全 文 ：第27卷第6期
2008年12月
生态科学
EcologicalScience
27(6)：468-473
Dec．2008
狗獾粪便DNA提取方法的初步探讨
刘宇庆1,2，吕慎金3，殷宝法1，．范红梅1，刘燕2，魏万红卜
1．扬州大学生物科学与技术学院，扬州，225009
2．扬州市邗江区农林局，扬州225002
3．临沂师范学院农林学院，临沂276000
【摘要】 在京杭大运河扬州段堤坝上采集狗獾的新鲜粪便，采用预处理一酚／氯仿抽提法、NaCI改良法、异硫氰酸胍裂
解法、淀粉吸附法及QIAamp试剂盒法5种方法对粪便样品中狗獾DNA进行提取，探讨狗獾粪便样品中DNA提取方法
和优化条件。结果表明，在5种提取方法中，淀粉吸附法的效果明显优于其它4种方法。采用粪便裂解液快速裂解细胞
后，加入淀粉去除其中的大量PCR抑制物，然后用蛋白酶K裂解、酚／氯仿／异戊醇抽提，最后使用UNIQ．10柱纯化粪便
DNA，对线粒体控制区和微卫星位点的PCR扩增反应及测序结果证实该方法的可行性。以上结果表明，通过该方法获得
的粪便DNA能够用于更深入的分子遗传学等学科的研究。
关键词：狗獾；粪便DNA；提取；PCR扩增
中图分类号：Q523+．8 文献标识码：A 文章编号；1008·8873(2008)06-468—06
ApreliminarystudyontheDNAextractionmethodfromfaecesofbadger(Meles
meles)
LIUYu．qin91’2，LVShen-jin3，YINBao．fal，FANHong．meil，LIUYan2，WEIan．hong"1’
1．CollegeofBioscience＆Biotechnology,YangzhouUniversi哆．Y u225004China
2．DepartmentofHanjiangAgriculture＆Forestry,Yangzhou225004China
3．DepartmentofAgriculture＆Forestry,LinyiNormalUniversity,Linyi276000,China
Abstract：珏efreshf cesofbadger(Melesmeles)werecollectedfromthedamofJing-HangC alnearYangzhou。andfive
DNAextractionmethodsincludingamylum-subsidingmethod．preprocess-organicsolventextr ctionmethod,NaClmodified
method，GuSCN．Si02methodanQIAampDNAStoolMiniK tmethodwereusedtoextracttheDNAfromthem．Theresults
showedtllatthehighestamplificationSuccessratewasintheamylum-subsidingmethod．Inthisstudy,fecalsampleWaslysed
rapidlywithdigestedsolution,thenDNAWaSextractedusingchloroform／phenolafterincubationwithproteinasekfollowingby
purificationtoremovenumerousp tentialPCRinhibitors．111emitochondrialDNAcontrolegiona d5microsatellitelociwer
amplified．showingthatthem tochondrialDNAcontrolegionsequencedsuccessfully．OurresultssuggestedthatDNAextraction
based0nthismethodWasreliable．
Keywords：badger(Melesmeles)；faecalDNA；extraction；PCRamplification
收稿日期：2008．09．09收稿。2008·12—06接受
基金项目：国家自然科学基金(30570289)
作者简介：刘宇庆(1982—)．男，硕i：研究生。主要从事分子生态学研究。
’I通讯作者：魏万红，男，研究员，博导。E-mail：whwei@yzu．edu．ca
万方数据
