 2 3 4M
10
kb
2
1
1 2 3 4M
10
kb
2
1
3000
bp
1000
100
1 2 3 41 2 3 4 MM
2
1
1500
bp
1000
500
100
A
E F G
H I J
B C D
2016,32(2) 137郑春丽等：嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫酸盐同化相关基因的鉴定与分析
PCR 扩增。由以上电泳结果表明，（1） 所有以基因
组为模板的阳性对照均有与目的片段长度相同的扩
增条带出现，说明 A. ferrooxidans 菌中存在这些基因。
（2） 空白对照全部没有扩增条带出现说明 PCR 体系
没有被污染。（3） 阴性对照全部没有出现扩增条带，
说明提取到的总 RNA 中没有基因组的 DNA 污染，
结果准确可信。即 ：cys D-1 和 cys NC 共转录。Cys
JI、cys H、cys D-2、cys N 共 转 录。CysD 是 ATP 硫
酸化酶蛋白家族一员，有研究发现，在硫酸盐的代
谢过程中，ATP 硫酸化酶会与其他与硫代谢相关的
酶一起组成一个多酶复合体［25-27］。生物信息学研究
也证实了 A. ferrooxidans 中 CysN 和 CysD 位于同一个
操纵子上，他们的复合体 CysDN 共同参与了 ATP 硫
酸化酶的催化反应［24］。
实验对嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫酸盐同化相关基
因进行分析，对其关键基因进行体外表达性质研究，
结果表明，硫酸盐同化的基本代谢路径可能为 ：被
运输到体内的硫酸盐首先被 cys DN 编码的 ATP 硫酸
化 酶 激 活 为 APS（adenosine-5-phosphosulfate）， 随
后被 cys H 基因编码的 APS 还原酶还原为亚硫酸盐，
亚硫酸盐又被 cys JI 编码的亚硫酸盐还原酶还原为
硫化物，最后硫化物与 O-乙酰丝氨酸由 cys M 编码
的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。在硫酸盐的同
化途径中发挥关键作用的是 4 个关键酶 ：ATP 硫酸
化酶（ATPS）、APS 还原酶、亚硫酸盐还原酶（SIR）、
半胱氨酸合成酶，并且硫的代谢也是嗜酸氧化亚铁
硫杆菌（A. ferrooxidans）非常重要的能量代谢，其
包括硫的氧化与还原。因而对嗜酸氧化亚铁硫杆菌
进行硫酸盐同化的研究，对嗜酸氧化亚铁硫杆菌硫
的代谢会提供重要的支撑，同时对其各方面研究提
供了一定的基础。
116
kD
CysD-1M
M M M
M M
33.228
kD
66
45
35
25
116
kD
CysI
60
kD
66
45
35
25
116
kD
CysE
28
kD
66
45
35
25
116
kD
CysM
31.682
kD
66
45
35
25
116
kD CysH
28.203
kD
66
45
35
25
116
kDCysJ
66
kD
66
45
35
25
18
14
图 5 A. ferrooxidans ATCC 23270 中假定的硫酸盐同化基因的 SDS-PAGE 结果
表 3 A. ferrooxidans ATCC 23270 中硫酸盐同化基因的酶
活测定
基因 活性
cys D-1 3.0×102 ± 10.91 U/mg
cys H 5.0×103 ± 25.68 U/mg
cys J 24.03 ± 0.76 U/mL
cys JI 39.52 ± 1.17 U/mL
cys E 18.08 ± 0.55 U/mL
cys M 5.0×104 ± 52.68 U/mg
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2138
4 结论
生物信息学分析结果表明，基因 cys JI、cys H、
cys D-2、cys N、cys D-1 和 cys NC 均与 A. ferrooxidans
ATCC 23270 菌株硫酸盐同化途径有一定的相关性。
Cys 操纵子上相关基因的共转录结果表明，cys D-1
和 cys NC 共转录。Cys JI、cys H、cys D-2、cys N 共
转录。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的关键基因编码
的相应蛋白质分子量分别是 CysD-1 为 33.228 kD，
CysH 为 28.203 kD，CysJ 为 66 kD，CysI 为 60 kD，
CysE 为 28 kD，CysM 为 31.682 kD，大小与理论预
测值相符 ；在硫酸盐的同化途径中发挥关键作用的
是 4 个关键酶 ：ATP 硫酸化酶（ATPS）、APS 还原
酶、亚硫酸盐还原酶（SIR）、半胱氨酸合成酶。A.
ferrooxidans 硫酸盐同化的基本代谢路径可能为 ：被
运输到体内的硫酸盐首先被 cys DN 编码的 ATP 硫酸
化 酶 激 活 为 APS（adenosine-5-phosphosulfate）， 随
后被 cys H 基因编码的 APS 还原酶还原为亚硫酸盐，
亚硫酸盐又被 cys JI 编码的亚硫酸盐还原酶还原为
硫化物，最后硫化物与 O-乙酰丝氨酸由 cys M 编码
的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。
Sulfateintracellular
O-Acetylserineacellular-lyase B
cys M
Cysteine
Acetate
O-Acetylserine
ATP
sulfurylase
cys DN
APS
reductase
cys H
Serine
transacetylase CoA
cys E
Sulfite
reductase
cys JI
Sulfite
Sulfite
APS
ATP
PAPS
Serine
+
Acetyl-CoA
PPi+H2O
APS kinase
cys NC
NADP
NADPH
PAP
图 8 A. ferrooxidans ATCC 23270 可能的硫酸盐同化途径
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（责任编辑 马鑫）