全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):116-120
植物根系从土壤中吸收的 NO3
-，通过茎、叶柄
运往叶片，在叶片中硝酸还原酶等的作用下转化为
氨态氮，再在谷氨酰胺合成酶（Glutamine syntheta-
se，GS）的作用下转化为谷氨酰胺（Gln），进入氮代
谢。除此以外，根瘤中向上运输的酰脲在叶片中也
代谢形成 NH4
+，经过 GS 转化后进入氮代谢［1］。因此，
GS 在植物氮代谢中起着关键的作用，是植株氮素转
化的关键酶［2］。
GS 以多种形式存在于植物中，高等植物的种子、
叶、根、根瘤和果实等器官中分布着多种 GS 的同
工酶，GS 的不同功能由不同的 GS 同工酶承担［3］。
在叶片中，GS2 的功能是通过硝酸盐还原和光呼吸
过程来同化氨［4］；根中 GS1 直接从土壤中吸收氨或
者 NO3
-［5］；胚中，吸收分解发芽期储存的含氮物释
放的氨［6］；根瘤中 GS 主要是快速的吸收氮，固定
细菌侵染的细胞排泄到植物中的氨［7］。GS 的分子生
物学研究始于 1983 年，从蓝细菌克隆到 GS 并完全
测序分析。许多植物，如大麦［8］、水稻［9］、豌豆［10］
等的 GS cDNA 已被克隆。
大豆作为一种重要的粮 - 油兼用作物，籽粒蛋
收稿日期 ：2015-07-07
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31201687）
作者简介 ：杨美英，女，博士，副教授，研究方向 ：微生物的生化与分子生物学 ；E-mail ：jlaumeiying@163.com
野生大豆根瘤 GmGS1γ 基因序列分析及原核表达
杨美英  岳胜天  韩红  孙合美  刘晶晶  卢冬雪 
（吉林农业大学生命科学院，长春 130118）
摘 要 ： 旨在明确大豆谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）基因家族各成员的结构特点及功能。利用同源克隆的方
法从野生大豆根瘤克隆 GmGS1γ 基因。生物信息学分析表明，ORF 为 1 071 bp，与大豆 GS1γ（AF363022.1）部分序列的相似性为
100%，与序列号为 X81700.1 相似性为 99%。该序列具备植物 GS 的两个保守结构域，GS beta-Grasp 功能区（17-97 aa）和 GS 催化
功能区（103-350 aa）。系统发生树表明该基因编码的 GS 可能属于胞质 2 型同工酶。该基因可以在大肠杆菌 DE3.0 中表达，蛋白
分子量为 44 kD。
关键词 ： 野生大豆 ；谷氨酰胺合成酶（GS）；原核表达 ；序列分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.015
Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of GmGS1γ Gene from
Nodules of Glycine soja
YANG Mei-ying YUE Sheng-tian HAN Hong SUN He-mei LIU Jing-jing LU Dong-xue
（College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract: In order to clarify the structures and functions of the members of the glutamine synthetase（GS）gene family，the GmGS1
gene was cloned from Glycine soja by homologous cloning. The bioinformatics analysis showed that，the ORF was 1 071 bp，and the similarity
was 100% and 99% with the partial sequence of soybean GS1γ（AF363022.1）and X81700.1，respectively. The sequence had two conserved
domains of plant GS，beta-Grasp GS functional area（17-97 aa），and GS catalytic functional area（103-350 aa）. Phylogenetic tree showed
that GS encoded by the gene GmGS1 probably belonged to glutamine synthetase cytosolic isozyme 2. The gene was expressed in Escherichia coli
DE3.0，and the molecular weight of the protein was 44 kD.