6期 刘宇庆，等：狗獾粪便DNA提取方法的初步探讨
1引言(Introduction)
狗獾(Melesmeles)是广泛分布于中国除台湾和
海南省以外的其它各省的杂食性动物llJ，主要栖息于
森林、山坡灌丛、荒野及湖堤海岸等生境中。由于
狗獾为典型夜行性动物，因此在狗獾的分子遗传学、
种群生态学、行为生态学和系统地理与进化等研究
中，通过直接捕获动物获取用于遗传学研究的材料
极为困难。
近年来，在野生动物的保护遗传学研究中，不触
及，甚至完全不干扰目标动物，通过收集脱落的毛发、
粪便、尿液、角、鳞片、卵壳或动物标本的皮张等非
损伤性取样(NoninvasiveS锄pliIlg)得以广泛应用【2叫。
上述取样材料中，粪便样品不但量大且更易收集，其
所携带的遗传信息能够提供动物分子遗传学、种群生
态学和行为生态学等多方面的研究，是最具潜力的遗
传信息源【5】o20世纪90年代初，国外研究者就已经
开始探索从粪便中提取DNA[o’¨，90年代后期发展成
为一门以动物粪便为实验材料进行多领域研究的新
学科．分子粪便学【7J。当前分子粪便学已成为生态学
及相关学科的研究热点【3】，国内外许多学者在粪便
DNA中采用多种遗传标记，开展分子遗传学、种群
生态学、行为生态学、系统进化等多方面研列4，89】。
但由于动物粪便成分复杂，含有大量Taq酶抑制物，
因此通过动物粪便提取的DNA扩增效果并不理想。
有关从食肉动物14,7,10-12]弄[]食草动物[8,9,13-151粪便中提
取DNA已有成熟的技术和方法并用于相关领域的研
究，而对于从杂食性动物如狗獾等粪便中提取DNA
尚无明确的方法，这限制了分子粪便学的发展和应
用。本文依据现有的5种粪便DNA提取方法，从中
优化了狗獾粪便DNA提取的最佳方案，并通过对线
粒体控制区和微卫星位点的扩增结果证明了该方法
的可靠性，为狗獾等杂食性动物的分子生物学研究奠
定了基础。
2材料和方法(MaterialsandMethods)
2．1实验材料
本实验所用狗獾粪便样本均采自京杭运河扬州
段的堤坝。在采集新鲜粪便前，寻找狗獾排粪集中点，
用牙签对已排粪便进行标记。次日9：00前寻找新鲜粪
便并采集。采集到的粪便立刻以无水乙醇保存，乙醇
与粪便的体积比约为4：l，常温保存至实验开始。
1．2提取方法
采用预处理．酚／氯仿抽提’法【16J、NaC!改良法(国家
专利号：200410062721．1)、异硫氰酸胍裂解法【71、淀粉
吸附法及商业粪便DNA提取试剂盒法(QIAampDNA
StoolMiniKit,Qiagen)5种方法对狗獾新鲜粪便(动物
排泄后15h内收集)进行DNA提取，具体操作如下：
1．2．1淀粉吸附法
吸取约3mL无水乙醇浸泡的粪便至15mL离心
管内，3800rpm离心20min，弃上清，沉淀于55℃
烘箱烘干30min；然后加入3mL粪便消化液(0．2M
NaCl，0．1MTris-HCl，pH8．0，2．0％SDS，0．05M
ETDA)、40“IProK(50mg·mL。1)，摇匀后于55"C水浴
消化3．5,-4h，其间每小时摇匀一次；消化结束后以
3800rpm离心20min，吸取上清转移至装有3g淀粉
的15mL离心管内，震荡混匀静置10min；3800rpm
离心20min，上清转移至2mL离心管内，加入总体
积30％的十六烷基三甲基溴化铵)／NaCI，混匀，70℃
水浴15min；酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)重复抽提3次
后，于上清中加入lmLDNABindingBuffer(5M
GuSCN，O．1MTris—HCI，O．02MEDTA，pH6。41，颠
倒混匀后于4℃沉淀15rain；将上述溶液过UNIQ．10
柱(购自上海生物工程公司)后，加入washing
buffer(50％乙醇，0．1MNaCl，0．01MTris．HCI)，洗涤
2次(若洗涤液发黄则再洗一次)；空甩后加入80儿
ddH20于柱子上，室温静置10min，12000rpm离心
5min一次洗脱，然后加入60此二次洗脱DNA。电
泳检测后，。20℃保存。
2．2．2预处理一酚／氯仿抽提法
参照钟华等【16】的方法，最后加入80此ddH20溶
解DNA。
2．2．3NaCl改良法
参照NaCl改良方法(国家专利号：
200410062721．1)，最后加入80此ddH20溶解DNA。
2．2．4异硫氰酸胍裂解法
参照Reed等【7】的方法，最后用80此ddH20洗
