全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-11-23
基金项目 : 国家自然科学基金项目（50374075, 41073060）, 上海市重点学科资助项目（B604），高等学校博士点专项科研基金（20100075110010）
作者简介 : 钱林 , 男 , 博士研究生 , 研究方向 : 蛋白相互作用 ; E-mail: qianlin_2004@hotmail.com
通讯作者 : 柳建设 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 环境生物技术 ; E-mail: liujianshe@dhu.edu.cn
嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ATP硫酸化酶的表达、
纯化及性质鉴定
钱林 郑春丽 柳建设
（东华大学环境科学与工程学院，上海 201620）
摘 要： ATP硫酸化酶是一种催化 ATP和 SO42-反应生成腺嘌呤-5-磷酸硫酸（APS）和焦磷酸盐（PPi）的酶，它是硫酸根
同化反应第一步的关键酶。以嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A. ferrooxidans ATCC 23270）基因组为模板，用 PCR扩增得到 ATPS基因，并
克隆到表达载体 pLM1上。加入 IPTG的诱导表达，用 AKTA蛋白纯化仪的镍柱亲和层析纯化得到浓度和纯度都较高的 ATPS蛋白。
SDS-PAGE分析，证实其分子量大小为 33 kD，并成功的测出了其活性，比活达 3.0×103 U/mg。
关键词： 嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ATP硫酸化酶 表达 纯化
Expression，Purification and Characterization of ATP
Sulfurylase from Acidithiobacillus ferrooxidans
Qian Lin Zheng Chunli Liu Jianshe
（College of Environmental Science and Engineering，Donghua University，Shanghai 201620）
Abstract: ATP sulfurylase, as a key enzyme that catalyzes the first step of the sulfur assimilation pathway, can catalyze the reaction
between ATP and sulfate to produce APS and pyrophosphate （PPi）. In this study, the gene of ATP sulfurylase from A.ferrooxidans ATCC 23270
was cloned and expressed in Escherichia coli, and the protein was purified by AKTA explorer using affinity chromatography. SDS-PAGE revealed
the molecular weight of ATP sulfurylase was 33 kD. The specific activity of the purified ATP sulfurylase was 3.0×103 U/mg.
Key words: Acidithiobacillus ferrooxidans ATP sulfurylase Expression Purification
嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxi-
dans）是一种典型的化能自养菌，属于革兰氏阴性细
菌，好氧嗜酸，广泛存在于金属矿区场地以及生物
浸矿体系之中［1， 2］。A. ferrooxidans具有氧化亚铁和
还原态硫化物的能力，在生物湿法治金、煤炭脱硫、
重金属污染防治和生物修复等方面都有着广泛的应
用［3-6］。
ATP 硫酸化酶（ATP sulfurlase，简称 ATPS）广
泛存在于植物、动物、细菌和真菌中。ATP 硫酸化
酶是催化硫酸盐同化反应的第一步关键酶，在 ATP
硫酸化酶的催化下，硫酸根离子与 ATP 反应生成腺
嘌呤 -5- 磷酸硫酸（APS）和焦磷酸（PPi），此反应
为硫酸盐代谢的唯一起点，反应式如下［7-9］：
ATP 硫酸化酶已经从拟南芥、烟草、产黄霉素
菌、酿酒酵母中进行提取并纯化，并且其编码基因
也分别在原核生物、真核生物、动物和植物中得到
克隆和表达。目前对 ATP 硫酸化酶的研究已经深入
到 ATPS 蛋白的结构功能［10， 11］以及 ATP 硫酸化酶
基因的表达调控机制方向［12， 13］。
硫的代谢是 A. ferrooxidans重要的能量来源，
而 ATP 硫酸化酶是催化硫酸根同化反应第一步的
关键酶。研究发现在 A. ferrooxidans中存在着一个
2012年第6期 137钱林等 ：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ATP 硫酸化酶的表达、纯化及性质鉴定
由 CycJ、CycI、CycH、CycD、CycN 和 CysG 基因编
码的 cys操纵子，这个操纵子参与调控着整个硫代
谢途径从硫酸盐到半胱氨酸的电子传递过程［14，15］，
CysD1 基因同时编码了 ATP 硫酸化酶蛋白。针对 A.