Key words: Glycine soja ；glutamine synthetase（GS）；prokaryotic expression ；sequence analysis
2016,32(4) 117杨美英等：野生大豆根瘤 GmGS1γ基因序列分析及原核表达
白质含量明显高于玉米、水稻等作物［11］，而且可以
形成豆科植物 - 根瘤菌共生固氮体系。高蛋白野生
大豆 ZYD01251 蛋白质含量可以达到 53% 以上，具
有较强的氮素利用与贮藏机制。而且作者在前期的
研究中发现高蛋白野生大豆根瘤衰老较慢，根瘤内
氮代谢物含量丰富，生育后期仍具有较强的酰脲合
成与运输能力是形成该类型大豆籽粒高蛋白质含量
的原因之一［12］。 为了进一步明确根瘤的生长发育
及其基因表达对野生大豆蛋白质含量的影响，本研
究从野生大豆根瘤中克隆 GmGS1γ 基因序列，对该
序列利用生物信息学方法进行预测并构建 pET-28a-
GmGS1γ 原核表达载体，在大肠杆菌中表达目的蛋
白，旨在进一步认识野生大豆 GS 基因家族各成员
的结构特点及其在氮素代谢过程中的功能，明确不
同 GS 同工酶在植物氨同化过程中的贡献以及为研
究植物氮代谢机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒与试剂 大肠杆菌菌株 DH5α、
BL21（DE3）及载体 pET28a（+）均为本实验室保存。
Easy ScriptTM First-strand cDNA Synthesis Super
Mix 反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公
司 ；限 制 性 内 切 酶、Ex Taq 酶、T4 DNA 连 接 酶、
DNA 分子量标准、蛋白质分子量标准和 pMD18-T 载
体试剂盒以及琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒均购于
TaKaRa 公司。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.2 植物材料 本实验所用大豆材料为高蛋白野
生大豆 ZYD01251（原产于吉林省东辽县，生育期
125 d，蛋白含量 53.0%）。
1.2 方法
1.2.1 根瘤样品的采集及 RNA 的提取 将吉林农
业大学大豆试验田土壤装入直径为 20 cm 的塑料
盆，种植野生大豆 ZYD01251，每盆 3 株。收集 45
d 苗龄的大豆根瘤，用蒸馏水将根瘤冲洗干净，快
速用液氮处理后，-80℃冰箱保存。Trizol 法提取大
豆根瘤总 RNA，752N 紫外分光光度计测定 OD260 和
OD280，选择 OD260/OD280 介于 1.7-2.0 的样品，采用
反转录试剂盒合成 cDNA。
1.2.2 GmGS1γ 基因的 PCR 扩增 以野生大豆根瘤
cDNA 为模板，PCR 扩增 GmGS1γ 基因。所用引物
根据 GenBank 发表的大豆 GmGS1γ 序列（X81700.1）
进 行 设 计。GmGS1γF ：5-AAGAGTCTCCGCTGAAC
-3 ；GmGS1γR ：5-AACAGGCGAGGTAGTCA-3。 引
物合成与扩增产物的序列测定均由上海生工生物工
程有限公司完成。
将野生大豆 GmGS1γ 基因测序结果进行分析。
采用 GenBank DNA 数据库进行 BLAST 同源性比较。
采用 NCBI 在线软件对 GmGS1γ 蛋白的结构域进行
预 测（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.
cgi）。搜索 NCBI 蛋白库里所有大豆 GS 的全序列，
利用 DNAMAN 软件构建系统发生树。
1.2.3 原核表达载体 pET-28a-GmGS1γ 的构建与鉴
定 以测序为阳性的重组质粒 pMD18-T-GmGS1γ 为
模板，两端具有 Xho I/Sal I 酶切位点的引物 GmGS1-
γF：5-CGAGCTCATGTCGTTACTCTCCGATCTTA-3 和
GmGS1γR ：5-CCGCTCGAGCGTTGCTTATGGTTTCC
AAAG-3（下划线部分为酶切位点）进行 PCR，获
得两端分别带有 Xho I 和 Sac I 酶切位点的目的片段。
将目的片段和 pET28a（+）分别用 Xho I 和 Sac I 双
酶切，凝胶回收并连接。连接产物 42℃热激转化大
肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞。PCR 及 Xho I/Sac
I 双酶切验证为阳性的克隆送上海生工测序。
1.2.4 重组质粒 pET-28a-GmGS1γ 在大肠杆菌 BL21
（DE3） 体 内 的 诱 导 表 达 将 鉴 定 为 阳 性 的 BL21
（pET-28a-GmGS1γ）挑取单菌落到 LB 液体培养基中
（含 Kan），37℃，160 r/min，过夜培养。以 1% 的接
种量将过夜培养的菌液转接到含有 Kan 抗性的 LB
液体培养基中，37℃，160 r/min 培养至 OD600=0.6。
加入 IPTG 使其终浓度为 1.0 mmol/L，诱导 2 h 和 4
h，各取 1 mL 菌液，10 000×g，离心 10 min 收集菌
体。将收集到的菌体加入 100 μL 样品溶解液充分混
匀。100℃处理 10 min，裂解菌体细胞。12 000 r/min
离心 10 min，收集上清，上样 20 μL，采用 12% 的
分离胶和 5% 的浓缩胶进行 SDS-PAGE 电泳检测蛋
白表达。
2 结果
2.1 根瘤总RNA的提取及GmGS1γ基因的克隆
为了克隆目的基因，从野生大豆的大豆根瘤中
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4118
提取总 RNA。总 RNA 提取及 GmGS1γ 基因扩增结果
（图 1）显示，RNA 提取效果理想，可以看到清晰的
3 条带。提取的 RNA 可以进行下一步的 RT-PCR 实
验。以反转录后得到的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，
在约 1 000 bp 处有一条清晰的特异性片段，大小与
预测值相符。用 DNA 凝胶回收试剂盒将扩增出的片
段进行回收，并将回收片段克隆到 pMD18-T 载体上，
转化 E.coli JM109 感受态细胞。
相似性为 100%，与引物设计时选择的 GS 参考序列
（X81700.1） 相 似 性 为 99%。 利 用 NCBI 的 在 线 结
构预测软件对序列的结构域进行预测，结果（图
2）表明，这一序列包含一个 1 071 bp 编码 356 aa
的 ORF，为 GS 的编码区，这个蛋白包含了一个 GS
beta-Grasp 功 能 区（17-97 aa） 和 GS 催 化 功 能 区
（103-350 aa）。这些功能区在植物的 GS 中是保守的
两个结构域，从而证实 GmGS1γ 基因克隆成功。
2.3 大豆各类GS蛋白全序列系统发生树
从 NCBI 蛋白库里共搜索到 21 条包括 GS 同工
酶和 GS 受体蛋白的全序列，与 GmGS1γ 基因所编码
的蛋白序列，利用 DNAMAN 软件进行系统发生树的
构建。结果（图 3）显示，不同类的 GS 形成不同的
簇。以胞质 GS 同工酶 1 型为主形成的第①簇，以
GS 前体为主形成的第②簇，而 GmGS1γ 基因序列
所编码的 GS 分在了第③簇中，并且与序列号为
CAA57346（核酸序列为 X81700）的谷氨酸氨连接
酶及序列号为 AAC97935 的根瘤特异性 GS 相邻，与
序列号为 XP_003519325 的胞质 GS 2 型同工酶分成
一个小的分支。
2.4 原核表达载体pET-28a-GmGS1γ的构建
以重组质粒 pMD18-T-GmGS1γ 为模板，目的片
段 GmGS1γ 基因 ORF 的扩增结果（图 4-A）显示，
大小约为 1 000 bp。将该片段回收，限制性内切酶
消化后，与 pET-28a（+）进行连接获得重组质粒
pET-28-GmGS1γ，酶切结果如图 4-B 所示。酶切获
bp
2000
1000
750
500
250
100
1 2 3 4 M
1，2 ：ZYD01251 大豆根瘤总 RNA ；3 ：GSγ 基因的 PCR 扩增 ；4 ：阴性对照 ；
M ：DL2000 DNA Marker
图 1 大豆根瘤总 RNA 提取及 GmGS1γ 基因克隆
2.2 GmGS1γ基因的序列分析
对 构 建 成 功 的 pMD18-T-GmGS1γ 重 组 质 粒
中的目的片段进行测序。结果表明，序列全长 1
215 bp。 将 该 序 列 利 用 GenBank 中 BLAST 进 行 分
析， 发 现 与 大 豆 GS1γ（AF363022.1） 部 分 序 列 的
