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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
嗜酸氧化亚铁硫杆菌半胱氨酸合成酶的
表达、纯化及其性质鉴定
郑春丽1，2 李艳君2 钱林1 柳建设1
(1东华大学环境科学与工程学院，上海 201620;2内蒙古科技大学数理与生物工程学院，包头 014010 )
摘 要: 半胱氨酸合成酶是半胱氨酸合成反应的关键限速酶，催化了半胱氨酸合成的最后一个步骤。以 A． ferro-
oxidans ATCC 23270 基因组为模板，通过 PCR 扩增得到编码半胱氨酸合成酶(cysM)的基因，与原核表达载体 PLM 1 构
建重组体，转入大肠杆菌 DH5α 中，测序正确后，加 IPTG 诱导表达，用一步亲和层析法纯化出了浓度和纯度都较高的半
胱氨酸合成酶。由蛋白颜色和紫外分析，确定是以 PLP 辅基作为活性中心。表达产物进行 SDS-PAGE 分析，证实分子
量为 32 kD。
关键词: 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 半胱氨酸合成酶(cysM) 克隆 表达 纯化
Expression，Purification and Characterization of a
Cysteine Synthase from Acidithiobacillus ferrooxidans
Zheng Chunli1，2 Li Yanjun2 Qian lin1 Liu Jianshe1
(1College of Environmental Science and Engineering，Donghua University，Shanghai 201620;2School of Mathematics，
Physics and Biological Engineering，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010)
Abstract: Cysteine synthase as a key enzyme involved in the pathway of the cysteine biosynthesis，can catalyze the last step of the
cysteine biosynthesis forming L-cysteine and acetate from O-acetyl-L-serine(OAS)and sulfide． According to A． ferrooxidans ATCC
23270 genomes as template，the gene cysM which encodes cysteine synthase was cloned，and the fragment was linked into the prokaryot-
ic expression vector PLM 1． Then the recombined expression plasmid was transduced into DH5α． After sequence was mensurated right，
with the addition IPTG expressed in Escherichia coli，the soluble protein was purified by one-step affinity chromatography to apparent
homogeneity． Colors and UV-vis scanning results of the recombinant protein confirmed that it was a pyridoxal 5-phosphate(PLP)-con-
taining protein． The molecular mass of the cysteine synthase was 32 kD determined by SDS-PAGE．
Key words: Acidithiobacillus ferrooxidans Cysteine synthase(cysM) Clone Expression Purification
收稿日期:2010-08-09
基金项目:全国优秀博士学位论文专项资金资助项目(200549) ，国家自然科学基金项目(0874032) ，上海市重点学科建设项目(B604)
作者简介:郑春丽，博士研究生，讲师，研究方向:蛋白质相互作用;E-mail:zhengchunli1979@ 163． com
通讯作者:柳建设，E-mail:ljscsu@ 263． net
嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxi-
dans)是典型的化能自养菌，属于革兰氏阴性细菌，
好氧嗜酸，由于能生长在元素硫和硫化物矿物上，因
而成为生物湿法冶金中最有应用价值的一个种。目
前已有不少国家应用它提取铜、铀和金等已获得工
业生产［1 － 4］，在混合精矿分离和铝土矿脱硅等方面
有比较广泛的应用;在环境方面，应用生物淋滤技术
去除并回收污泥或底泥中难溶重金属，去除煤矿和
烟气中的硫等［5，6］。硫的代谢是嗜酸氧化亚铁硫杆
菌重要的能量代谢，包括硫的氧化与还原。其中无
机的硫酸盐被还原和固定到半胱氨酸称为硫的同化
途径，广泛存在于生命有机体中，如植物、真菌、细菌
和海藻等。半胱氨酸具有一个自由的巯基，是蛋白
质的结构和功能上重要的氨基酸残基。半胱氨酸的
自由硫醇基团涉及二硫键的形成，对一些蛋白的稳
