全 文 ：生态科学2006年4月第25卷第4期 ECOLoGICSCIENCEApr．，2006，25(2)：158～161
黑麂粪便DNA提取及其PCR检测
程宏毅，鲍毅新+，郑荣泉，陈 良，葛宝明(浙江师范大学生态研究所，金华32l004)
【摘要】 采集了黑麂(^缸以f胁c姗c，加{『如门J)的新鲜粪便以及在野外自然条件下保存较长时间的粪便样品，晾干后带
回实验室，提取其DNA；同时提取黑麂肌肉、皮张样品的DNA，用以对比粪便样品的提取效果。电泳检测结果显
示，此方法使用实验室中常用的分子生物学试剂，可以从黑麂粪便样品中抽提到高质量的粪便DNA并克服分子粪便
学研究中常见的PcR反应抑制物的影响。为其它濒危鹿科动物的非损伤性取样提供了的新途径，为其遗传结构、遗
传多样性现状等研究提供了更加广阔的取材空间。
关键词：黑麂：粪便聊、『A；DNA抽提；PCR检测；非损伤性取样
中图分类号：Q953：Q959．843 文献标识码：A 文章编号：1008．8873(2006)02．158．04
BlackMunqacF ∞alDNAE咿acH0nTechniqp髂inPcRReacuon ．
CHENGHong—yj，BA0Yi—xin’，zHENGRong·qu卸，CHENLi舳g，GEBao—ming(InsituteofEcology，ZhejiangNorrnal
UniverSi吼Jinhua32l004，China)
AbstractThefkshfaecal蚴ddatedfaecalofbIackmuntiac(朋hnf砌cl蜉crm枷，坫)、^，erecollect d，andtlleirDNAwere
extracted．Forcomparingmeextractionefficiencyt11emuscltissue锄dskinssamplesofblackmuntiacwereextracted．The
elec仃ophoresisresultsshowedt11atmismetllodcanemcientlyextractfaecalDNAf．romblackmuntjac’sfaecalsamples．111is
methodovercamepreViousba玎ierstomolecularsc tology’new印proachisdevelopedfornoninVasivesampingofblack
mu叫acndchinesesiI(adeer．N0ninVasivesa瑚【pingc锄 xpaIldthextensionofsamplingforgeneticpopulationst八lctllre锄d
geneticd Versityofhighlyendanger℃dcP九，碰
Keywords：Blackmuntiac，FaecalDNA。DNAextraction，PCR，NoninvasivesaIllping
黑麂(朋砌觚砌枷凇)是我国的I级重点保护
动物。在黑麂的遗传多样性、进化和分类、种群数量调
查、性别鉴定、亲子鉴定等研究中，DNA分析是重要
的研究手段。对于珍稀的濒危动物黑麂而言，传统的损
伤性取样会对该物种造成极大的伤害。黑麂栖息于高山
密林中，非常警觉，普通的非损伤性取样，如采集血液、
少量活体组织等也十分困难。因此，寻找简便安全的
DNA提取途径对黑麂的遗传结构进行分析显得极为重
要。与其他材料相比，粪便样品更易收集。
在20世纪90年代初，国外研究者就已经开始探索
从粪便样品中提取Ⅸ呵A，并且也取得了良好的结果【l捌。
近年来国内外许多学者采用了从粪便中提取Ⅸ、jA的
方法，通过对粪便DNA中多种遗传标记的识别，进
行了动物分子遗传学、种群生态学和行为生态学等多
方面的研究13‘141。本研究对黑麂皮张、新鲜粪便以及
在野外自然条件下保存较长时间的粪便样品的DNA
进行了提取，PCR扩增情况良好，可用于进一步的遗
传学检测。
化古田山自然保护区和龙泉风阳山自然保护区采集到
黑麂肌肉、皮张和粪便样品13份(表1)。其中，肌肉
组织样品取自武义林业公安查获的偷猎黑麂，皮张样
品取自九龙山自然保护标本室。
1．2试剂
蛋白酶K和DTT产自Am托sco公司，死wDNA聚合
酶、dNTP、牛血清白蛋白(BSA)和DNAM冰er购自
TaKaRa公司，引物由上海生工生物公司合成。
1．3方法
1．3．1肌肉、皮张样品的保存从收缴的黑麂尸体和标
本上采集肌肉和皮张，保存于培0℃超低温冰箱中。
王．3．2粪便样品的保存将采集到的陈旧粪便(在野外条
件下保存时间超过3d)样品晾干，然后置于．80℃超低温
冰箱中保存，新鲜粪便直接冻存于．80℃超低温冰箱中。
1．3．3DNA提取
1．3．3．1粪便样品DNA的提取
(1)取2．5g粪便样品放入50111L离心管中，加入40
mLllNE缓冲液浸泡24h。
1絮．，方法 。收稿日i忑二，2洲3_2。接受
1．1材料 圣銮磊百：苗篆舀；函莩荽囊銎萎画；；；爵0370219)
样品分别自浙江的金华武义牛头山自然保护区、 作者简介：舅淼嚣未4荔：。挈金华人’从事动物生态学
遂昌九龙山自然保护区、松阳箬寮砚自然保护区、开 确讯作者：s聊Io@zj肌．耐u舶
万方数据
万方数据
生态科学 25卷
图l 13个黑麂组织和粪便样品抽提到的模板DNA电泳检测图
Fig．1TheagamseeI∞trophoresispa仕ernoftissueandfecal
DNAofthineenbIackmuntjacs mples
M为DL2000DNAMal‘er，N为阴性对照，l为陈旧粪便样品模板，
2为肌肉组织样品模板，3、4为皮张样品模板，5～10为新鲜粪便样品模
板，1l～13为陈旧粪便样品模板。
M：DL2000DNAMal【er．N；NcgatiVecon仃D1．1：DatcdR圮alDNAofblack