A B
1 125 250 375 500 625 750 875 1000 1072
Gln-synt_N superfamily
Gln-synt_N
PLN02284
Gln-synt_C superfamily
Gln-synt_C
A ：GS beta-Grasp 功能域 ；B ：GS 催化功能区
图 2 GmGS1γ 基因编码序列结构域及三维结构预测
2016,32(4) 119杨美英等：野生大豆根瘤 GmGS1γ基因序列分析及原核表达
得的片段与 PCR 扩增片段大小一致，说明重组质粒
构建成功，可以进行下一步实验。
表达量明显高于 2 h 时的表达水平。
3 讨论
根瘤中的根瘤菌（类菌体）利用宿主植物体提
供的能量和内环境，将空气中的 N2 还原为氨，供宿
主植物利用，形成了自然界效率最高的共生固氮作
用［13］。1988 年米山忠克［14］研究认为，根瘤固氮首
先在类菌体中将 N2 还原为 NH4
+，然后在 GS 的作用
下合成 Gln，再在一系列酶的作用下形成酰脲向地上
部运输。GS 是高等植物氮素代谢的关键酶［15］。大
豆 GS1 基因家族存在 α、β、γ 3 个组分［16，17］，其中
子叶和幼根中以 α 为主 ；虽然 β 是组成型表达，但
其却在固氮根瘤中表达水平较高 ；γ1 表现为根瘤特
异表达［5］，而 γ2 则在根瘤、子叶和花中被检测到［18］。
王晓波等［19］研究发现，大豆根瘤中存在 4 个豆科
植物特有的 GS1 基因。本研究从高蛋白野生大豆
ZYD01251 根瘤中成功克隆了 GmGS1γ 基因，BLAST
结果显示该基因序列与大豆 GS1γ（AF363022.1）的
相似性为 100%。而且该序列编码的氨基酸序列具有
植物 GS 中保守的两个结构域，GS beta-Grasp 功能区
和 GS 催化功能区，说明本实验获得的序列具有编
码大豆根瘤中 GS 的特征。而且从大豆 GS 系统发生
树分析，该基因编码的氨基酸序列可能属于胞质 GS
2 型同工酶。
高 等 植 物 中 GS 全 酶 均 为 八 聚 体， 每 个 亚 基
分 子 量 为 38-45 kD［2］。 本 实 验 中 DE3.0（pET-28-
GmGS1γ）表达的目的蛋白约为 44 kD，该蛋白的大
小符合 GS 亚基分子量的范围。
2
3
1
0.05
图 3 大豆 GS 系统发生树
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 M 4 5
1071
bp
A B
M ：DL2000 DNA Marker ；1-3 ：GmGS1γ 基因 ORF 的 PCR 扩增 ；
4，5 ：重组质粒酶切
图 4 GmGS1γ 基因 ORF 的 PCR（A）与酶切（B）结果
2.5 GmGS1γ基因在大肠杆菌中的诱导表达
将 重 组 质 粒 pET-28-GmGS1γ 转 化 到 表 达 菌
BL21 中，同时以原核表达质粒 pET-28a（+）转入表
达菌 BL21 中作为对照。利用 12% 的 SDS-PAGE 对
经 1.0 mmol/L IPTG 诱导 2 h 和 4 h 的菌液进行分析。
结果（图 5）显示，两个时间段的菌液均在约 44.0
kD 处明显出现诱导表达的条带，与预期结果一致，
说明该基因在菌株 BL21 中成功表达，而且 4 h 时的
kD
97.2
66.4
44.3
29.0
M 1 2 3 ⴞⲴӗ⢙
M ：低 分 子 量 蛋 白 Marker ；1 ：BL21（pET28a） 诱 导 结 果 ；2，3 ：BL21
（pET-28-GmGS1γ）分别诱导 2 h 和 4 h 的结果
图 5 GmGS1γ 蛋白的表达
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4120
4 结论
从野生大豆根瘤中克隆到 ORF 为 1 071 bp 的
GmGS1γ 序列，生物信息学分析表明，该序列具备
植物 GS 的两个保守结构域，GS beta-Grasp 功能区
（17-97 aa）和 GS 催化功能区（103-350 aa）。系统
发生树表明该基因编码的 GS 可能属于胞质 2 型同
工酶。该基因可以在大肠杆菌 DE3.0 中表达，蛋白
分子量为 44 kD。
参 考 文 献
［1］李姚 , 马春梅 , 龚振平 . 春大豆谷氨酰胺合酶（GS）活性动态
的研究［J］. 东北农业大学学报 , 2006, 6 ：729-732.