定至关重要，也是各种酶、辅助因子和调控蛋白的催
2011 年第 3 期 郑春丽等:嗜酸氧化亚铁硫杆菌半胱氨酸合成酶的表达、纯化及其性质鉴定
化及氧化还原中心。半胱氨酸也是细胞中具有重要
的氧化还原缓冲器和解毒功能的谷胱甘肽的限制性
营养成分，但是过量的半胱氨酸还是有毒的［7］。
在植物方面，一些古生菌和大多数真菌中半
胱氨酸的体内合成来源于丝氨酸涉及两个酶的作
用，丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和半胱氨酸合成酶
(cysM)。丝氨酸乙酰转移酶催化乙酰辅酶 A和丝
氨酸合成 O-乙酰丝氨酸，这个代谢物被半胱氨酸
合成酶催化，同时消除乙酰基，添加 H2S 形成半胱
氨酸。硫源由硫的同化途径所提供。半胱氨酸合
成酶和丝氨酸乙酰转移酶在控制半胱氨酸合成途
径对于硫可利用性的变化过程中起到至关重要的
作用［8］。在大多数细菌中，磷酸吡哆醛(PLP)序列
依赖的半胱氨酸合成酶有两个异构的酶，半胱氨
酸合成酶-A(cysK)和 半胱氨酸合成酶-B(cysM)。
对 A． ferrooxidans ATCC 23270 基因组分析发现，其
只存在一个半胱合成酶单体基因，即半胱氨酸合
成酶 B(cysM)。因此，研究和确定嗜酸氧化亚铁
硫杆菌中半胱氨酸合成酶的性质和结构特征，进
而确定其功能属性是非常有意义的。
1 材料与方法
1． 1 材料
菌株嗜酸氧化亚铁硫杆菌标准菌株 ATCC 23270，
购自美国模式菌种收集中心(ATCC)。质粒采用 PLM
1表达载体［9］。感受态细胞(DH5α，BL21 两种)为
TIANGEN 产品;TaqDNA 聚合酶，限制性内切酶
BamH I、SalⅠ，T4 DNA 连接酶，1 kb DNA Ladder，蛋
白 Marker，溶菌酶，LB 培养基，氨苄青霉素均为上海
生工生物工程公司产品;Hitrap chealting HP 柱为
GE公司产品;DNA 快速纯化回收试剂盒、胶回收试
剂盒和质粒快速提取试剂盒为 OMEGA产品。其余
均为国产分析纯。
1． 2 PCR 引物设计与合成
根据 GenBank 已公布的 ATCC 23270(www．
tigr． org)的全基因组序列设计引物，正向引物:5-
CGCGCGGATCCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGA-
TCGCATCACCATCACCATCACGGTGGCTGGAGAAC-
TGGGTGGGCAATACC-3，含有一个 BamH I 酶切位
点(下划线部分) ，1 个核糖体结合位点(AGGAG-
GA) ，还有 1 个六重组氨酸标签 MRGSHHHHHH(起
始密码子和六重组氨酸) ，和 2-10 cysM 氨基酸密码
子。反向引物:5-CTGCAGGTCGACTTAGGCCGGA-
AAA-ACGCCCGTAGAGAGGTAGCG-3，含有 1 个 Sal I
酶切位点(下划线部分) ，终止密码子(TTA)。引物
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1． 3 基因组的提取与 PCR
利用 Bio Basic Inc 公司生产的 EZ-10 spin col-
umn genomic DNA分离试剂盒提取 A． ferrooxidans 基
因组，并以此基因组为模板，以上述引物进行 PCR
扩增。PCR 反应体系(50 μL) :10 × PCR 缓冲液 5
μL，MgCl2(20 mmol /L)4 μL，dNTPs (10 mmol /L)1
μL，引物 cysM-F(10 pmol /μL)和引物 cysM-R(10
pmol /μL)各 2． 5 μL，模板 DNA(约 100 ng /μL)1 μL，
Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0． 5 μL。反应条件:94℃ 4
min 94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃ 100 s，共 30 个循环;
72℃ 10 min。获得 PCR 产物后，取部分反应混合物
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测［9］。
1． 4 重组载体的构建
检测正确的 PCR 产物用 DNA回收试剂盒纯化
回收，与载体 PLM 1［9］分别用内切酶 SalⅠ与BamH I
双酶切过夜。然后切胶回收 PCR 产物与载体，T4
DNA 连接酶连接，转化重组载体，从过夜培养的平
板中筛选阳性克隆，经双酶切验证正确的阳性克隆
送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，同时，
用质粒快速提取试剂盒提取质粒备用。将鉴定正确
的载体命名为 PLM 1-cysM-his6。
1． 5 半胱氨酸合成酶的诱导表达
取阳性克隆质粒 10 μL 转化入感受态细胞
(BL21)中，将得到的转化产物接种到含有 50 μg /
mL氨苄青霉素的 LB 培养基中进行培养。然后接
种到 500 mL 同样氨卞青霉素抗性的 LB 培养基中
扩大培养至 OD600值为 0． 6 后，加入 0． 5 mmol /L
IPTG，室温下诱导培养过夜。离心收集细菌沉淀，用
Start Buffer(20 mmol /L 磷酸钾，pH7． 4，0． 5 mol /L
氯化钠)悬浮得到的沉淀，充分混匀，加入 5 mg 溶
菌酶，室温下裂解细胞 30 min 后进行彻底的超声裂
解。将得到的细胞悬液离心收集上清，即得粗蛋白。
使用 Hitrap chealting HP 柱，用一步亲和层析法纯化
