全 文 ：第27卷第6期
2008年12月
生态科学
EcologicalScience
27(6)：457-462
Dec．2008
海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离
张文1，江天久1扩，王锐1
1．暨南大学环境工程系，广州510632
2．暨南大学赤潮与水环境研究中心，广州510632
【摘要】 海洋卡盾藻(Chattonellamarina)是我国南方沿海主要的鱼毒性赤潮生物，近年来由该藻形成的赤成已造成多起
近岸养殖鱼类大量死亡的事件。为了弄清该藻毒素的基本成分特征， 本文研究了室内培养条件下海洋卡盾藻(香港株)溶
血毒素的提取方法，观察了溶血毒素对红细胞的溶血过程，采用薄层色谱法对溶血成分进行了初步分析。结果表明：海
洋卡盾藻藻细胞的超声波破碎最适条件为功率400W，4"12下处理15min；通过显微镜观察，证实提取的毒素对血红细胞
膜具破坏作用：海洋卡盾藻合成的溶血毒素至少含有4种组分，其中1种可能为为脂类，3种为糖脂类。该研究成果有助
于我国今后进一步开展鱼毒性赤潮生物毒素的研究。
关键词：海洋卡盾藻；溶血毒素；毒素提取物
中图分类号：0949．206 文献标识码：A 文章编号：1008．8873(2008)06-457．06
ThextractionandseparationofhemolytictoxinfromChattonellamarina
HongKongstrain
ZHANGWenl。JIANGTian-jiuu，WANGRuil
J，．EnvironmentEngineeringdepartment,Jinanuniversity,Guangzhou510632,China；
2．ResearcherCenterofHABsandWaterEnvironmentalScience,Guangzhou510632,China
Abstract：BloomingofChattonellamarinahascausedmassivefishkillsandconsiderableeconomiclossinrecentyearsalong
the∞uthemcoastofChina．Howeverdetailedtoxicmechanismsinvolvedinthesefishkillsstillremainuncertain．Hemolytic
toxinsproducedbyC．marinahasbeensuggestedtob themajorcausativefactorsfortheobservedfishkills．Theextractionof
hemolytictoxinsfromChattonellamarinaHungKongs妇in(CMHK)Wasinvestigatedinlaboratorialconditions．Thehaemolytic
processofthextractionfr mCMHKtoredcellswasobservedwithmicroscope．HemolytictoxinswereseparatedwithTLC．
TheresultsshowedthatoptimalconditionforbreakingthecellwallsofalgaebyultrasonicWas400Wofpowerfor15minutesat
4℃。andthehemolytictoxinssynthesizedbyCMHKcouldconsistofa least4components，whkhincludedonelipidandthree
glucolipidfractions．Thehemolysintoxinscouldbreaktheredbloodcellsofrabbits(RBCs)throughitshydrophobegroup
linkingtothesurfaceofRBCs．ThesefmdingswillbeofgreatsignificanceforthefuturestudiesOilthetoxicmechanisms．
