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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):140-145
在微生物学研究中，高温菌也称嗜热菌或好热
菌，具有嗜热和耐热的特性［1］。由于高温微生物及
其活性物质可以在高温条件下行使功能，具有超常
的生物学稳定性，能够实现一般生物技术难以达到
的目的。高温菌的利用有助于突破当前生物技术领
域中的一些局限，为提高生物技术能力开辟了重要
途径，因此在生物技术领域具有重要的应用潜力，
特别是嗜热酶作为酶制剂具有制备成本低、动力学
反应快、热稳定性好等优点［2］，在轻工、食品、化
工等众多领域都得到了广泛应用［3］。
高温菌在地球上分布广泛，不仅存在于地热环
境中，在人工高温环境、地下油层甚至空气中都曾
发现有高温菌的存在，但通常分布在陆地温泉、海
底热泉、地壳内部、酸性硫磺区等自然高温环境中
及高温堆肥、烟囱、热水器、热污染河流等人工高
温环境中［4］。本研究从经 121℃灭菌 20 min 的斜面
培养基中分离到一株高温菌 CICC 10853，通过表型、
生理生化、16S rRNA 基因和 recN 基因序列分析的多
相鉴定技术确定该菌株的分类学地位，旨在为进一
步了解其生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 CICC 10853 分离于 CICC 实验室的斜
面培养基。
1.1.2 R2A 培养基 酵母粉 0.5 g，蛋白胨 0.5 g，酪
蛋白水解物 0.5 g，葡萄糖 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，
收稿日期 ：2015-04-30
作者简介 ：都海渤，女，高级工程师，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：802311820@163.com
通讯作者 ：程池，男，教授级高工，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：cheng100027@163.com
一株耐高温菌 CICC 10853 的分离和鉴定
都海渤 张欣 李赞 刘毅 刘波 李金霞 姚粟 程池
（中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100015）
摘 要 ： 从斜面培养基中分离到一株耐高温菌 CICC 10853，对该菌株的分类地位进行了研究。通过形态学、生理生化特征、
16S rRNA 和 recN 基因序列分析的多相鉴定技术，将其鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus thermoleovorans），为后续对该菌的生物
学功能研究奠定基础。
关键词 ： 高温菌 ；CICC 10853 ；鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.018
Isolation and Identification of a High-temperature Resistant Bacterium
CICC 10853
DU Hai-bo ZHANG Xin LI Zan LIU Yi LIU Bo LI Jin-xia YAO Su CHENG Chi
（China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015）
Abstract: In this study, we identified the high-temperature resistant bacterium CICC 10853 isolated from slant culture. The strain was
identified and characterized via morphological features, physiological and biochemical characteristics, 16S rRNA and recN gene sequence
analysis. According to the results, strain CICC 10853 was identified as Geobacillus thermoleovorans, which lays the foundation for the further
study of biological function of the bacterium.
Key words: thermophilic bacterium ；CICC 10853 ；identification
2016,32(2) 141都海渤等 ：一株耐高温菌 CICC 10853 的分离和鉴定
丙酮酸钠 0.3 g，磷酸氢二钾 0.3 g，硫酸镁 0.1 g，琼
脂 15.0 g。蒸馏水 1.0 L，pH7.2。121℃高压蒸汽灭
菌 20 min。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离与纯培养 R2A 培养基分装试管，
