全 文 ：热带亚热带植物学报 2005，13(1)：25-28
Journa／of Tropical and Subtropical Botany
实验室培养球形棕囊藻溶血毒素
的提取、分离及其生成特征
彭喜春 ，杨维东2，刘洁生 ，彭志英1，邓瑞霞2，江天久2
(1．华南理工大学食品与生物工程学院，广东广州510640；2．暨南大学生命科学技术学院，广东广州510632)
摘要：研究从实验室培养的球形棕囊藻 (Phaeocystis globosa)提取溶血毒素的条件，探讨不同生长期球形棕囊藻溶血
毒素的生成特征，用薄层色谱法对溶血成份进行了初步分析。结果表明，球形棕囊藻细胞壁的超声波破碎最适条件为：
功率600 W，4℃下处理30 min。对数生长期、平稳期和衰亡期藻细胞适宜处理量分别为每次3 000、2 000、1 000 ml；在
球形棕囊藻生长的平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性，对数生长期溶血活性很低，甚至检测不到。球形棕囊藻溶血
毒素至少含有4种糖脂类化合物
关键词：藻类；球形棕囊藻；溶血毒素：超声波
中图分类号：Q949．206 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2005)01—0025—04
Extraction of Haemolytic Substances from Alga Phaeocystis globosa
PENG Xi—chun ， YANG Wei—dong ， LIU Jie-sheng ，
PENG Zhi-ying ， DENG Rui-xia ， JIANG Tian—j iu
(1．Food and Biological Engineering Colege，South China University ofTechnology，Guangzhou510640，China；
2．Colege ofLife Sciences and Technology,Jinan University,Guangzhou 510632，China)
Abstract：The extraction ofhaemolytic toxin from Phaeocystis globosa was studied under laboratorial condition at
various algal growth phases． Optimal conditions for breaking algal cell wall by ultrasonic was 600 W of power
treated for 30 minutes at 4℃， the maximum volume of cultures being 3 000，2 000 and l 000 ml at logarithmic，
stationary and senescent phases，respectively．Hi曲haemolytic activity was observed in stationary and senescent
phases，but low or even nil in logarithmic phase．At least four haemolytic substances were foun d in this alga．
Key words：Alga；Phaeocystis globosa；Haemolytic toxin；Ultrasonic
近年来，我国东南沿海持续发生大面积球形棕
囊藻 (Phaeocyst~globosa)赤潮，给当地水产养殖业
造成极大危害[1,21。何家菀等报道现场采集的球形棕
囊藻可产生活性较强的溶血毒素，并认为可能是导
致大范围鱼类死亡的原因之一[3】。目前，国内外对球
形棕囊藻产毒的研究不多。在实验室培养条件下球
形棕囊藻是否产毒?毒素特征是否与野生球形棕囊
藻相同?不同生长期的毒素生成的规律如何?这些
均未见报道。本试验研究球形棕囊藻溶血毒素的提
取条件，用薄层色谱法对溶血成份进行初步的分离
和分析，对不同生长时期球形棕囊藻溶血毒素的活
性特征进行初步研究，为进一步研究和探讨球形棕
囊藻溶血毒素的生成机制提供参考。
1材料和方法
材料 球 形棕 囊 藻 (Phaeocystis globosa
Sherfe1)汕头 (ST)株系由暨南大学水生生物研究
所藻种室提供。所用小白兔购自暨南大学实验动物
收稿 日期：2004一O1—05 接受日期：2004—04—01
基金项目：国家自然科学基金(3o470321，30200030)；国家重点基础研究发展规划973项目(2001CB409710，2001CB409709)：广东省自然科