Keywords：Chattonellamarina：hemolytict xin：hemolyticextraction
收稿日期：2008．10-08收稿．2008．12．20接受
基金项目：国家自然科学基金一广东联合基金(U073306)，国家重点基础研究发展规划(200lCB409709)
作者简介：张文(1982一)．男，硕士，研究方向为生态毒理学。E-mail：wcn2001810@tom．com
·通讯作者：E-maii：tjiangtj@jnu．cdu．cn
万方数据
1前言(Introduction)
海洋卡盾藻赤潮己在世界范围的沿岸水域导致
了养殖鱼类的大量死亡。近年来，我国沿海海洋卡盾
藻赤潮的发生频率逐渐增加，范围不断扩大，危害日
益严重11’引。2003年7月初至8月中旬，我国南海大
亚湾东升网箱养殖海域发生了由该藻引发的赤潮，面
积约15km2，使该湾网箱养殖的红鳍笛鲷(Lutianus
ergthropterus)、黄鱼立鲳(Stromateoidessp．)和包公鱼
“ristichthysnobilis)大量死亡，直接经济损失约33万
元【31。Imai、Kuroda等人对海洋卡盾藻细胞分泌的有
毒化合物中分析证实该藻可产生的溶血性毒素
(hemolytictoxin)是导致鱼类死亡的主要原因之一h引。
目前，国外对海洋卡盾藻的研究较多，但是由于藻类
毒性机制复杂，海洋卡盾藻的致毒机制仍存在诸多争
议。而实验室条件下的海洋卡盾藻的产毒特征以及不
同生长时期的毒素生成规律均未见报道。本实验采用
薄层层析的方法对海洋卡盾藻溶血成分进行了初步
的分离分析，为进一步研究溶血性毒素的生成机制提
供参考依据。
2材料和方法(MaterialandMethods)
2．1材料
海洋卡盾藻香港株(ChattonellamarinHong
Kong，CMHK)由香港渔农护理署提供，2002年从香
港近岸水体中采集并在室内单种培养至今。兔血取自
广州暨南大学动物实验室。
2．2仪器和试剂
LRH．250．GS型光照气候箱(广东省医疗器械
厂)，721分光光度计(上海第三分析仪器厂)，
RE52CS旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，XSZ．D2
OLYMPUS／CX31显微镜f上海精密仪器仪表有限公
司)，SW-CJ一1BU型超净工作台(苏州净化设备有限公
司)，GF254硅胶板(青岛高能达化工有限公司)，
JY92．II型超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股
份有限公司)， 95％四．甲氧基苯甲醛(上海试剂一
厂)。其他试剂均为国产分析纯。
2．3慕种培养
采用盐度为33的人工海水，以舵培养液配方。
取对数生长末期的Chattonellamarina(CMHK)(藻
种名很少有缩写，全文中加以更正)，用浮游植物计数
框(容积0．1mL)计数并计算其细胞浓度后以l：4
的比例接种在2L锥形瓶中，置于人工气候箱中培养
18d，培养温度22℃，光照强度为60嵋·m-2．S以)，光
暗循环为12：12。每天固定时间(10：30am)取样于显
微镜下计数，每组3个平行样，计数值间相差应小于
15％，取两个相近数据平均值为实验结果绘制海洋卡
盾藻生长曲线，根据生长曲线，分别取对数期、稳定
期和衰亡期进行毒素的分离和溶血毒素的测定。
2．4溶血毒素的提取
取对数期、稳定期及衰亡期的藻细胞培养液
3000mL，经2000g离心10min，收集藻细胞在冰浴
条件下进行超声波破碎处理。分别用200W、400W、
600W和800W超声波破碎20min，每5min取样于
显微镜下观察藻细胞是否完全破碎，计数确定其最佳
破碎功率和最佳破碎时间，以上实验每组三个平行。
参照Kuroda等15,6,8J研究者对该藻毒素提取方法。
根据上述优化的Chattonellamarina藻细胞破碎条
件，取对数生长末期(13d左右)的藻液(大约3～
