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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):170-177
收稿日期 ：2015-09-24
基金项目 ：广东省科技厅项目（2012B010300021，2013B010404044），广东省教育厅项目（2013KJCX0107）
作者简介 ：张雪玲，女，硕士研究生，研究方向 ：利用宏基因组学的方法筛选新型纤维素酶 ；E-mail ：1095199175@qq.com
通讯作者 ：李荷，女，博士研究生，教授，研究方向 ：微生物分子生物学 ；E-mail ：lihe32@163.com
漆酶 Lac1338 的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料
影响
张雪玲  陈小利  李荷 
（广东药学院基础学院生物化学与分子生物学系，广州 510006）
摘 要 ： 为了获得表达量高、热稳定性好的漆酶，通过密码子优化合成漆酶基因 lac1338、连接到 pET-32a（+）载体上并
在 Escherichia coli BL21（DE3）中表达，获得 HIS-Lac1338蛋白。酶学性质测定结果显示，以 ABTS为底物时，HIS-Lac1338的比
活力高达 22.8 U/mg，Km 和 Vmax 分别为 567 μmol/L 和 2.8 mmol/ （L·min·g）；HIS-Lac1338的最适反应温度为 55℃，最适 pH为
6.0 ；在 55℃以下保温 2 h能保留 50%的酶活性，在 pH 4-8范围内孵育 4 h仍保留 50%以上的活性；HIS-Lac1338对 Cu2+抗性强，
Ca2+、Na+、K+对 HIS-Lac1338有促进作用，而 Co2+、Fe2+、Hg2+、Ag+等重金属离子对 HIS-Lac1338有抑制作用。易错 PCR方法得
到的 Lac1338的突变酶 Lac16与 HIS-Lac1338相比，对酸性紫 7、溴酚蓝、考马斯亮蓝的降解率分别由 10.9%、20%和 25%提高到
90.5%、67.8%和 85%。结果表明，HIS-Lac1338具有较好的温度及 pH稳定性，而通过易错 PCR技术定向突变获得的突变酶 Lac16
的染料降解率大大提高。
关键词 ： 漆酶；克隆表达；酶学性质；定向进化；染料降解
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.025
Determination of Enzymatic Properties of a Laccase Lac1338，and
Effects of Directed Mutants on the Degradations of Different Dyes
ZHANG Xue-ling CHEN Xiao-li LI He
（Department of Biochemistry & Molecular Biology，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutial University，Guangzhou 510006）
Abstract: In order to obtain the laccase with high expression and high thermal stability，a laccase gene lac1338 synthesized was cloned
by codon optimization，ligated to the vector pET-32a（+），then expressed in Escherichia coli BL21（DE3），and the recombinant protein
HIS-Lac1338 was obtained. Its enzymatic properties showed that while using ABTS as a substrate，the specific activity of HIS-Lac1338 was
up to 22.8 U/mg，Km and Vmax of HIS-Lac1338 was 567 μmol/L and 2.8 mmol/（min·g protein），respectively. The optimal temperature
and pH of HIS-Lac1338 were 55℃ and 6.0 respectively. Its activity remained 50% at 55℃ for 2 h and in the pH range of 4-8. HIS-Lac1338
was strongly resistant to Cu2+，while its activity was promoted by Ca2+，Na+，K+ and inhibited by heavy metal ions such as Co2+，Fe2+，Hg2+，
Ag+，etc. Comparing with HIS-Lac1338，mutant enzyme Lac16 of Lac1338 by sequential error-prone PCR improved the degradation rates of
Acidviolet 7，Bromophenol blue，and Coomssie brilliant blue from 10.9%，20%，and 25% to 90.5%，67.8%，and 85%，respectively.
Above results reveal that HIS-Lac1338 is stable to temperature and pH，the degradation rate of dye increases greatly with the mutant enzyme
Lac16 via directed evolution of sequential error-prone PCR.