脱DNA。 ．
2．2．5商业试剂盒法
采用QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒
(Germany,Qiagen公司)，具体操作步骤参见QIAamp
DNAStoolMiniK tHandbook，最后用80“LddH20
洗脱DNA。
万方数据
兰ZQ 生查型堂里￡212星!!垒!璺!i曼翌望 !!鲞
2．3PcR扩增
将提取的DNA为模板，以狗獾线粒体控制区基
因片段及微卫星位点进行扩增，检测提取的DNA质
量。狗獾线粒体控制区上游引物MelCRl(5-AGCA．
CCCAAAGCTGAlmT-3’)和下游引物MeICR6
(5’擘觚TGACTGAA丌GCACCT-3’)来自Marmi：：褫鬻黼嚣患亲l勰嗽“Q脚洲就；
等【l列；5对微卫星引物(Mell01；Mell05；Mell07；1．GuSCN．Si02method；2．indicatesDNAfromskinsamples；3．Mellll；施川7)均来自c叩enter等n引，上述引物均由掣嚣：。焉麓0i。裟篙；6黑l耋蒜。竺譬仁5’
上海生物工程公司(Sangon)合成。采用ABI．2700型
PCR仪对DNA进行扩增，采用25此反应体系：DNA图1狗Jn,gDNA的琼脂糖凝胶电泳图
模板1．5灿，lO×buffer2．5山25mm01．L～MgCl2黜sP笛kofth汕talDNAfrombadger’神pa瑚ted伽
1．2～2．0pL(因基因座而异)，lOmmol·L～dNTP0．5I．tL，
5pmol·pL-l两侧引物各l“L，5U．pL。1TaqDNA聚合功率如表l所示。除异硫氰酸胍裂解法外，其余4
酶0．2pL，用超纯水补足25¨L。线粒体控制区引物种方法提取DNA在琼脂糖凝胶电泳中检测的概率为
扩增的循环条件为：95"C预变性5min，95。C变性30S， 100％(图1)。但预处理一酚／氯仿抽提法和NaCI改良
50。C退火30S，72。C延伸50S，35个循环后于72"C延法都没有获得线粒体控制区和微卫星位点扩增结果。
伸7min；微卫星引物采用touchdown程序：95"C预变试剂盒方法全部获得线粒体控制区序列的PCR产
性5min，95"C变性30S，退火温度从64"C每隔一个循物，且线粒体控制区序列PCR扩增成功率均高于微
环降低2℃运行14个循环后，退火温度维持在48"C运卫星位点扩增成功率。淀粉吸附法在狗獾新鲜粪便
行30个循环后，于72。C延伸5min。所有PCR都设置DNA提取和扩增中的效果最为理想。
相对应的阴性对照。PCR产物经1．5％的琼脂糖EB凝
胶电泳检测。若检测到线粒体控制区基因片段的目的 3．2提取产物的PCR扩增
条带后，直接送上海生物工程公司测序。 使用淀粉吸附法、预处理．酚／氯仿抽提法、NaCl
改良法、异硫氰酸胍裂解法、试剂盒方法提取的DNA
3结果与分析(ResultsandAnalysis) 作为模板，扩增狗獾线粒体控制区和基冈组的微卫
星位点。淀粉吸附法、试剂盒方法分别得到500bp、
3．1DNA提取结果比较 220bp"-250bp的PCR产物(如图2，3)，异硫氰酸
采用5种方法提取DNA的结果及PCR扩增成胍裂解法仅在线粒体控制区序列得到了扩增产物，但
囊1提取狗獾新鲜粪便DNA的结果及其应用于PCR的扩增效率
Table1 TheresultsofextractionDNAfromfreshfaecesofbadgerandtheefficiencyofPCRamplification
注‘：提取的粪便DNA能否在琼脂糖电泳中被检测到：‘：WhetherthefaecalDNAcouldbeobservedinagarosegel．1：线粒体拧制区序列的扩增成功率；
Amplificationsucce豁rateofmitochondrialcon舡olsequence．2：微卫星位点的扩增成功率。AmplificationSUCCESSrateofmicrosatellitelocus
万方数据
6期 刘宇庆，等：狗獾粪便DNA提取方法的初步探讨471
扩增成功率不够理想(表1)。将线粒体控制区的PCR
产物直接送上海生物工程公司进行测序，测序峰图中
无基线过高、套峰、杂峰等异常情况出现。结果在
GeneBank中经Blast比对发现，与狗獾同源序列达到
99．3％，属于狗獾线粒体控制区序列，证明序列真实