4x10cells·mLu)3000 ，经2000g离心10min后
收集藻细胞，用甲醇(甲醇用量为藻液体积的l／1000)
重新悬浮藻细胞，超声波细胞破碎，离心收集上清液。
将上清液通过循环水式多用途真空泵和旋转蒸发仪
真空干燥后溶解于适量的甲醇中(甲醇用量为藻液的
1／1000)，即得甲醇提取的粗溶血毒素溶液，．18℃
下贮存备用。
2．5溶血毒素的溶血性观察
从兔心脏取10灿新鲜血液，滴于干净无油脂的
载玻片上，轻轻推成血膜自然干燥。血膜制成后，在
血膜的中央加一滴含有毒素的甲醇溶液，将其平推，
干燥后以姬姆萨(Gimas)染色剂染色，自然晾干。将
载 样品的玻片置于相差显微镜下，用100倍目镜观
察，Sony数码相机拍照。
2．6溶血毒素的薄层分离与分析
参照Kuroda和彭喜春【5~8】等研究者采用的兔血
红细胞一硅胶板层析技术，用极性不同的两种展开剂
体系进行展开。载体为硅胶板GF2”毒素用溶剂系
统I(氯仿：甲醇：水=75：25：4)和溶剂系统II(氯
仿：甲醇=9：1)在薄层板上展开后晾干，喷涂5％兔血
万方数据
6期 张文，等：洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离459
红细胞溶液，选择展开性较好的溶剂系统；用较好的
溶剂系统重新展开后。第一板喷涂5％红细胞溶液
为A板，用以获取Chattonellamarina溶血组分的
Rf；第二板喷涂罗丹明B溶液，待其稍干后再喷涂
lmol·L’1的KOH，在紫外灯下显色为B板，用以获
取粗提取液中的糖类组分；第三板喷涂4．甲氧基苯甲
醛溶液，稍干后置于烘箱中100℃烘烤2min为C
板，用以获取提取液中的脂类组分。
3结果与分析(Resultsandanalysis)
3．1海洋卡盾藻的生长曲线
由图l可以看出，Chattonellamarina在经历了
3--4d的延滞期之后，细胞开始快速分裂，细胞的数
目呈对数增加，5～13d进入对数生长期，13～15d为
稳定期，第15d后藻细胞进入衰亡期。
圈1海洋卡盾藻的生长曲线
Fig．1GrowthcurveofChattonellamannaHK
3．2海洋卡盾藻香港株藻细胞破碎条件的优化
对数生长末期Chattonellamarina藻细胞在不同
功率下超声波处理20min后的破碎率存在差异。经
200W超声波处理后破碎率只有48％，而400、600
和800W处理的破碎率可达90％～95％，变化不明显。
考虑到超声波设备的使用寿命及破碎时产生的高温
可能对溶血毒素活性的负面影响，因而本实验选择
400W超声波对细胞进行破碎处理。
藻细胞的破碎率与藻类的生长阶段有关。不同
生长时期Chattonellamarina藻细胞破碎的情况如图
2所示。处理开始的0--5min内，只有少数细胞被破
碎，大部分的细胞在5～15min内被破碎；15～20min
也只有少数细胞被破碎。对数期藻细胞经过20min
超声波处理，细胞破碎率达到99％，显微镜下观察，
几乎无完整的藻细胞存在；稳定期藻细胞破碎率为
95％；衰亡期只有86％。
超声波处卿寸间e绔)timeofdtm∞nietr ntraent(min)
圈2海洋卡后藻香港株藻细胞超声波破碎率
Fig．2BreakingratesofCMHKcellsbyultrasonictreatment
从实验结果可以看出，Chattonellamarina藻细
胞进行超声波破碎处理时，藻细胞破碎率与超声波的
功率和处理时间有关。低频、短时条件下该藻细胞的
破碎率随功率的增大而增加；而高频、长时处理条件
下，该藻细胞的破碎率则变化不明显，均只有弱微的
增加。造成这些差别的主要原因可能在于海洋卡盾藻
是单细胞，且细胞无细胞壁，周围溶液的渗透压稍有
变化，其细胞立即崩解。故其藻细胞的破碎条件相对
宽松，其超声波破碎最适条件为：功率400W，4"C
下处理15rain。
3．3溶血毒素的涪血性观察
图3(a)图是正常的以姬姆萨(Gimas)染色剂染
色后的兔血红细胞图，图(b)、(c)和(d)依次是涂上藻
毒素后随时间推移的血红细胞图。