ferrooxidans ATP 硫酸化酶在硫酸盐同化途径中性质
和功能进行研究，对于深入了解 A. ferrooxidans 硫代
谢途径中电子传递机理，揭示 A. ferrooxidans硫的氧
化代谢机制具有重要的意义。本研究以A. ferrooxidans
ATCC 23270 基因组为模板，通过基因重组技术克隆
ATP 硫酸化酶基因（CysD1）并在大肠杆菌中表达，
利用亲和层析法纯化 ATP 硫酸化酶，并进行酶活的
测定。
1 材料与方法
1.1 材料
嗜酸氧化亚铁硫杆菌标准菌株 ATCC 23270 购
自美国模式菌种保藏中心（American Type Culture
Collection）。质粒采用 pLM1 表达载体［16］。化学试
剂均为分析纯，购自上海国药集团及上海生工公司；
分子生物学试剂购自 NEB 公司，引物的合成与测序
由上海生工完成。
1.2 方法
1.2.1 基因组的提取及 PCR 扩增 A. ferrooxidans A-
TCC23270接种到以亚铁为能源的9K pH2.0液体培养
基［17］于 30℃，180 r/min 摇床震荡培养。将培养至
对数生长期的细菌采用上海生工的 UNIQ-10 基因组
抽提试剂盒提取基因组 DNA，作为 PCR 反应的模板。
根据 GenBank 公布的 ATCC 23270 的全基因组
序列（www.tigr.org）设计引物，正向引物 CysD1-F:
5-CGCGCGAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGG
ATCGCATCACCATCACCATCACAATACGCTCGAAGC
CGAATCCCTCGGAATC-3，含有一个 EcoR I 酶切位
点（GAATTC），一个核糖体结合位点（AGGAGGA），
以及 1 个六重组氨酸标签 MRGSHHHHHH（起始密
码子和六重组氨酸）；反向引物 CysD1-R ：5-CTGCA
GGTCGACTTAGAAATAGCCCTCCTGCTTCTTGCGTTC
CATG-3，含有一个 Sal I 的酶切位点（GTCGAC）。
PCR 反应体系如下（50 μL）: 10×PCR buffer
5 μL，MgCl2 （20 mmol/L） 4 μL，dNTPs （10 mmol/L）
1 μL， 引 物 CysD1-F （10 pmol/μL） 和 CysD1-R （10
pmol/μL） 各 2.5 μL， 模 板 DNA（ 约 100 ng/μL） 1
μL，Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL） 0.5 μL。扩增程序如下 :
94℃ 4 min ； 94℃ 45 s，61℃ 45 s，72℃ 90 s，共 30
个循环 ；72℃ 10 min。
1.2.2 重组载体的构建 PCR 产物和载体 pLM1 分
别用 EcoR I 和 Sal I 双酶切过夜。切胶回收 PCR 产
物与载体 pLM1，用 T4 DNA 连接酶连接后转入大肠
杆菌感受态细胞 DH5α。在平板上筛选阳性克隆，将
双酶切验证正确的阳性克隆送样测序。将鉴定正确
的载体命名为 pLM1-CysD1。
1.2.3 ATP 硫酸化酶的表达纯化 将阳性克隆质粒
10 μL 转入大肠杆菌感受态细胞 BL21 （DE3）中，将
转化产物接种至含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培
养基中过夜培养后，按 1 50 比例稀释后转到 500
mL 含有 50 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中扩大培
养 OD600 接近 0.6，加入 0.5 mmol/L IPTG 后室温诱导
蛋白过夜。离心收集菌体后重悬细胞于缓冲溶液（20
mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH8.0）， 用 匀
浆器均匀分散沉淀，倒入细胞机械破碎仪破碎细菌。
将得到的细胞悬液离心收集上清，利用 GE 公司的
AKTA 蛋白纯化仪的镍亲和层析柱进行蛋白的分离
纯化。
1.2.4 SDS- 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳 利
用聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分析蛋白的分子量和
纯度。分离胶浓度为 15%，浓缩胶浓度为 5%，用
pH8.3 的 Tris- 甘氨酸作为电极缓冲液。电泳结束后
用考马斯亮蓝 R-250 进行染色。
1.2.5 ATPS 酶活分析 参照 Karamohamed 的试验方
法［18］，反应体系包括 : 0.1 mol/L Tris-Ac （pH8.0），0.5
mmol/L EDTA，5 mmol/L Mg （Ac）2，0.4 mg/mL PVP，
0.02% BSA，1 mmol/L DTT，4 μmol/L APS，4 μmol/L