Key words: laccase ；cloning and expression ；enzymatic properties ；directed evolution ；degradation to dyes
2016,32(7) 171张雪玲等：漆酶 Lac1338 的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料影响
漆酶最早是从日本的漆树汁中发现的［1］，它是
人类研究最早的酶之一，属于多铜氧化酶家族中的
一大类，可利用分子氧通过自由基催化反应来氧化
各种芳香族和非芳香族化合物，在植物、真菌、细
菌中广泛存在，但至今人们对于这种酶的认识比较
有限［2］。近年来随着漆酶功能的逐步发现，漆酶的
研究受到普遍重视，它在降解木质素方面的功能，
使其在制浆造纸工业，特别是纸浆生物漂白方面得
到深入的研究和开发［3，4］；在生物能源的开发利用
方面应用也很广泛，如利用漆酶降解木质纤维原料
中的木质素，提高纤维素水解成单糖的效率及生产
乙醇等新能源［5］；在环保方面亦具有较大的应用潜
力，如可去除有毒的非酚类［6］、除草剂、杀虫剂［7］
及合成有机物［8，9］石油工业废物等物质的毒性。
我们利用密码子最优化方法合成的漆酶基因
lac1338，通过原核表达获得了表达量高、热稳定性
较好的漆酶 HIS-Lac1338，并且该漆酶能够降解多
种染料，但是其比酶活相对较低，对染料的降解率
也较低，这一定程度上限制了该漆酶的应用。因此，
提高漆酶的酶活力及其降解环境污染物的能力具有
重要的意义，不仅可扩宽漆酶的工业应用范围，而
且可进一步深入研究其结构与功能之间的关系。
本研究首先对漆酶 HIS-Lac1338 的酶学性质进
行研究，并且拟通过易错 PCR（error-prone PCR）的
定向进化策略对该漆酶基因 lac1338 进行改造，以
酶活力为筛选指标，以获得漆酶活性提高的突变株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 和 质 粒 重 组 质 粒 pUC118-lac1338
（GenBank，登录号 HM623889）为本实验室构建并
保 存，pET-32a（+） 及 Escherichia coli BL2l（DE3）
为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、
PCR 产物回收试剂盒购于 Omega ；蛋白纯化试剂盒
购 于 德 国 Novagen 公 司 ；170 kD Prestained Protein
Ladder 购自广州赛哲生物科技有限公司 ；2，2’- 连
氮 - 双（3-乙 基 苯 并 噻 唑 -6-磺 酸 ）（ABTS） 购 于
Amresco 公司；IPTG、氨苄青霉素购自 TaKaRa 公司。
突 变 试 剂 盒 Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit
购自 Clontech 公司。其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 漆酶基因 lac1338 的克隆及重组质粒构建
1.2.1.1 lac1338 的 PCR 扩增 根据 lac1338 的基因
序列，使用 Premier 5 软件设计引物对。lac1338-F ：
5-CCG GAA TTC ATG CGC AAA AGT CCC GGA GTC
ACT TTT TCA -3（下划线部分为 BamH I 酶切位点）；
lac1338-R ：5-AGC AAG CTT TCA GTC GGG CAT
GTT GGG GAT TTC AGG -3（下划线部分为 Hind III
酶切位点）。以提取的质粒 pUC118-lac1338 为模板，
进行 PCR 扩增，反应条件 ：94℃ 30 s ；94℃ 10 s，
55℃ 5 s，72℃ 9 s，共 30 个循环 ；72℃ 5 min。PCR
产物经普通 PCR 试剂盒回收。
1.2.1.2 lac1338 基因重组表达菌株的构建 使用
限 制 性 内 切 酶 Hind III 和 BamH Ⅰ 双 酶 切 PCR 产
物，并连接到表达载体 pET-32a（+）的 Hind III 和