从图3中可以观察到，正常的红细胞多数都完好
无损，细胞稠密见图(a)：而涂上藻毒素后红细胞数
量逐渐稀疏，随时间推移处理后的红细胞几乎都被破
坏，藻毒素的溶血效果非常显著见图(d)。图(b)和(c)
伽
∞
∞
伯
∞
∞
如
∞
如
m
o
v瓣话髻翟m磷
万方数据
圈3显徽镶下毒素处理后的红细胞溶血圈
Fig．3ImagesofbreakingredbloodcelltreatedbyhaemolysinInmicroscope．
显示不同溶血时期血红细胞的破坏情况。由以上实验
结果推测该毒素的溶血机制可能是毒素疏水基团直
接作用细胞膜表面的膜脂(细胞膜表面的外延)产生
脂溶效应，使细胞膜破坏，随之细胞质外渗，最后导
致整个细胞全部被破坏。
3．4溶血毒素成分的初步分离和分析
以溶剂系统(I)展开后喷上5％兔血红细胞溶液，
观察发现硅胶板上有2个明显的溶血白斑，Rf=0．86
和Rf=0．07。在R户O．48和Rf=0．08处有2个不明显的
溶血白斑，据此可以初步推断，海洋卡盾藻产生的溶
血毒素至少含有4种组分(图4a)。以溶剂系统(II)
展开，可看到有4个溶血白斑，但是其Rf值略有不
同，分别为Rr=0．89，0．44，0．09，0．04(图4b)。由实
验结果可知，溶剂系统(1I)比溶剂系统(I)的展开性较
好，故而后期实验选用溶剂系统为展开剂。
为进一步了解海洋卡盾藻溶血毒素4种组分的构
成成份，以溶剂系统(II)为展开剂展开后晾干，依次喷
上罗丹明B溶液、lmol·Lq的KOH溶液后，240nm
紫外灯下观察发现，硅胶板上共有12个白斑，表明
该粗提物中的糖类成分至少有12种，其中与图4b
中溶血白斑相对应的地方有相应荧光出现的位置，其
Rf值分别为0．88，0．48和0．09(图5)。由实验结果可
知，该溶血毒素的组分可能含有3种糖类物质。
万方数据
6期 张文，等：洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离 46l
(a)
(a)溶剂系统I(氯仿：甲醇：水=75：25：4)
(a)Solution：chloroform／methyl／water=75／25／4；
(b)
(b)溶剂系统II(氯仿：甲醇----9：1)
(b)Solution：chloroform／methyl--9／1．
圈4展开的毒素喷上504的血红细胞溶液
Fig．4Developedhemolysiscoloredwithredbloodcellsinthinlayerchromatogram．．
圈s糖类物质在喷上罗丹明B溶液
和KOH溶液后的紫外荧光显色
Fig．5DevelopedCarbohydratefractionsnTLC
圈6脂类物质在喷上4--甲氧基笨甲醛
溶液后的显色
Fig．6DevelopedlipifractionsnTLC
同时以溶剂系统(II)为展开剂展开，喷上4一甲氧
基苯甲醛溶液显色，发现在硅胶板上共有5个白斑，
表明该粗提物中至少含有5种脂类成分，其中与图4
(b)中溶血白斑相对应的地方有相应荧光出现的位
万方数据
462 生态科学EcologicalScience 27卷
置，其R艟分别为0．86，O．45，0．1l和O．04(图6)，由实13l 张玉宇．2005．南海大亚湾澳头水域浮游植物与赤潮的
验结果可知，该溶血毒素的组分可能含有4种脂类物 生态学研究[D】．广州：暨南大学，50-51．
质。 141 ImaiI，ltakutaS，AndoM，lshidaY．1995．Vtralinfection
．如图4b，5jgl6所示，4个溶血白斑与3个糖斑点及 in Chattonellamarina(Raphidophyceae)：aossible
4个脂斑点的位置均很相近，表明该溶血毒素的组分tarminationmechanismofthenoxiousredtides[A]．In
兼有糖类和脂类两者的特征，可能均为糖脂类物质。HarmfulMarineAlgalB ooms(eds．P．Lassus，G．Arzul，E．