PPi，0.4 mmol/L d-luciferin，1.46 μg/mL luciferase。
以 Sigma 公司的标准 ATPS 作为对照。ATPS 酶活力
单位定义为 : 在 30℃下，pH 8.0 的条件下，以 APS
和 PPi 为作用底物，每分钟产生 1.0 μmol ATP 所需
的酶量为一个酶活力单位。
2 结果
2.1 ATPS基因的PCR扩增及重组质粒鉴定
以 A. ferrooxidans ATCC23270 基因组为模板，经
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期138
PCR 扩增出 ATPS 全长基因（图 1）。PCR 产物插入
质粒表达 pLM1，阳性克隆经 EcoR I 和 Sal I 双酶切
之后在 882 bp 和 3 500 bp 出现特异性扩增条带（图
2），分别为 CysD1 基因和载体 pLM1 的目的条带。
测序结果表明，载体上 ATPS 基因的蛋白质编码序
列与 GenBank 公布的基因序列一致，重组质粒命名
为 pLM1-CysD1。
2.2 CysD1蛋白的诱导表达及纯化
将构建好的重组表达质粒 pLM1-CysD1 转入宿
主菌 E.coli BL21 （DE3），经 IPTG 诱导表达。将表达
后的菌体经细胞机械破碎仪破碎后，离心取上清利
2.3 ATPS酶活性分析
采用生物发光法对 ATPS 活性进行测定，ATPS
M. 100 bp DNA marker; 1. ATPs 的 PCR 扩增产物
图 1 PCR产物电泳分析
M. 1 kb DNA marker; 1. pLM1-CysD1 的 EcoR I
和 Sal I 双酶切鉴定
图 2 重组表达质粒 pLM1-CysD1
的双酶切鉴定
用 GE 公司的 AKTA 蛋白纯化仪进行 ATPS 的纯化。
目的蛋白采用镍柱亲和层析纯化，首先用 50 mmol/L
的咪唑缓冲液洗涤除去杂蛋白，再用 500 mmol/L 的
咪唑缓冲液洗脱带组氨酸标签的目的蛋白。对纯化
后的蛋白进行 SDS-PAGE 分析，由图 3 可知，纯化
后的蛋白呈单一条带，ATP 硫酸化酶的相对分子量
约为 33 kD，蛋白纯度大于 95%。可知 ATP 硫酸化
酶在大肠杆菌中得到了高效表达，同时分子量与理
论计算结果相符。
对纯化的 ATP 硫酸化酶在室温下用紫外 - 可见
光谱扫描仪进行吸收光谱分析。如图 4 所示，ATP
硫酸化酶在 420 nm 左右处有一个特征吸收峰。
M. 蛋白质分子量标准 ; 1. 经纯化的 ATP 硫酸化酶
图 3 纯化 ATP硫酸化酶的
SDS-PAGE电泳图
图 4 ATP硫酸化酶的紫外扫描图谱
能够和荧光素酶（luciferase）偶联将焦磷酸（PPi）
信号转化为光信号，在 PPi 与 luciferase 及其底物
过量时，将 PPi 转化为光信号的反应速率主要取决
于 ATPS 的活性。将反应液混合均匀后置于微弱荧
光测量仪进行实时测定。用荧光信号值和相对应
的 ATP 含量绘制标准曲线，线性回归得到线性方
程。以 Sigma 公司的标准 ATPS 作为对照，通过回
归方程计算得到此次制备的 CysD1 的 ATPS 比活为
3.0×103 U/mg，可知其确实具有催化硫酸根离子和
ATP 生成 APS 和焦磷酸完成电子转移的功能。
3 讨论
CysD 属于 ATP 焦磷酸酶蛋白家族一员，与 APS
和 PAPS 还原酶在亲缘关系上距离较远。研究发现，
在硫酸盐的代谢过程中，ATP 硫酸化酶能与其他硫
代谢相关的酶组成硫酸盐活化的多酶复合体［19-21］。
2012年第6期 139钱林等 ：嗜酸氧化亚铁硫杆菌 ATP 硫酸化酶的表达、纯化及性质鉴定
多酶复合体可提高酶的催化效率，使各种酶反应互
不干扰各自有序协调进行，避免某些中间产物的过
多积累。大肠杆菌的 ATP 硫酸化酶晶体结构已经
得到解析，是一个由 CysD 和 CysN 二聚物构成的四
聚体结构，其中 GTPase 亚基 CysN 通过构象交互作
用活化催化亚基 CysD［22， 23］。生物信息学研究也证
实 A. ferrooxidans中 cysD 和 CysN 处于在同一个操纵
子中，cysDN 共同参与 ATP 硫酸化酶的催化反应。
此处仅用 CysD1 所测得的 ATPS 酶活相对较低，其
原因可能是因为缺少了多酶复合体相互之间的催化
作用。
硫的代谢是 A. ferrooxidans能量的主要来源之
一，本课题组前期已成功的克隆表达了 A. ferrooxidans
硫的同化代谢途径的 cys 操纵子的一些关键酶，如
cysD1-ATP 硫酸化酶，cysH-APS 还原酶［24］，cysM-
半胱氨酸合成酶［25］， cysJ，cysI- 亚硫酸还原酶［26， 27］，
cysE- 丝氨酸转移酶［28］， iscS- 半胱氨酸脱硫酶［29］
等。下一步拟对不同外界环境下 cys 操纵子的表达
调控及其硫代谢过程中的电子传递机理进行研究，
以进一步深入了解A. ferrooxidans硫的氧化代谢机制，
为进一步的工业应用提供依据。
4 结论