BamH Ⅰ位点上，转化到 E. coli BL21（DE3）。筛选
阳性克隆进行酶切验证，并送样测序。
1.2.2 漆酶 Lac1338 的表达纯化
1.2.2.1 漆酶基因 lac1338 在 E. coli BL21 中的诱导
表 达 将 重 组 质 粒 pET-32a-lac1338 转 化 入 E. coli
BL2l（DE3）感受态细胞，挑选阳性克隆，37℃ 培
养 过 夜。 按 1% 的 接 种 量 接 种 于 100 mL（ 含 100
mg/L 氨苄青霉素）的 LB 培养基中，置于 37℃、200
r/min 下振荡培养至 OD600 达到 0.8 左右。加入终浓
度 0.2 mmol/L 的 IPTG 及 0.5 mmol/L 的 Cu2+， 置 于
30℃、200 r/min 振荡培养 16 h。4℃、4 500 r/min 离
心 15 min 收集菌体。冰浴进行超声波破碎细胞（振
幅设为 300 W ；超声循环为 ：超声 5 s，间隔 5 s，时
间设为 4 min）；4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分
别取上清和沉淀煮沸 5-10 min ；4℃、12 000 r/min
离心 10 min，进行 SDS-PAGE 电泳检测（浓缩胶为
5%，分离胶为 10%）。
1.2.2.2 漆 酶 Lac1338 的 纯 化 参 见 His·Bind®
Purification Kit（Novagen）试剂盒说明书。
1.2.3 HIS-Lac1338 的酶学性质研究
1.2.3.1 温度对酶活力的影响 （1）最适温度 ：取
10 μL 一定浓度的纯化后酶液，在 35-80℃范围内，
每隔 5℃测定酶活，以最高酶活为 100％，计算相对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7172
酶活。（2）温度稳定性 ：取一定量的纯化后的酶液，
分别于上述温度孵育 120 min，当温度恢复到室温时
于 55℃下测定酶活力，并计算其相对酶活，以 4℃
保存的酶液酶活为 100%。
1.2.3.2 pH 对酶活力的影响 （1）最适 pH ：取 10
μL 一定浓度的纯化后酶液，分别于不同 pH 的 Britt-
on-Robinson 缓冲液中，55℃测定其酶活力，并计算
其相对酶活，以酶活力最高者为 100%。（2）pH 稳
定性 ：将酶液置于不同 pH 的 Britton-Robinson 缓冲
液下于室温中放置 4 h，随后在最适 pH，最适温度
条件下测定其酶活，以未处理的酶样酶活为 100％，
计算其相对酶活。
1.2.3.3 金属离子及有机物对酶活力的影响 （1）
Cu2+ 对漆酶酶活的影响 ：在不同浓度的 Cu2+ 离子存
在条件下，测定漆酶的活性，并以酶活力最高者为
100%，计算相对酶活。（2）其他金属离子对酶活性
的影响 ：在柠檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）及 1
mmol/L 和 100 mmol/L 的金属离子存在条件下，测定
漆酶的活性，计算相对酶活。对照样品为不含金属
离子的酶反应液。（3）几种化合物对酶活性的影响：
在 1 mmol/L 或 100 mmol/L 的所研究化合物存在条件
下，测定漆酶的活性，并计算相对酶活。对照样品
为不含所研究化合物的酶反应液。
1.2.3.4 HIS-Lac1338 酶促反应动力学参数测定 米
氏常数 Km 和最大速度 Vmax 的测定 ：以 ABTS 为底物，
在不同底物终浓度（0.2、0.4、0.5、0.8、1.0 和 2.0
mmol/L）的反应体系中反应，测定其 OD405 值以计
算酶反应的初速度，作 Lineweaver-Burk 双倒数图。
1.2.4 酶活力测定及蛋白质浓度测定
1.2.4.1 酶活力测定 以 ABTS 为底物，使 3 mL 柠
檬酸 - 柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）的反应体系中含 5
mmol/L ABTS、6 mmol/L Cu2+ 和一定浓度的酶液样品，