可靠。微卫星位点的扩增片段大小，也在预期的估计
值范围内。
l～6为不同样本的线体控制区基因的PCR结果；M：DNA分子■标准；
N：阴性对照结果。l～6：PCRamplificationresultsofmtDNA-loopfrom
DNAofdiffe釉atsamples；M：DNAmarker；N：Negativecontr01．
田2淀粉吸附法的线体控制区基因的PCR结果
Fig2 PCRamplificationresultsfmtDNAD-loopfromthe
DNAextractedwithamylum-subsidingmethod
l～6为微卫星引物Mell01在不同样本上的PCR结果：M：DNA分子■标
准；N：阴性对照结果。l～6：PCRresultsamplifiedwithmicrmatellitcprinler
MellOIfromtheDNAofdifferentsamples；M：DNAmarker；,N：Negative
contr01．
圈3淀粉吸附法的徽卫■引钧Mel101的PCR结果
F姆．3PCRresultsamplifiedwithmicrosatelUteprim r
Mell01fromtheDNAextractedwithamylum-subsiding
method
4讨论(Discussion)
粪便材料是非损伤性取样的一个丰富和最有潜
力的资源。分子粪便学也被证实是获得研究物种DNA
的可靠途径【4’8’9】，但仍面临着粪便中DNA易受水解、
氧化和酶解影响等问题。粪便成分复杂，存在诸多的
Taq酶抑制物质，野外条件下存在的粪便易受外源
DNA的影响，并可能导致背景DNA的干扰，对下游
的PCR扩增片段大小存在一定的限制作用【5,19]，因
此，要从粪便材料中提取高质量的DNA用于实验研
究，不仅要求粪便材料的新鲜程度，而且需要有效的
保存、提取方法及PCR扩增方案。
4．1粪便材料的保存方法
粪便材料的保存直接关系到后续实验的成败。研
究者对新鲜粪便的界定没有统一标准，有学者将动物
排泄后18h内的粪便为新鲜粪便【I21，但也有学者认
为夏季48h内、冬季l～7d内均为新鲜粪便【l¨。鉴
于样品在接受保存处理时的新鲜程度及环境温度对
粪便DNA的质量存在很大影响(张保卫等，2004)，我
们选择3---4月和10一-．11月份，并在狗獾排泄15h
内收集其粪便，以尽量降低环境温度及粪便在空气中
暴露过久而导致的DNA降解现象。
目前粪便样品保存方法主要有：干燥保存【5刃】、
低温保存口21、DETs保存【191、硅胶保存【13】、无水乙醇
保存【4,12,14]等。在野外采取何种保存方法，应根据不
同物种及其所处的不同环境选择最适保存方法。无水
乙醇作为一种常用的固定剂，能迅速渗透组织细胞，
凝固蛋白质，使多种水解酶失活，且不损伤DNA，
从而达到保存DNA的目的123J。有研究表明，无水乙
醇保存的粪便样品具有DNA质量高、保存时间长等
优尉4,14,19】。而且乙醇属于实验室常规试剂，价格便
宜、毒副作用较小，便于在野外粪便采集中使用。因
此，我们采用无水乙醇保存粪便样品。本研究的DNA
抽提结果和PCR扩增效果都证实了该保存方法的可
靠性和高效性。
4．2D姒提取
在以PCR为基础的分子粪便学研究过程中，如
何获取高质量的DNA是关键，许多研究者在DNA
提取过程中通过纯化目的DNA和富集细胞等方法，
使提取的目的DNA质量有了很大提高。Reedt
aL(1997)将碱性多价金属离子螯合物树脂Chelex．100
应用于清除杂质，Ernest等【22J在粪便样品经过裂解液
处理、有机溶剂抽提后，DNA溶液经聚丙烯酰胺葡
聚糖柱子洗脱来纯化DNA，钟华等(2003)使用预冷丙
酮处理样品以去除抑制物。同时，粪便DNA不易扩
增并不完全与抑制物的干扰有关，也与模板DNA的
浓度有关115,24】。因此，有研究者通过采集富含黏膜的
表层粪便样品【12】、重复离心以富集脱落细胞【20】、多
管提取合并【14】等方法来增大提取产物的浓度。受代
万方数据
谢水平和食物组成影响，粪便DNA的提取效果在物
种间存在差异【¨筇】。本研究针对杂食性动物粪便
DNA提取及扩增效果不理想的特剧11】，采用多种途
径去除抑制物，在细胞裂解后使用淀粉沉淀、吸附部
分杂质(如胆红素、植物多糖等)后，再加入CTAB以
去除部分残存的植物多糖等杂质，最后使用UNIQ．10
柱去除模板DNA内残留的抑制物质。