本研究成功的克隆、表达和纯化了嗜酸氧化亚
铁硫杆菌 ATP 硫酸化酶，纯化的蛋白呈无色，相
对分子量为 33 kD，紫外可见光扫描发现在其 420
nm 处有一个特征吸收峰，ATP 硫酸化酶活性达
3.0×103 U/mg。以上结果为进一步研究 ATP 硫酸化
酶的结构和功能打下了基础，同时为揭示嗜酸氧化
亚铁硫杆菌硫的能量代谢提供了新的途径。
参 考 文 献
［1］ Kelly DP, Wood AP. Reclassification of some species of Thiobacillus
to the newly designated genera Acidithiobacillus gen. nov., Halothio-
bacillus gen. nov., and Thermithiobacllus gen. nov. International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2000, 50:
511-516.
［2］ 杨显万 , 沈庆峰 , 郭玉霞 . 微生物湿法冶金［M］. 北京 : 冶金
工业出版社 , 2003: 3-6.
［3］ Olson GJ, Brierley JA, Brierley CL. Bioleaching review part B:
Progress in bioleaching: applications of microbial processes by the
minerals industries. Applied Microbiology Biotechnology, 2003, 63:
249-257.
［4］ Acharya C, Kar RN, Sukla LB. Bacterial removal of sulphur from
three different coals. Fuel, 2001, 80: 2207-2216.
［5］ 周立祥 , 方迪 , 周顺桂 , 等 . 利用嗜酸性硫杆菌去除制革污泥中
铬的研究 . 环境科学 , 2004, 25（1）: 62-66.
［6］ Tian AY, Chen JC. Thiobacillus ferrooxidans and its utilization in
environmental engineering. Enviromental Technology, 2003, 4:
16-18.
［7］ Bick JA, Dennis JJ, Zylstra GJ, et al. Identification of a new class
of 5’-adenysulfate（APS） reductase from sulfate-assimilating
bacterial. Journal of Bacteriology, 2000, 182（1）: 135-142.
［8］ Saito K. Sulfur assimilatory metabolism-The long and smelling road.
Plant Physiology, 2004, 136: 2443-2450.
［9］ Leustek T, Martin MN, Bick JA, et al. Pathways and regulation of
sulfur metabolism revealed through molecular and genetic studies.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,
2000, 52: 141-159.
［10］ Macrae IJ, Segel IH, Fisher AJ. Crystal structure of ATO sulfurylase
from Penicillium chrysogenum: insights into the allosteric regulation
of sulfate assimilation. Biochemistry, 2001, 40（23）: 6795-6804.
［11］ Taguchi Y, Sugishima M, Fukuyama K. Crystal structure of a novel
zinc-binding ATP sulfurylase from Thermus thermophilus HB8.
Biochemistry, 2004, 43（14）: 4111-4118.
［12］ Phartiyal P, Kim WS, Cahoon RE, et al. Soybean ATP sulfurylase, a
homodimeric enzyme involved in sulfur assimilation, is abundantly
expressed in roots and induced by cold treatment. Archives of
Biochemistry and Biophysics, 2006, 450（1）: 20-29.