将其混合均匀后于 55℃水浴反应 3 min，测 OD405
值，同时做不加酶液的空白对照。该条件下，每分
钟催化 1 μmol ABTS 氧化所需的酶量定义为 1 个酶
活 单 位（U）。U=（0.1844×OD405）×V1×N/V2×t。
y=0.1844x 为 ABTS 自由基浓度与吸光度值的关系曲
线［10］；V1 ：反应总体积 ；V2 ：测定酶活时所取的酶
液体积 ；N ：酶液稀释倍数 ；t ：反应时间。
1.2.4.2 蛋白浓度测定 以牛血清白蛋白（BSA）为
标准，采用 BCA 法测定［11］。
1.2.5 lac1338 的定向突变 以 lac1338 为模板，按
照 Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit 说 明 书 进
行易错 PCR，选择 2.3 bp/kb 的突变率，反应体系 ：
PCR Grade Water 39 μL，10× TITANIUM Taq Buffer
5μL，MnSO4（8 mmol/L）1 μL l，dGTP（2 mmol/L）
1 μL，50× Diversify dNTP Mix 1 μL，Primer mix 各
1 μL，Template DNA（~1 ng/μL）1 μL，TITANIUM
Taq Polym 1 μL。 反 应 条 件 ：94℃ 30 s ；94℃ 30 s，
68℃ 90 s，25 个循环 ；72℃ 5 min。将易错 PCR 产
物克隆并构建到表达菌株 E. coli BL21（DE3）中表达，
筛选产酶量更高，所产酶更耐高温、更耐碱、染料
降解率更高的突变酶［12］。
1.2.6 HIS-Lac1338 与 Lac16 对染料的降解比较 本
研究考察 HIS-Lac1338 及突变酶 Lac16 对多种工业
染料（苋菜红、靛红、溴酚蓝、酸性紫 7、结晶紫、
橙红 G、刚果红、罗丹明 B、亚甲基蓝及考马斯亮
蓝 G250）的降解作用。以不加酶液为空白对照，
37℃摇床过夜（16 h），并同时考察 Ca2+ 与小分子介
体 ABTS 对降解率的影响。
降解率 I=（A0-A1）A0×100%，其中，I：降解率；
A0 ：空白对照染料的光吸收值 ；A1 ：反应体系样品
染料的光吸收值。
1.2.7 突 变 株 三 维 结 构 模 拟 在 PHYRE2（http://
www.sbg.bio.ic.ac.uk/）中输入目的蛋白的氨基酸序列，
预测的结构及 PDB 文件便输入邮箱。用 Pymol 软件
打开 PDB 文件，并标注突变位点。根据预测的结构
信息，结合突变酶酶学性质与野生型酶对比，分析
其位点突变效应。
2 结果
2.1 漆酶基因lac1338的克隆及表达菌株的构建
通过 PCR 方法扩增出 1 338 bp 的 lac1338 基因
（图 1），将其成功连接到 pET-32a 上，重组质粒被
命名为 pET-32a（+）-lac1338 上。将重组质粒转化
入 E. coli BL21（DE3）感受态细胞中。随机挑取 9
个转化子进行菌液 PCR 初步验证转化是否成功。从
图 2 可以看出转化子 1、2、4、8 和 9 菌液 PCR 成
功，扩增出了目的条带，可以初步认为菌落 1、2、4、
8 和 9 转化成功，提质粒酶切进一步验证，如图 3。
2016,32(7) 173张雪玲等：漆酶 Lac1338 的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料影响
双酶切得到 1 338 bp 左右和 5 900 bp 左右的两条带，
分别是目的基因与空线性质粒 pET-32a（+），证明
目的基因已成功连接到表达载体上。选取连接正确
的转化子做下一步研究。
2.2 漆酶Lac1338的表达及粗酶纯化
SDS-PAGE 分析（图 4）表明，经过 IPTG 诱导
后的重组菌在低于 30℃条件下有明显的可溶性重
组 蛋 白 表 达。 粗 酶 液 经 His·Bind® Purification Kit
（Novagen）纯化，产物进行 SDS-PAGE 检测，见图 5。
纯化后的重组漆酶 HIS-Lac1338 为单一的条带，分
子量约为 68 kD （其中 18 kD 为表达载体上的融合蛋
白标签），与理论预测蛋白分子量相同。用 BCA 法