Kuroda等【5J对实验室条件下培养的海洋卡盾藻 Erard，EGentien，C．Marcaillou)[C]．Andovex：Technique
日本株溶血毒素的研究表明，该株海洋卡盾藻含有溶 etDocumentation～Lavoisier,InterceptLtd．，639—644．
血毒素，其组分至少有4种组分，其中2个毒性最强的 ISl KurodaA，NakashimaLYamaguchiKeta1．2005．
位置Rr--0．79和0．35，还有两个位置R尸0．98和0．08。这Isolationandcharacterizationof light--dependent
与本次实验所检测到的结果并不完全相同。究其原hemolyticcy otoxinfromharmfulredtidephytoplankton
因，很可能是藻株问差异所致，同种藻类的不同藻株 Chattonellamarina[J]．ComparativeBiochem括tryand
或不同生长环境时其生长特性、毒素的成分及含量不Physiology，297—305．
一定相同。本实验结果支持上述结论。 16l何家菀，陈明惠，何振荣．1996．小定鞭藻毒素的分离
和鉴定[J】．水生生物学报，20(1)-4l-48．
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褐胞藻赤潮及其成因【J】．海洋与湖沼，25(2)：132．13．
落实科学发展观，建设生态文明广东
——记广东省生态学会。七大一暨建设生态文明报告会
“落实科学发展观，建设生态文明广东”，这是广东省人大常委会副主任陈,J,JII在出席2008年12月5日在广州召开的广东
省生态学会“七大”暨建设生态文明报告会时的题词。陈d,)ll说，广东省生态学会成立已有28年，学会对建设生态文明广东做
出了突出成绩。希望生态科技工作者继续努力，为和谐社会的建设多做贡献。并祝大会圆满成功。中国科学院院士孙儒泳、广
东省政协常委徐颂军、中国生态学会副理事长骆世明、广东省科协副秘书长钱春等出席了大会并讲话。会议气氛热烈。
广东省生态学会理事长彭少麟代表第六届理事会向大会作了《建设生态文明，创新学会生态》的工作报告。经过代表们的
审议，一致通过了彭少麟作的《工作报告》、副秘书长周长久作的《修改章程报告》和《章程》、副秘书长薛加林宣读的《审计
报告》以及学会名誉理事长、顾问的名单。
大会经过民主选举，产生了有81人组成的广东省生态学会第七届理事会。彭少麟连任理事长，万洪富、骆世明、徐颂军、
张方秋、段舜山、周国逸、张润杰、俞展新、梁健开、吕健等lO人为副理事长，周长久为秘书长。
在这次大会上，彭少麟还作了《建设生态文明，创新生态环境》的学术报告；骆世明作了《生态立法与生态农业》的学术
报告：段舜山作了《淡水生态环境保护的迫切性》的学术报告。上述报告指出：当今的时代是生态时代。“和谐社会构建日，生
态立法正是时。”报告所指出的各种生态课题，需要生态科技工作者去研究、去探索、去创新、去建设、去发展。
本次大会由六届理事会副理事长兼秘书长张社尧和副理事长张润杰主持。有118名代表出席了大会。与会者普遍反映：这
是～次内容丰富、团结奋进、生动活泼的大会，大会收到了预期的效果。
广东省生态学会秘书处
2008年12月6日
万方数据
海洋卡盾藻(香港株)溶血毒素的提取和分离
作者： 张文， 江天久， 王锐， ZHANG Wen， JIANG Tian-jiu， WANG Rui
作者单位： 张文,王锐,ZHANG Wen,WANG Rui(暨南大学环境工程系,广州,510632)， 江天久,JIANG
Tian-jiu(暨南大学环境工程系,广州,510632;暨南大学赤潮与水环境研究中心,广州
,510632)
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2008,27(6)
被引用次数： 4次

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