mIlIlUac．2：muscletissucDNAofblackmllllOac．3，4：sk．nDNAofbIack
muntja．5～10：雠shfecalDNAofblackmllllOac．11～13：datedfccalDNAof
blackmun日ac．
图2 13个黑麂组织和粪便样品线粒体控制区基因PcR扩增
产物电泳结果图
Fi2．2EmcientampUncationofmi札吣hondriaIDNAconh．oI
ngiongeneofti鹳ueandf＆alsampl雠ofthirteenblackmuntjac
M为DL2000DNAM酞cr，N为阴性对照。l为肌肉组织样品，2、3
为皮张样品，4～9为新鲜粪便样品。lO～13为陈旧粪便样品。
M：DL2000DNAMal(盯．N：NegatiVeconnDl．1：muScletissueDNAof
bl∞kmunqac．2，3：skinDNAofblackmuntja．4~9：肌sh&alDNAofblack
mun日ac．10~13：datcd惫calDN^ofb ackmun日ac．
图3黑麂肌肉组织样品线粒体控制区基因PcR扩增产物(1)
和13个黑麂组织和粪便样品细胞色素6基因PcR扩增产物
(2～14)电泳结果图
Fi2．3Emcientamplincationofm tochondrialDNAcontrol
regiongeneofmuscIetissuesampleofbIackmuntjac(1)and
mitochondr萱alDNAcytochl柚meb酩neoftissueandfecal
samplesofthineenblackmuntjac(2～14)
M为DL2000DNAMal(er，N为阴性对照，l为肌肉组织样品，2为肌
肉组织样品，3、4为皮张样品，5～lO为新鲜粪便样品，ll～14为陈旧粪
便样品。
M：DL2000DNAMal(er．N：NegatiVecon仃01．1：muscleti sueDNAof
blackm岫q∞．2lmuscletissueDNAofblackmullqac．3t4：skinDNAof
blackm叫廿a．5～10：肌shfccalDNAofblackmuIl廿∞．1l～14：daled觑al
DNAofbl∞kmllIlqac．
测序结果为366bp，与预期结果相符(见图3)。
3讨论
本实验表明，用此方法可以从新鲜的黑麂粪便，
甚至陈旧的粪便中提取黑麂的DNA，其质量虽没有从
肌肉组织和皮张中提取的DNA好，但是已经可以基本
满足对黑麂遗传的遗传结构的分析的要求，可用于进
一步的遗传学检测。
目前分子粪便学在方法上已逐渐成熟，也已被广
泛应用，但是它也有其局限性：(1)粪便中脱落的肠
道细胞数量较少，动物每次排出的粪便中所带的脱落
肠道细胞数量也很不平均。从本次实验的结果也可以
看出，不同粪便样品中所提取的DNA质量存在明显的
差异，有些粪便中提取的DNA其PCR扩增产物质量较
好，可能与这个粪便样品中所含的肠道脱落细胞数量
较多有关。 (2)粪便中的遗传物质存在一定的降解。
特别是在野外条件下长时间保存的粪便，其遗传物质
降解的速度非常快，结果显示，从陈旧粪便中提取的
DNA模板及其扩增产物质量总体上要差于新鲜粪便。
由于本身粪便样品中所含的遗传物质较少，且又存在
降解作用，一些粪便样品，尤其是陈旧粪便样品，无
法提取出足够量的可供分析的目的物种的DNA或者
无法得到PCR扩增产物。Taberlet等【l5】在进行棕熊的粪
便DNA提取过程中，发现仅有20％的粪便样品可以抽
提出足够量的DNA用于微卫星位点分析；Gerlof：f等【16】
用野生猩猩的粪便进行父权鉴定及亲缘关系的分析时
也发现，在123个粪便DNA提取物中，第一次扩增只
有约2／3的样品能够扩增出PCR产物，一些样品只有在
进行第二次DNA提取后才会出现PCR产物，且在反复
实验时发现有部分等位基因丢失。本实验中也遇到这
类情况，模板DNA进行电泳检测时可发现明显的DNA
条带，但是进行PCR扩增时却未得到扩增产物。进行
第二次抽提后，可以扩增出PCR产物，但是条带十分
微弱，扩增产物质量较低。(3)粪便中存在砌DNA
聚合酶活性抑制剂。在粪便样品中除了消肠道脱落细
胞外，还存在未消化的食物，消化液等组分，这些组
分可能会影响Taq酶活性【l”。通过加入牛血清白蛋白
(BSA)、纤维素等可以有效地去除抑制剂的阻断作
用，提高PCR扩增效果【18，l91。本实验加入了BsA，从
实验结果看效果较好。 (4)野外条件下存在的粪便，
不可避免的受到外源遗传物质的影响。粪便暴露在野
外环境中，会受到细菌、霉菌等微生物的影响，粪便
本身也包含所被取食的动植物的基因。在粪便饼蛆的
提取以及PCR扩增过程中，外源遗传物质的污染是影
万方数据
万方数据
黑麂粪便DNA提取及其PCR检测
作者： 程宏毅， 鲍毅新， 郑荣泉， 陈良， 葛宝明， CHENG Hong-yi， BAO Yi-xin， ZHENG
Rong-quan， CHEN Liang， GE Bao-ming
作者单位： 浙江师范大学生态研究所,金华,321004
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2006,25(2)
被引用次数： 11次

参考文献(19条)
1.Kohn M;Knauer F;Stoffella A Conservation genetics of the European brown bear a study using
excremental PCR of nuclear and mitochondria sequences[外文期刊] 1995