学基金重点项H(021 168)；广州市科技计划项H(2002J1一C001 1)资助
通讯联系人 Coresponding author
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26 热带亚热带植物学报 第 13卷
场。
仪器与试剂 LRI-I．250．GS人工光照气候箱
(广东省医疗器械厂)，721型分光光度计 (上海第
三分析仪器厂)，JY92．Ⅱ型超声波细胞粉碎机(宁
波新芝生物科技股份有限公司)，XSZ．D2型倒置
显微镜 (广州光学仪器厂 L．1000)。硅胶 GF瑚和
P．1型层析缸(200x200 mlTl，上海信谊仪器厂)。95％
4．甲氧基苯甲醛，其它试剂均为分析纯。
藻种培养 实验盐度为33‰的人工海水，采
用 培养液改良配方[4】。将配制好的培养基用
0．22 Ixm微孔滤膜过滤灭菌，收集 1．5 L滤液于锥形
瓶中。取对数生长末期的球形棕囊藻，用血细胞计
数板计数并计算其细胞密度后接种，接种密度约为
1．5x105个ml一。接种后置于人工气候箱中培养，培
养温度 22~C，光照强度为200 mol m-2 s一，光暗循
环为L：D=12：12。每天固定时间取样于倒置显微
镜下计数，绘制藻细胞的生长曲线，根据藻细胞生
长曲线，分别取对数期、稳定期和衰亡期藻细胞进
行毒素的分离和溶血活性测定。
溶血毒素的提取 采用超声波破碎方式提
取球形棕囊藻溶血毒素，超声波处理均在冰浴条件
下处理，藻细胞溶液维持4℃以下。
将衰亡期的藻细胞培养物 3 000 ml，均匀地分
三次 2 000xg离心，分别收集藻细胞并置于装有
50 ml蒸馏水的小烧杯中，分别用 200、400和
600 W超声波破碎 30 min，于显微镜下观察，检测
其破碎率，确定其最佳破碎功率；取对数期、平稳期
及衰亡期的藻细胞样品，在最佳功率下超声波破碎
藻细胞，每5 min取样于显微镜下观察、计数，确定
藻细胞完全破碎所需时间；各取 3 000、2 000、
1 000 ml不同生长期的藻细胞培养物在选定的最佳
功率和时间条件下破碎，观察、计数，确定每次处理
藻细胞的最佳量。以上实验每组做三个平行样。
根据上述优化的球形棕囊藻细胞破碎条件，将
不同生长期藻细胞各6 L分批离心分离，置50 ml
氯仿：甲醇：水=13：7：5的混和溶液中进行细胞破
碎，待完全分层后取下层溶液，真空干燥后溶解于
适量的甲醇中，即得到溶血毒素。置于一18℃下贮存
备用。
溶血毒素的薄层分离与分析嘲 选用了极性
不同的两种展开剂体系进行展开。载体为硅胶板
GF254。毒素用溶剂系统 I(氯仿：甲醇：水=75：25：
4)在薄层板上展开后，喷涂5％兔血红细胞溶液，确
定其毒素组分；用溶剂系统I(氯仿：甲醇一9：】．)展
开后，分别喷涂0．5％红细胞溶液(A板)、若丹明B
溶液 (B板)(若丹明B 50mg溶解于 100ml乙醇
溶液中)和4．甲氧基苯甲醛溶液 (C板)(8 ml浓
硫酸，0．5 ml 4．甲氧基苯甲醛，80 ml甲醇和 10 ml
冰醋酸)。其中，B板再喷涂 1 mol／L的KOH，在紫
外发生器上显色；C板待其稍干后置于烘箱中
100℃烘烤 1—2 min。
实验中，A板用于获取溶血组分的R6 B板和C
板分别是为了获取棕囊藻粗提液中的糖类物质和
脂类物质的Rf。
溶血毒素的生成特征 取从不同生长期球
形棕囊藻细胞提取的溶血毒素各0．25 ml，用磷酸盐
等渗缓冲液 (pH=7)补充至 1 ml，加 0．5％的兔血红
细胞溶液，37℃水浴 30 min，于540 113下测其透光
度值。根据透光率的大小估计球形棕囊藻产毒情
况。实验分三组同步进行，取平均值 。
2结果和分析
2．1球形棕囊藻的生长曲线
从图1可知，球形棕囊藻经过3—4 d的延滞期
之后，细胞开始快速分裂，细胞的数目呈对数增加，
进入对数生长期。6 d后，一些藻细胞停止分裂，少
数藻细胞继续分裂，进入平稳生长期。12 d几乎所有
的藻细胞停止分裂并有少数细胞开始死亡，藻细胞
进入衰亡期。
=
们
C
勺
U
船
罂 5
O 4 8 12 16
培养时间 Culture time (d)
图 1球形棕囊藻的生长曲线
Fig．1 Growth curveofP．g／obosa
2．2溶血毒素提取条件的优化
一 些研究表明[搠，衰亡期藻细胞细胞壁的破碎
条件相对比较苛刻。因此本实验首先探讨不同功率
下，衰亡期球形棕囊藻细胞在超声波处理30 min后
的破碎率。
200 W和400 W超声波处理30 min后，藻细胞
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第 1期 彭喜春等：实验室培养球形棕囊藻溶血毒素的提取、分离及生成特征 27