121℃灭菌 20 min，冷却至 50-55℃摆斜面，凝固后
置于 37℃培养箱空置培养 2 d，确认无菌。在 56℃
培养 48 h，长出菌落后，利用 R2A 平板划线培养，
挑取单菌落转接到新鲜的 R2A 斜面培养后于 4℃
保藏。
1.2.2 形态学观察 将供试菌株接种于 R2A 平板上，
56℃培养 24 h。取新鲜菌体进行革兰氏染色并镜检，
染色方法参照《常见细菌系统鉴定手册》［5］。同时
进行扫描电镜切片并镜检、拍照。
1.2.3 16S rRNA 基因序列分析 利用细菌基因组
DNA 提 取 试 剂 盒（Tiangen 公 司 ） 提 取 菌 株 CICC
10853 基因组 DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。
以基因组 DNA 为模板，利用通用引物 F27/1492R 扩
增 16S rRNA 基因［6］。测序由北京诺赛基因组研究
中心有限公司完成。测序结果用 Chromas 软件参照
正反序列图谱人工校对，测序结果在 EzTaxon 数据
库中进行比对［7］，确定与已知近缘种序列的相似
性。采用 CLUSTAL W 对 CICC 10853 及其若干近缘
种 16S rRNA 基因序列进行多序列比对［8］，并利用 N-J
法通过 MEGA 5 软件进行系统发育树分析［9］。
1.2.4 recN 基因序列分析 以菌株 CICC 10853 的
基因组 DNA 为模板，对靶基因 recN（DNA 修复和
基因重组蛋白 N 亚基基因）进行扩增，PCR 及反应
条件参照［10］。纯化后的 PCR 产物由北京诺赛基因
组研究中心有限公司进行测序。测序得到的结果在
GenBank 数据库中进行比对分析，并通过 MEGA 5
软件进行系统发育树分析［9］。
1.2.5 生理生化特征实验 采用 API 50CH 及 API
20E 试剂条对 CICC 10853 的碳源利用及其产酸情况、
酶活性等生理生化特征进行检测，具体操作方法按
试剂条使用说明书进行。生长温度实验和耐盐性实
验依据《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》［11］（第 2 版）
中地芽胞杆菌属相关内容，温度选择 35℃、40℃、
45℃、70℃和 75℃，NaCl 终浓度选择 1%、2%、3%、
4% 和 5%。
2 结果
2.1 形态学观察
菌株 CICC 10853 在 R2A 培养基上，菌落黄色、
不透明、圆形、表面光滑（图 1-A）。利用光学显微
镜观察显示菌体细胞长杆状，单个或成链状排列。
革兰氏染色阳性，有芽胞，芽胞椭圆或柱状、端生
或次端生，膨大明显（图 1-B）。菌体电子显微镜观
察，菌体长度 2.0-3.0 μm，宽度 0.4-0.6 μm，扫描电
镜成像效果见图 1-C。
A
B
C
10 mm
5 μm
A ：宏观形态学观察 ；B ：光学显微镜观察 ；C ：扫描电镜观察
图 1 菌株 CICC 10853 形态学观察结果
2.2 16S rRNA基因序列分析
测序得到的菌株 CICC 10853 的 16S rRNA 基因
序列信息提交至 GenBank，获得登录号 KP729021。
以 Bacillus subtilis NCIB 3610T（ABQL01000001） 为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2142
Geobacillus kaustophilus NCIMB 8547T X60618
G. vulcani 3S-1T AJ293805
G. thermoleovorans BGSC 96A1T AY608936
G. lituanicus N-3T AY044055
CICC 10853
G. gargensis DSM 15378T FR749979
G. thermocatenulatus DSM 730T Z26926
G. stearothermophilus NBRC 12550T AB271757
G. jurassicus DS1T AY312404
G. uzenensis_UT AF276304
G. subterraneus DSM 13552T AY608956
G. thermantarcticus DSM 9572T FR749957
Bacillus subtilis NCIB 3610T ABQL01000001 95
100
100
81
76
67
62
55
83
0.01
采用邻接法，根据菌株 16S rRNA 基因序列构建的系统发育树。圆括号内为 GenBank 中的收录号。每个分支点处
的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的支持百分率。标尺代表 1.0% 的序列差异度
图 2 CICC 10853 16S rRNA 基因系统发育分析
外群，构建 CICC 10853 与相关近缘模式菌株的系统
发育树（图 2）。
由系统发育分析可判断，CICC 10853 应归属
为 地 芽 胞 杆 菌 属（Geobacillus sp.）， 与 好 热 地 芽