2.Carss D N;Parkinson S G Errors associated with otter (Lutra lutra) fecal analysis.1.Assessing
general diet from spraints 1996
3.Gerloff U;Hartung B;Fruth B Intracommunity relationships,dispersal pattern and paternity success
in a living community of bonobos (Pan paniscus) determined from DNA analysis of faecal samples[外文
期刊] 1999(1424)
4.Wasser S K;Houston C S;Koehler G M Techniques for application of faecal DNA methods to field
studies of Ursids[外文期刊] 1997
5.Maria G P;Paolo V An improved PCR-based method for detection and differentiation of Entamoeba
histolytica and Entamoeba dispar in formalin-fixed stools[外文期刊] 2004(03)
6.张保卫;魏辅文;李明 大熊猫和小熊猫粪便DNA提取的简易方法[期刊论文]-动物学报 2004(03)
7.钟华;赖旭龙;魏荣平 一种从大熊猫粪便中提取DNA的改进方法[期刊论文]-动物学报 2003(05)
8.Mehreen Z;Jaco J V;Clark C G Entamoeba histolytica:direct PCR-based typing of strains using faecal
DNA[外文期刊] 2003(01)
9.Ernest H B;Penedo M C T;May B P Molecular tracking of mountain lions in the Yosemite Valley region
in California:genetic analysis using microsatellites and faecal DNA[外文期刊] 2000(4)
10.方盛国;丁朝武;冯文和 大熊猫DNA指纹分析材料的初步研究 1996(03)
11.方盛国;冯文和;张安居 佛坪三官庙地区大熊猫种群数量的DNA指纹分析[期刊论文]-应用与环境生物学报
1996(03)
12.Kohn M H;York E C;Karmradt D A Estimating population size by genotyping faeces[外文期刊]
1999(1420)
13.Reed J Z;Tollit D J;Thompson P M Molecular scatology:the use of molecular genetic analysis to
assign species,sex and individual identity to seal faeces[外文期刊] 1997
14.Taberlet P;Camarra J J;Griffin S Noninvasive genetic tracking of the endangered Pyrenean brown
bear population[外文期刊] 1997
15.Mandy E;Christina S;Helmut H Isolation and molecular characterisation of equine rotaviruses from
Germany[外文期刊] 2005(02)
16.Schouten J M E;Graat A M;Frankena K A longitudinal study of Escherichia coli O157 in cattle of a
Dutch dairy farm and in the farm environment[外文期刊] 2005(3/4)
17.Geoffrey N G;Mitta C;Mary D Copro-PCR based detection of Schistosoma eggs using mitochondrial DNA
markers[外文期刊] 2005(04)
18.Peter K;Christop H R D;Markus R Prevalence and risk-factor analysis of Shiga toxigenic
Escherichia coli in faecal samples of organically and conventionally farmed dairy cattle[外文期刊]
2005(1/2)
19.Casulli M T;Manfredi G;La Rosa A R Echinococcus multilocularis in red foxes (Vulpes vulpes) of
the Italian Alpine region:is there a focus of autochthonous transmission[外文期刊] 2005(10)

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nian.ZHANG Yue.LIU Ning-sheng.LU Xiao-xuan.NIE Wen-hui.WANG Jin-huan.CHEN Yu-ze.YANG Feng-tang.HU
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