测得纯化后的蛋白浓度为 0.25 mg/mL。
kb
15
10
7.5
5
2.5
1.0
0.25
1.3
kb
3 2 1 M
M ：DL15 000 Make ；1-3 ：lac1338 的 PCR 产物
图 1 lac1338 的 PCR 扩增产物的电泳分析
3456789 2 1 M
2000
bp
1000
750
500
250
100
M ：Marker ；1-9 ：随机挑选的 9 个转化子
图 2 转化子菌液 PCR 电泳分析
5900
2000
1000
bp
7200
1300
bp
M221M1
M1 ：DL 2000 ；M2 ：DL 15000 ；1 ：被 Hind III 和 BamH I 双酶切的重组质粒 ；
2 ：被 Hind III 酶切的重组质粒
图 3 重组质粒 pET-32a-lac1338 的酶切验证
kD
170
130
100
70
55
M 1 2 3 4 5 6 7 8
1、3、5 和 7 ：分别为悬浮蛋白在 20、25、30 和 35℃下的表达量 ；2、4、6
和 8 ：沉淀蛋白在 20、25、30 和 35℃下的表达量
图 4 重组漆酶 HIS-Lac1338 的最佳诱导培养温度
kD
170
130
100
70
55
M 1 2 3
图 5 纯化后重组漆酶 HIS-Lac1338 的 SDS-PAGE 电泳
2.3 HIS-Lac1338的酶学性质研究
通 过 在 35-80℃ 范 围 内 的 酶 活 测 定，HIS-
Lac1338 的 最 适 反 应 温 度 为 55℃（ 图 6）， 在 35-
55℃ 经 2 h 处 理， 酶 活 仍 保 持 50 ％ 以 上 ；HIS-
Lac1338 的最适 pH 为 6.0，且在 pH4-8 之间经 4 h
的处理仍然保存 50％以上的酶活（图 7）。总体来
看，HIS-Lac1338 有较好的 pH 稳定性和热稳定性，
能够在高温下发挥相对高的酶催化活力。如图 8 所
示，随着 Cu2+ 浓度增加，酶活性不断提高，当 Cu2+
浓度达到 6.0 mmol/L 时，酶活力最高 ；而当 Cu2+ 浓
度 大 于 6.0 mmol/L 时， 酶 活 性 不 断 降 低， 呈 一 种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7174
不对称的钟形结构。由表 1 可以看出，100 mmol/L
的 Ca2+、Na+ 和 K+ 对其活性有着一定程度的激活
作用 ；100 mmol/L 的 Mn2+ 对其活性有 80% 以上的
抑制作用，Co+、Fe2+、Hg+ 和 Ag+ 对其活性完全抑
制 ；而 Mg2+ 在低浓度与高浓度对其活性影响都不
大。 由 表 2 可 知，100 mmol/L 的 EDTA 及 SDS 对
其活性完全抑制，高浓度与低浓度的尿素和 DMSO
的 对 其 活 性 抑 制 作 用 差 别 不 大。 根 据 Michaelis-
Menten 方 程 v= Vmax·［s］/Km +［s］ 的 变 形 方 程
1/v= Km/Vmax·1/［s］+1/Vmax， 通 过 双 倒 数 作 图
法，测得反应的 Km 和 Vmax 分别为 567 μmol/L 和 2.8
mmol/（L·min·g）。
2.4 酶活力测定蛋白质浓度测定
根据 ABTS 自由基吸光度与浓度关系曲线，测
出吸光度并计算得酶活力为 5.7 U/mL。由 BCA 法
测得纯化后蛋白浓度为 0.25 mg/mL，所以比酶活为
22.8 U/mg。
2.5 lac1338的定向突变
用电转化方法获得突变文库后，用功能筛选
30 40 50 60 70
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Activity of HIS-Lac1338
Stability of HIS-Lac1338
Temperature/ćRelative activity/%
图 6 温度对 HIS-Lac1338 的酶活力和热稳定性的影响（以
ABTS 为底物）
4 5 6 7 8 9 10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Activity of Lac1338