胞 杆 菌（Geobacillus kaustophilus）、 火 神 地 芽 胞 杆
菌（G.vulcani）、立陶宛地芽胞杆菌（G.lituanicus）、
噬 热 地 芽 胞 杆 菌（G.thermoleovorans）、 加 尔 加 泉
地 芽 胞 杆 菌（G.gargensis） 和 热 小 链 地 芽 胞 杆 菌
（G.thermocatenulatus） 等 聚 为 一 个 系 统 发 育 分 支，
16S rRNA 基因序列相似性均高于原核微生物种的界
限 98.65%［12］。Dinsdale 等［13］根据 API、脂肪酸成
分、DDH 等分析认为好热地芽胞杆菌（Geobacillus
kaustophilus）、 火 神 地 芽 胞 杆 菌（G.vulcani）、 立
陶 宛 地 芽 胞 杆 菌（G.lituanicus）、 噬 热 地 芽 胞 杆
菌（G.thermoleovorans） 应 归 为 同 一 个 种 噬 热 地
芽 胞 杆 菌（G.thermoleovorans）， 另 外 加 尔 加 泉 地
芽 胞 杆 菌（G.gargensis） 应 为 热 小 链 地 芽 胞 杆 菌
（G.thermocatenulatus）的同物异名。
2.3 recN 基因序列分析
recN 基因是地芽胞杆菌属内种间分子生物学
鉴定的重要工具［10］。以菌株 CICC 10853 的基因组
DNA 为模版，扩增 recN 基因，基因序列信息提交至
GenBank，获得登录号 KP729022。以 Bacillus subtilis
subsp. subtilis 168T（AL009126）为外群，构建 CICC
10853 与相关近缘模式菌株的系统发育树（图 3）。
recN 基因基因序列分析显示，菌株 CICC 10853
与 好 热 地 芽 胞 杆 菌（Geobacillus kaustophilus）、 火
神 地 芽 胞 杆 菌（G.vulcani）、 立 陶 宛 地 芽 胞 杆 菌
（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）
的 recN 基因序列相似度为 98.9%，与热小链地芽胞
杆菌（G.thermocatenulatus）的序列相似度为 97.4%，
而与其他近缘种的相似度均低于 90%。CICC 10853
与 好 热 地 芽 胞 杆 菌（Geobacillus kaustophilus）、 火
神 地 芽 胞 杆 菌（G.vulcani）、 立 陶 宛 地 芽 胞 杆 菌
（G.lituanicus）、噬热地芽胞杆菌（G.thermoleovorans）
的 recN 基因序列种间相似性均大于 99%，这也进一
步证明了 Anna E. Dinsdale 等人的结论。
因此，根据 16S rRNA 和 recN 基因分析表明，
CICC 10853 应鉴定为噬热地芽胞杆菌（G.thermoleo-
vorans）或热小链地芽胞杆菌（G.thermocatenulatus）。
2.4 生理生化鉴定
菌株 CICC 10853 的酶活性、碳源利用及其产酸
情况等生理生化特征结果详见表 1。结果显示菌株
CICC 10853 液化明胶，β-半乳糖苷酶反应阳性 ；能
利用葡萄糖、果糖、核糖、D-木糖、半乳糖、甘露
糖、淀粉、甘油、肌醇、甘露醇、α-甲基 -D-葡萄糖甙、
2016,32(2) 143都海渤等 ：一株耐高温菌 CICC 10853 的分离和鉴定
七叶灵等碳源物质，生长温度为 45-70℃，培养基
中 NaCl 终 浓 度 1% 时 可 生 长，NaCl 终 浓 度 2% 时
不能生长。生理生化结果与噬热地芽胞杆菌（Geoba-
cillus thermoleovorans）一致。
Geobacillus. kaustophilus DSM 7263T AY609001
G. thermoleovorans DSM 5366T AY609003
G. vulcani DSM 13174T AY609007 .
G.lituanicus DSM 15325T AY609012
CICC 10853
G. thermocatenulatus DSM 730T AY609002
G. stearothermophilus ATCC 12980T AY608995
G. thermodenitrificans DSM 465T AY609027
G. subterraneus DSM 13552T AY609023
G. uzenensis BGSC 92A2(AY609026
G. caldoxylosilyticus BGSC W9A36T AY609018
G. thermantarcticus BGSC 20A1T AY609047
Bacillus subtilis subsp. subtilis 168T AL009126 97 10099
98
69
100
69
99
89
70
0.1
注 ：采用邻接法，根据菌株 recN 基因序列构建的系统发育树。圆括号内为 GenBank 中的收录号。
每个分支点处的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的支持百分率。标尺代表 10% 的序列差异度