4．3PCR扩增
尽管在粪便DNA的提取过程中采用多种方法去
除杂质，但仍会存在其它组分影响Taq酶活性，且粪
便DNA或多或少的存在一定的降解现象【l9|，因此，
PCR扩增仍存在较大难度。研究者通过模板DNA多
管收集合并【141、加入一定浓度的BSA【12】、使用高性
能Taq酶【4】和选用巢式PCR或降落PCR程序【loJ等方
法以提高扩增效率。本研究中除考虑到以上方法来改
善扩增效果外，还考虑到TE中含有的少量EDTA能
够螯合PCR反应体系中的镁离子，因此使用超纯水
洗脱DNA，同时为将抑制物降低到最低限度，采用
二次洗脱DNA作为模板。由于粪便DNA存在一定
的降解，因此在微卫星位点的扩增中，尽量选取扩增
片段小于300bp的位点以期提高扩增效率。我们的
结果也显示，尽管线粒体DNA控制区序列远大于所
选择的微卫星位点扩增片段，但线粒体控制区序列的
扩增效率明显高于微卫星位点(表1)。可能由于在粪
便DNA中，线粒体DNA的拷贝数远高于核DNA，
且线粒体DNA属于闭合双链DNA不易被降解，因
而相对微卫星位点则更易扩增。
狗獾为杂食性动物，因此在获得的粪便DNA中，
不仅有来自狗獾肠道细胞DNA、消化道内寄生生物
的DNA(细菌、病毒、寄生虫)，还存在被捕食者的
DNA。有研究报道，粪便DNA中的寄生生物的DNA
不会对试验结果产生影响，从粪便DNA中去除寄生
生物的DNA并非必须步骤[20】。因此，在本研究中
未设置去除寄生生物DNA的步骤。关于被捕食者
DNA的影响，我们一方面对样品采集区域狗獾的食
性进行了研究分析，在该区域内的狗獾食物谱内未发
现有其亲缘较近的黄鼬(Musteliasibirica)等动物。同
时作者针对黄鼬mtDNAD．100p设计引物，以我们提
取的DNA为模板进行扩增，未得到有效扩增。另一
方面，我们选择的线粒体DNA控制区序列和微卫星
位点的引物均来自该物种的相应引物，属于物种特异
性的引物，因此PCR扩增结果具有较高的专一性和
辨别率。同时，为防止外源DNA污染，在DNA提
取及PCR扩增过程中，所有步骤均设置了阴性对照。
致谢(Acknowlegment)
在实验过程中得到中国科学院动物研究所李明
研究员、刘志瑾博士、郭俣博士等的帮助，陈忠、
朱峰同学在野外样品采集中给予大力支持，在此一
并致谢。
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《生态科学》投稿基本要求
1．研究报告应论点鲜明，数据可靠，结论明确，文字简练，选题新颖。具有开拓性或创新性。评论和综
述性论文应综合国内外有关重要资料，论述系统、扼要，富有启迪性；
2．论文写作规范，无政治思想错误，无国界、国名等错误，不涉及保密问题，无抄袭或一稿多投问题；
3．投稿时请注明“中图分类号”，参见《中国图书馆图书分类法》(第3版)；
4．若文章得到省、部级以上基金资助，应给出基金的全称及批准号；
5．本刊接受Email投稿。稿件须为nf或doe格式的电子文件；
6．为提高稿件的刊登速度，请作者在投稿时提供联系人的电话；
7．论文一旦被我刊接受，本刊发表论文一般按规定标准收取版面费，版面费必须在送校样时按本刊收取
版面费通知如数交纳。
万方数据
狗獾粪便DNA提取方法的初步探讨
作者： 刘宇庆， 吕慎金， 殷宝法， 范红梅， 刘燕， 魏万红， LIU Yu-qing， LV Shen-jin，
YIN Bao-fa， FAN Hong-mei， LIU Yan， WEI Wan-hong
作者单位： 刘宇庆,LIU Yu-qing(扬州大学生物科学与技术学院,扬州,225009;扬州市邗江区农林局,扬
州,225002)， 吕慎金,LV Shen-jin(临沂师范学院农林学院,临沂,276000)， 殷宝法,范红
梅,魏万红,YIN Bao-fa,FAN Hong-mei,WEI Wan-hong(扬州大学生物科学与技术学院,扬州
,225009)， 刘燕,LIU Yan(扬州市邗江区农林局,扬州,225002)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2008,27(6)
被引用次数： 1次

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引证文献(1条)
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