Stability of Lac1338
pH
R
el
at
iv
e A
ct
iv
ity
/%
图 7 pH 对 HIS-Lac1338 的酶活力和稳定性的影响（以
ABTS 为底物）
0 10 20 30 40
0
20
40
60
80
100
R
el
at
iv
e
ac
tiv
ity
/%
Cu2+mmol·L-1
图 8 Cu2+ 对 HIS-Lac1338 酶活性的影响（以 ABTS 为底物）
表 1 不同金属离子对 HIS-Lac1338 酶活性的影响
金属离子 相应的盐
相对酶活 /%
1 mmol/L 100 mmol/L
对照 对照 100 100
Ca2+ 氯化钙 93.98±2.2 109±2.8
Mn2+ 氯化锰 26.3±2.1 18.8±1.2
Mg2+ 氯化镁 105.6±2.4 83.95±3.2
Co2+ 氯化钴 118±1.9 0
Fe2+ 硫酸亚铁 112±2.1 0
Na+ 氯化钠 99.4±2.4 120.4±2.1
K+ 氯化钾 104±2.1 121±2.1
Hg2+ 氯化汞 25.6±1.2 0
Ag+ 氯化银 11.5±0.9 0
表 2 不同化合物对 HIS-Lac1338 酶活性的影响
抑制剂
相对酶活性 /%
1 mmol/L 100 mmol/L
对照 100 100
EDTA 61.3±1.2 0
尿素 67.7±2.3 48.39±2.3
二甲基亚砜 87.1±1.9 83.87±2.2
SDS 37.03±1.3 0
2016,32(7) 175张雪玲等：漆酶 Lac1338 的酶学特性测定及定向突变对其酶解染料影响
法［13，14］获得一株比野生型酶活提高 1.6 倍的菌株，
命名为 lac16，表达蛋白命名为 Lac16。测序表明菌
株 lac16 的碱基与野生型相比有 3 个碱基发生了突
变，相应的氨基酸变化为 ：72 位的苯丙氨酸突变为
亮氨酸（UUA-CUA），75 位的苯丙氨酸突变为亮氨
酸（UUA-CUA），290 位的谷氨酰胺突变为精氨酸
（CAA-CGA）。
2.6 Lac16与HIS-Lac1338对染料的降解比较
HIS-Lac1338 对 6 种染料的降解效果（图 9）显示，
ac16 与野生型相比，突变后对酸性紫 7 的降解率大
大提高，由 10.9% 升高到 90.5% ；对溴酚蓝的降解
率也由 20% 升高到 67.8% ；对考马斯亮蓝的降解率
由 25% 提高到 85% ；对苋菜红的降解率由 13.7% 提
高到 14.5% ；对刚果红和靛红的降解率无明显改善。
可见通过易错 PCR 技术获得功能增强的突变酶是可
行的。
β - 绳带排成 β-折页形成所谓的希腊图状）拓扑构
型。对比突变酶和野生型漆酶 Lac1338 的氨基酸序
列，突变位点（图中紫色所示）V278A、P310L 和
S315G 距离漆酶的活性中心较远，位于漆酶蛋白的
表面或环状区域，相应的碱基变化为 GAU → GCU、
CCG → CUG、AGC → GGC。
3 讨论
本研究中的 lac1338 是通过密码子最佳化方法
合成的，这一方法的最大优点是可以使蛋白得到高
水平表达，同时我们优化了表达条件，使得该蛋白
表达量为目前报道的最高表达量。通过定向进化得
突变的 Lac16 漆酶蛋白。研究表明，突变酶较野生
型酶 HIS-Lac1338 在对染料的降解种类及降解率上
都有所改进，表明通过定向进化的方法获取更具工
业应用价值的突变酶是可行。利用某种生物的偏爱
密码子，避免利用率低的或稀有密码子合成基因，
进行基因的重新设计叫密码子最佳化。散在分布的
稀有密码子对翻译效率有负面效应，消除稀有密码
子、去除去稳定序列、重新设计合成基因，都可能
增加蛋白产量，使得蛋白生产更有效和经济。本研
究中的 lac1338 即利用密码子最佳化方法合成而来，
研究表明其表达量为目前已知的最高表达量，对其
酶学性质及染料降解作用还需作进一步探索，并通
过定向进化方法获得染料降解率更高的突变酶。
酶的定向进化是指不需事先了解酶的空间结构
和催化机制，而是人为地创造特殊的进化条件，模
拟自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，并定
Am
ara
nth
Ac
idv
iol
et7