图 3 CICC 10853 recN 基因系统发育分析
表 1 CICC 10853 生理生化特征检测结果
检测项目 结果 检测项目 结果 检测项目 结果 检测项目 结果
葡萄糖 + 棉子糖 - 熊果甙 + 赖氨酸脱羧酶 -
果糖 + 肝糖 - 苦杏仁甙 + 精氨酸双水解酶 -
L- 阿拉伯糖 - 纤维二糖 + 七叶灵 + 色氨酸脱氨酶 -
核糖 + 蜜二糖 - 甘油 + β- 半乳糖苷酶 +
D- 木糖 + 龙胆二糖 - 肌醇 + 脲酶 -
半乳糖 + D- 松二糖 - 柳醇 + 明胶水解 +
甘露糖 + 松叁糖 - 甘露醇 + 1%NaCl 生长 +
鼠李糖 - 淀粉 + 山梨醇 - 2%NaCl 生长 -
麦芽糖 + 葡萄糖酸盐 - 木糖醇 - 3%NaCl 生长 -
蔗糖 + N- 乙酰 - 葡糖胺 - 吲哚试验 - 40℃生长 -
海藻糖 + α- 甲基 -D- 甘露糖甙 - VP 试验 - 45℃生长 +
菊糖 - α- 甲基 -D- 葡萄糖甙 + 硝酸盐还原 - 70℃生长 +
乳糖 - β- 甲基 -D- 木糖甙 - 柠檬酸利用 - 75℃生长 -
2.5 菌株CICC 10853分类鉴定结论
依据形态学观察、生理生化鉴定、16S rRNA 基
因及 recN 基因序列分析，分离自斜面培养基的菌株
CICC 10853 被鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus
thermoleovorans）。
3 讨论
2001 年，Nazina 等［14］提出将芽胞杆菌属 16S
rRNA 系统发育群 GROUP 5 的嗜热菌群独立出来，
形成一个新属地芽胞杆菌属。该属菌种表型相近，
革兰氏染色呈阳性（或可变），菌体杆状，芽胞端
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2144
生。生长温度范围 37-80℃。大部分种在自然环境
中广泛存在，在温泉、油田、火山口和堆肥等高温
环境，甚至土壤常温环境和极地低温环境中均有报
道［15］。地芽胞杆菌属正式发表的种共计 19 个，但
近年来随着新种的发现和分子生物学的发展，原
有种的分类学地位发生了很大变化，如脆弱地芽
胞 杆 菌 G. debilis 归 属 到 新 属 Caldibacillus sp.， 命
名为 C. debilis ；苍白地芽胞杆菌 G. pallidus、脆弱
地芽胞杆菌 G. debilis 转移到新属 Caldibacillus sp. ；
喜温地芽胞杆菌 Geobacillus tepidamans 重新归属到
无氧芽胞杆菌属 Anoxybacillus sp.。 好 热 地 芽 胞 杆
菌（G. kaustophilus）、火神地芽胞杆菌（G.vulcani）、
立 陶 宛 地 芽 胞 杆 菌（G. lituanicus）、 噬 热 地 芽 胞
杆菌（G. thermoleovorans）合并为一个种噬热地芽
胞 杆 菌（G. thermoleovorans）， 同 时 加 尔 加 泉 地 芽
胞 杆 菌（G. gargensis） 为 热 小 链 地 芽 胞 杆 菌（G.
thermocatenulatus）的同物异名。截止目前该属仅存
12 个有效种，4 个亚种［16］。
Zeigler［10］对 68 株地芽胞杆菌的 recN 基因序列
进行了分析，与 16S rRNA 基因相比，recN 基因在
地芽胞杆菌种水平的鉴定区分度更高。本研究通过
16S rRNA 和 recN 基因序列分析将菌株 CICC 10853
鉴定为噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）或热小
链地芽胞杆菌（G. thermocatenulatus），菌株与噬热
地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）的 recN 基因序列相
似性（98.9%）高于热小链地芽胞杆菌（97.4%）。进
一步综合表型、生理生化等分类特征，CICC 10853
被鉴定为噬热地芽胞杆菌（G. thermoleovorans）这也
进一步证明了 Dinsdale 等［13］的结论。
噬热地芽胞杆菌 CICC 10853 是从经 121℃灭菌
20 min 的斜面培养基中分离获得，可以推测其耐高
压蒸汽灭菌，121℃灭菌 20 min 不能将其彻底杀灭。
该菌在 40℃及以下温度不能生长，所以 37℃空置培
养时未能发现该菌的存在。此外，本研究针对 CICC
10853 进行碳源物质利用情况及相关酶的活性进行
研究，确定其能液化明胶，同时具有 β-半乳糖苷酶
活性，能利用葡萄糖、果糖、核糖、半乳糖、甘露糖、
淀粉及甘油等近 20 种碳源物质，为进一步开发该菌
的生物学功能奠定重要基础。
4 结论
依据多相鉴定技术，分离自斜面培养基的菌株
CICC 10853 被鉴定为噬热地芽胞杆菌（Geobacillus
thermoleovorans）。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）