的破碎率较低，只有 63％和78％，而 600-800 W 处
理的细胞破碎率可达86％一88％，变化不明显。本实
验选择600 W 的超声波对细胞进行破碎处理。
Fig．2 Breaking rate of／．gobosa cels by ultrasonic treatment
图2为不同生长时期球形棕囊藻细胞壁破碎
的情况。处理开始的5—10 rain内，只有少数细胞壁
破碎；大部分的细胞壁在 lO一20 min内破碎；2O一
30 rain也只有少数细胞壁破碎。对数期藻细胞经过
30 rain的超声波处理，细胞壁破碎率达到99％，倒
置显微镜下观察，几乎无藻细胞存在；平稳期为
95％；衰亡期只有87％。与对数期、平稳期相比较，衰
亡期细胞的破碎率较低，这与文献结果一致[9]，提示
衰亡期藻细胞细胞壁成分与对数期、平稳期有所不
同。可能发生了某种变化。
从图，3可以看出，经过30 rain 600 W的超声波
处理，3 000 ml培养物的藻细胞量在衰亡期的破碎
率只有 6l％，2 000 ml的只有 74％，1 000 ml的达到
一
1 D0
苎
§80
土 60
号
40
嚣
藿20
器
一对数期Logari thmic phase
0平稳期 Stationary phase
1000 2000 3000
处理量 Treatment volume(m1)
图3不同生长时期不同量的藻细胞处理30 min后的破碎率
Fig．3 Breaking rate ofalgal cels atdiferentgrowth
phases treated by ultrasonic for 30 minunts
87％。因此，衰亡期球形棕囊藻细胞培养物每次处理
量以1 000 ml为宜。对数期和平稳期藻细胞处理量
为 1 000 ml的破碎率达到最大，但 3 000 ml和
2 000 ml的处理量的破碎率也分别达到 93％和
91％。
不同生长时期的藻细胞破壁条件不同，其可能
原因在于培养末期藻细胞壁结构的变化。随着培养
时间的延长，培养基中的营养逐渐消耗，藻细胞为
了适应外界环境的变化，细胞壁结构的韧性和强度
加大，以达到保护自身的目的。
2．3溶血毒素成分分析
用溶剂系统(D展开，喷上5％兔血红细胞溶液
后，观察发现，在Rf=0．95和 0．92有2个明显的
溶血白斑，Rf=0．58及Rf=0．20处也有两个不明显的
溶血白斑，据此可以初步推断，球形棕囊藻产生的
溶血毒素至少含有4种组分；以溶剂系统 (Ⅱ)展开，
也可看到有4个溶血白斑，但其 Rf值不同，分别为
Rf=0．84，0．77，0．68，0．14。
为进一步了解球形棕囊藻溶血毒素4种组分
的构成成份，本实验以(Ⅱ)为展开剂展开，依次喷上
若丹明B溶液、1 mol／L的KOH溶液后，240砌 紫
外灯观察发现，该粗提物中的糖类成分至少有8种，
其中，与前述溶血白斑相对应的地方有相应荧光出
现，Rf值分别为0．82，0．79，0．68，0．15。
用(Ⅱ)为展开剂展开，4．甲氧基苯甲醛溶液显色
发现在Rf=0．82和0．80附近有二个明显的斑点，而
Ry0．70和 0．16附近也分别存在 1个斑点。这 4个
脂斑点与4个溶血白斑及四个糖斑点的位置均很
相近。提示溶血组分兼有糖类和脂类两者的特征，
可能均为糖脂类物质。
2．4溶血毒素的生成特征
检测结果显示，对数生长期球形棕囊藻并不表
现出溶血活性 (透光率为O)，平稳期和衰亡期呈现
出一定的溶血活性，透光率分别为43．9和89．4，衰
亡期溶血活性最强。这表明。球形棕囊藻的产毒与
Protogonyaulax spp．相似[1Ol。后者产生的大田软海绵
酸也随藻类培养时间的延长逐渐增加；但不同于麻
痹性 贝毒 的产 生，Protogonyaulax tamarensis和
Protogonyaulax catenela在对数生长初期麻弊性贝
毒的产量最大[9,1】。石房蛤毒素(STX)(-种麻痹性贝
毒)的产生是在Alexandriumfundyense细胞周期的
G 期早期产生的【 。
毒素的生物合成机制非常复杂，不同生长时期
一％)磬 aJ = 得善旨捶遥舞
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热带亚热带植物学报 第 l3卷
藻类的产毒能力往往有所不同。本文结果显示，球
形棕囊藻与大多数双鞭藻类产毒情况相似，即当细
胞进入生长平稳期末或衰亡期时，细胞内毒素的生
产能力增强19- 。在藻的培养过程中，随着培养时间
的延长，培养液中营养逐渐消耗，至平稳期和衰亡
期时，培养基内的营养远低于对数生长期，溶血毒
素的生物合成可能是球形棕囊藻的一种自我保护
机制。
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