［2］冯万军 , 窦晨 , 牛旭龙 , 等 . 玉米谷氨酰胺合成酶基因家族的生
物信息学分析［J］. 玉米科学 , 2015, 23（1）：51-57.
［3］韩娜 , 葛荣朝 , 赵宝存 , 等 . 植物谷氨酰胺合成酶研究进展［J］.
河北师范大学学报 ：自然科学版 , 2004, 28（4）：407-423.
［4］Hanne CT, Dennis E, Inge SM, et al. Cytosolic glutamine
synthetase ：a target for improvement of crop nitrogen use
efficiency［J］. Trends in Plant Science, 2014, 19（10）：656-663.
［5］Lea PJ, Ireland RJ. Nitrogen metabolism in higher plants［J］.
Annual Review of Plant Physiology, 1999 ：1-47.
［6］Swarup R, Bennett MJ, Cullimore JV. Expression of glutamine-
synthetase genes in cotyledons of germinating Phaseolus vulgaris L.
［J］. Planta, 1990, 183（1）：51-56.
［7］Mariangela H, Glaciela K. Regulation of N2 fixation and NO3
-
/NH4
+ assimilation in nodulated and N-fertilized Phaseolus vulgaris
L. exposed to high temperature stress［J］. Environmental and
Experimental Botany, 2014, 98 ：32-39.
［8］Freeman J, Marquez A, Wallsgrove RM, et al. Moleular analysis of
barley mutants deficient chloroplast glutamine synthetase［J］.
Plant Mol Biol, 1990, 14（3）：297-311.
［9］Li MG, Villemur R, Hussey PJ, et al. Differential expression of six
glutamine synthetase genes in Zea mays［J］. Plant Molecular
Biology, 1993, 23（2）：401-407.
［10］Tingey SV, Tsai FY, Edwards JW, et al. Chloroplast and cytosolic
glutamine synthetase are encoded by homologous nuclear genes
which are differentially expressed in vivo［J］. J Biol Chem, 1988,
263（20）：9651-9657.
［11］李喜焕 , 常文锁 , 张彩英 . 中国大豆磷素营养及磷高效品种筛
选最新进展［J］. 大豆科学 , 2011, 30（2）：322-327.
［12］杨美英 , 王乾钦 , 赵洪锟 , 等 . 不同蛋白质含量大豆结瘤特性
与根瘤氮代谢物含量的比较分析［J］. 中国油料作物学报 ,
2011, 33（5）：492-498.
［13］王彦章 , 俞冠翘 , 沈善炯 , 等 . 大豆早期结瘤素基因 enod2B 启
动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导［J］. 科学通报 , 2004, 3：
238-244.
［14］董钻 . 大豆产量生理［M］. 北京 ：中国农业出版社 , 2000 ：
97-105.
［15］于瑶 , 张汉尧 , 杜建伟 . 高等植物谷氨酰胺合成酶基因的研究
进展［J］. 中国农学通报 , 2012, 44（4）：15-19.
［16］Kevin JM, Jose LO, Champa SG. Cytosolic glutamine synthetase
in soybean is encoded by a multigene family, and the members are
regulated in an organ-specific and developmental manner［J］.
Plant Physiology, 2002, 128 ：182-193.
［17］Peterman TM, Goodman HM. The glutamine synthetase gene
family of Arabidopsis thaliana ：light-regulation and differential
expression in leaves, roots and seeds［J］. Mol Gen Genet, 1991,
330 ：145-154.
［18］Ortega JL, Moguel ES, Potenza C, et al. The 3 untranslated
region of a soybean cytosolic glutamine synthetase（GS1）
affects transcript stability and protein accumulation in transgenic
alfalfa［J］. The Plant Journal, 2006, 45（5）：832-846.
［19］王晓波 , 滕婉 , 何雪 , 童依平 . 大豆谷氨酰胺合成酶基因的分
类及根瘤特异表达 GmGS1β2 基因功能的初步分析［J］. 作物
学报 , 2013, 39（12）：2145-2153.
（责任编辑 马鑫）