Co
ng
o r
ed
Br
om
op
he
no
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Co
om
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Isa
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120
100
80
60
40
20
0
Pe
rc
en
ta
ge
/%
HIS-Lac1338
Lac16
图 9 野生型酶 HIS-Lac1338 和突变型漆酶 Lac16 对不同
染料的降解情况比较
2.7 突变株三维结构模拟
将突变酶和野生型漆酶的氨基酸序列提交到
phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/）蛋白质在线分析
服务器，模拟其三维结构并用软件 pymol 标出结构
中的铜原子及突变氨基酸。结果（图 10）显示，该
酶以单亚基蛋白的形式存在，整个单体分子由 3 个
杯 状（Cupredoxin-like） 结 构 域（Domain 1、2、3）
组成，相应的分成 3 区，每区均具有 β - 圆桶状（由
图 10 突变酶 Lac16 的三维结构模拟图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7176
向筛选、获得具有某些预期特征的进化酶［15］。利
用易错 PCR（Error prone PCR）或 DNA 改组（DNA
shuffling）对酶分子编码基因进行定向进化，可获得
催化效率提高的酶蛋白，并改善酶的一系列性质，
如稳定性［16，17］、底物特异性［18］等，是蛋白质工程
的重要研究工具。易错 PCR 是指通过改变 PCR 的
反应条件，如调整反应体系中 4 种 dNTP 的浓度、
增加 Mg2+ 的浓度、加入 Mn2+ 或使用低保真度的 Taq
酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突
变，构建突变库，筛选出所需的突变体。
ABTS 等小分子介体不仅能增强漆酶对染料的
降解效率，而且能介导漆酶和非酶底物染料之间的
氧化作用，使得漆酶能降解非漆酶底物的染料［19］，
例如偶氮类染料不是漆酶的底物，大部分的漆酶
则不能直接降解此类染料［20］，但 HIS-Lac1338 在
ABTS 及 Ca2+ 协同作用下能完全降解偶氮类染料罗
丹明 ；对酸性紫 7 及苋菜红降解率很小，对橙黄 G
无降解作用 ；在靛系染料中，只能降解靛红，而不
能降解靛蓝，其原因可能是基团结构的差异性影
响了漆酶 HIS-Lac1338 对其降解效果［21］。突变酶
Lac16 的突变位点都是同类性质氨基酸的替换，如第
72 氨基酸位点，由非极性氨基酸苯丙氨酸突变成非
极性氨基酸亮氨酸 ；第 290 氨基酸位点，由极性氨
基酸谷氨酰胺突变成精氨酸，这些位点有可能参与
维持漆酶催化氧化所需的蛋白空间构像，而同类氨
基酸的替换可维持该空间构像［22］，在接下来的工作
中我们将结合该漆酶蛋白的三维结构及其生物信息
学进一步探索突变碱基对其性质改变的原因。Miele
等［23］通过定向进化提高糙皮侧耳（P. ostreatus）漆
酶 POXA1b 的酶活性，进而提高了该漆酶对酸性
黄 49、 酸 性 红 266 及 直 接 黄 106 染 料 的 降 解 率 ；
Koschorreck 等［24］研究发现，通过提高地衣芽胞杆
菌（B. licheniformis）的漆酶 CotA 的酶活性，可增
强该漆酶对茜素红 S、亮蓝 R 和靛红等染料的降解
效果。
4 结论
本研究中，与野生型漆酶 HIS-Lac1338 相比，
酶活力提高的突变酶 Lac16 对酸性紫 7、考马斯亮蓝、
溴酚蓝和苋菜红等染料的降解率也得到一定的提高，
结果表明通过易错 PCR 的定向进化技术获得的酶活
力提高的突变酶，其对环境污染物的降解能力也会
得到提高，所以下一步我们希望通过筛选酶活力更
高的突变菌株，得到降解染料能力更强的菌株。
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（责任编辑 狄艳红）