［13］ Nocito FF, Lancilli C, Crema B, et al. Heavy metal stress and
sulfate uptake in maize roots. Plant Physiology, 2006, 141（3）:
1138-1148.
［14］ Lochowska A, Lwanicka-Nowicka R, Plochocka D, et al. Functional
dissection of the LysR-type CysB transcriptional regulator. Regions
important for DNA binding inducer response, ologomerization,
and positive control. Journal of Biological Chemistry, 2001, 276:
2098-2107.
［15］ Valdes J, Veloso F, Jedlicki E, et al. Metabolic reconstruction of
sulfur assimilation in the extremophile A.ferrooxidans based on
genome analysis. BMC Genomics, 2003, 4: 1-16.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期140
［16］ Jiang ST, Ho ML, Jiang SH, et al. Color and quality of mackerel
surimi as affected by alkaline washing and ozonation. Journal of
Food Science, 1998, 63（4）: 652-655.
［17］ Rohwerder T, Sand W. The sulfane sulfur of persulfides is the actual
substrate of the sulfur-oxidizing enzymes from Acidithiobacillus and
Acidiphilium spp. Microbiology, 2003, 149: 1699-1709.
［18］ Karamohamed S, Nyren P. Real-time detection and quantification
of adenosine triphosphate sulfurylase activity by a bioluminometric
approach. Analytical Biochemistry, 1999, 271: 81-85.
［19］ Rachel P, Quing XT, Warwick JB, et al. The Mycobacterium
tuberculosis cysD and cysNC genes form a stress-induced operaon
that encodes a tri-functional sulfate-activating complex. Microbiol-
ogy, 2004, 150: 1681-1686.
［20］ Mathew C, Susanna L, John M, et al. Complex formation between
recombinant ATP sulfurylase and APS reductase of Allium cepa（L）.
FEBS Letters, 2007, 581: 4139-4147.
［21］ Carla S, Christel V, Ismael H, et al. Identification of a third
sulfate activation system in Sinorhizobium sp. strain BR816: the
cysDN sulfate activation complex. Applied and Environmental
Microbiology, 2003, 69（4）: 2006-2014.
［22］ Taguchi Y, Sugishima M, Fukuyama K. Crystal structure of a novel
zinc-binding ATP sulfurylase from Thermus thermophilus HB8.
Biochemistry, 2004, 43（14）: 4111-4118.
［23］ Leyh TS, Taylor JC, Markham GD. The sulfate activation locus of
Escherichia coli K12: cloning, genetic and enzymatic characteriz-
ation. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263: 12886-12892.
［24］ Zheng CL, Zhang YF, Liu YD, et al. Characterization and
reconstitute of a ［Fe4S4］adenosine 5-phosphosulfate reductase
from Acidithiobacillus ferrooxidans. Current Microbiology, 2009, 58
（6）: 586-592.
［25］ 郑春丽 , 李艳君 , 钱林 , 等 . 嗜酸氧化亚铁硫杆菌半胱氨酸合
成酶的表达、纯化及其性质鉴定 . 生物技术通报 , 2011（3）:
180-184.
［26］ 王敏 , 曾嘉 , 黄霞 , 等 . 嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚硫酸还原酶的
α 亚基黄素蛋白（cysJ）的表达、纯化及活性测定 . 现代生物
医学进展 , 2008, 8（3）: 453-455.
［27］ Zeng J, Wang M, Zhang X, et al. Expression, purification and
characterization of the sulfite reductase hemo-subunit, SiR-HP,
from Acidithiobacillus ferrooxidans. Biotechnology Letters, 2008, 30
（7）: 1239-44.
［28］ Zheng CL, Nie L, Qian L, et al. K30, H150 and H168 are essential
residues for coordinating pyridoxal 5-phosphate （PLP） of O-acety-
lserine sulfhydrylase （OASS） from Acidithiobacillus ferrooxidans
ATCC23270. Current Microbiology, 2010, 6: 461-465.
［29］ Zeng J, Zhang YF, Liu YD, et al. Expression, purification and
characterization of a cysteine desulfurase IscS from Acidithiobacillus
ferrooxidans. Biotechnology Letters, 2007, 29: 1983-1990.
（责任编辑 李楠）