蛋白，得到浓度较高的蛋白质溶液。
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1． 6 聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析蛋白的分子量和
纯度［10］，分离胶浓度为 15%，积层胶浓度为 5%，电
极缓冲液:Tris-甘氨酸(pH8． 3)。上样后首先恒定
电流为 15 mA，待染料跑至浓缩胶和分离胶分界处
下方 1 cm 左右后，将电流恒定为 25 mA，电泳至样
品到分离胶最下方处结束［11］。
1． 7 酶活性分析
根据文献［12］的方法测定半胱氨酸合成酶的活
性。反应体系包括5 mmol /L OAS，3 mmol /L硫化钠，
10 mmol /L DTT 和 0． 1 mol /L磷酸钠 pH8总体积 0． 2
mL。通过添加 OAS 起始反应并且在 26℃孵育 10
min。孵育结束之后，0． 15 mL部分被移除然后把与酸
性茚三酮试剂混合至 0． 35 mL(13 g /kg 茚三酮混合
在 1∶ 4 盐酸∶醋酸) ，在 100℃加热 10 min去允许颜色
的发展。冰上冷却，加入 0． 7 mL 乙醇，用分光光度计
检测 550 nm处的吸光值。每分钟 1 nmol OAS 转化
为半胱氨酸的量定义为酶的 1个活力单位。
2 结果与讨论
2． 1 半胱氨酸合成酶基因的 PCR扩增及重组质粒
鉴定
PCR 扩增产物经 1． 0%琼脂糖凝胶电泳，在约
885 bp处可见特异性扩增条带，与理论值 885 bp 相
符。测序结果与 GenBank公布的基因序列一致。以
挑选的表达质粒进行酶切鉴定，结果在 3 500 bp 和
885 bp处出现特异性扩增条带(图 1) ，分别为载体
PLM 1 和 cysM基因的目的条带。说明 PLM 1 载体
上插入的外源 cysM 基因长度、方向及其序列均
正确。
2． 2 半胱氨酸合成酶的诱导表达
经 IPTG诱导表达并经超声裂解细菌后，超声
上清中含有可溶性的天然表达半胱氨酸合成酶。
经一步亲和层析法分离，得到纯化的半胱氨酸合
成酶，纯度较高。纯化的蛋白为亮黄色(图 2) ，这
是含磷酸吡哆醛蛋白特有的颜色。对纯化后的蛋
白进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定，半胱
氨酸合成酶的相对分子质量为 32 kD，纯度大于
95%，如图 3 所示。可知半胱氨酸合成酶在大肠
杆菌中的表达量很高，而且分子量大小与理论计
算结果相符。
图 1 重组载体双酶切电泳图
图 2 半胱氨酸合成酶纯化蛋白照片
图 3 纯化的 SDS-PAGE电泳图
2． 3 半胱氨酸合成酶的紫外可见分光光度分析
将纯化后的半胱氨酸合成酶在室温下用紫外
可见光谱扫描仪进行紫外可见分光光度分析，如
图 4 所示。Holo 形式半胱氨酸合成酶在 412 nm
有最大吸收峰，而 APO形式的没有，说明这是磷酸
吡哆醛辅助因子的特征吸收峰，认为磷酸吡哆醛
与赖氨酸残基形成了一个内部的席夫碱，此性质与
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2011 年第 3 期 郑春丽等:嗜酸氧化亚铁硫杆菌半胱氨酸合成酶的表达、纯化及其性质鉴定
文献报道的半胱氨酸合成酶的特性一致［13，14］。据
报道，半胱氨酸合成酶的反应机制属于 Bi-Bi ping-
pong 动力学机制，分为两个部分，在静止状态下，辅
助因子 PLP(Ⅰ)和赖氨酸残基形成了一个内部的
席夫碱，这个引入的底物和 PLP(Ⅱ)形成了一个外
部的席夫碱，通过一个 α-碳的质子被活性位点赖
图 4 嗜酸氧化亚铁硫杆菌的 APO及 Holo
形式 cysM的紫外可见光谱扫描
氨酸的 ε氨基，从 O-乙酰丝氨酸乙酰化的 β 消除反
应。第一部分反应的产物是 α-丙烯酸铵中间产物，
共价结合了 PLP (Ⅲ)。第二部分反应起始于 α-丙
烯酸铵中间产物的在 α-碳的硫化物的亲核攻击，这
样 α-碳被从新质子化，导致半胱氨酸键和形成外部
席夫碱［8，15］。
2． 4 半胱氨酸合成酶的分子模拟
对 A． ferrooxidans半胱氨酸合成酶基因，进行同
源序列分析与分子模拟，结果如图 5 所示。由图可
知，其是一个单体。来源于 Salmonella typhimurium
的半胱氨酸合成酶确定其形成内部席夫碱的赖氨酸
残基是 Lys-42［15］，在 A． ferrooxidans 中存在两个高
度保守的赖氨酸残基，Lys30 和 Lys41 可能是席夫碱
形成的关键氨基酸，对含有磷酸吡哆醛辅助因子的
其他酶类分析，发现组氨酸也是磷酸吡哆醛结合的
重要氨基酸，对 A． ferrooxidans 分析认为 His150 与
His168 对辅助因子的稳定也是至关重要的氨基酸
位点。
图 5 半胱氨酸合成酶分子模拟整体结构图(A)及半胱氨酸合成酶键和位点图(B)
3 结论
以 A． ferrooxidans ATCC23270 基因组为模板克
隆表达、纯化出了半胱氨酸合成酶的基因(cysM) ，
对其性质进行鉴定，其是一个 PLP 序列依赖的酶，
蛋白呈亮黄色，分子量为 32 kD。分子模拟分析表
明是一个单体，K30、K41、H150 和 H168 位点氨基酸
可能是活性中心稳定重要的氨基酸位点，需要进一
步进行晶体结构的解析，最终了解其功能特性及反
应机制。
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(责任编辑 狄艳红)
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