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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):178-183
漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，
能够氧化多种芳香化合物和其他有机化合物，并使
氧气还原生成水［1］。漆酶分布广泛，存在于植物［2］、
昆虫［3］、真菌［4］和细菌［5］中，其中真菌漆酶的研
究较为深入，而且在真菌中的表达量较高。但细菌
来源的漆酶对热、卤素和碱的稳定性好，最适 pH
收稿日期 ：2015-09-02
基金项目 ：国家“863”计划项目（2013AA102804）
作者简介 ：岳青霞，女，硕士，研究方向 ：应用微生物与微生物工程 ；E-mail ：hpuyqx@163.com
通讯作者 ：田健，男，博士，研究方向 ：蛋白质结构模拟、蛋白质分子设计与改良及微生物重要基因或元件资源挖掘 ；
E-mail ：tianjian@caas.cn
漆酶 N 端融合 His-tag 或 S-tag 标签促进其在大肠杆菌
中可溶性表达
岳青霞1，2  张丽洁2，3  田健2  伍宁丰2  姚冬生1
（1. 暨南大学生命科学技术学院，广州 510632 ；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081 ；3. 河北农业大学生命科学学院，保定
071001）
摘 要 ： 来源于地衣芽孢杆菌的漆酶具有催效率高，底物范围广等优点在工农业等领域具有重要的应用前景，但该酶在外
源基因表达系统中的表达量低，影响了其在工农业等领域的应用。His-tag 和 S-tag 两种标签由于具有分子量小，且一般不影响外源
蛋白性质等特点，在外源蛋白的纯化和检测中具有重要的应用。本研究发现将来源于地衣芽孢杆菌的漆酶 CotA 的 N 端融合 His-
tag 或 S-tag 构建于 pET-22b 载体，并转化大肠杆菌 BL21（DE3）后可以显著提高其在大肠杆菌中的可溶性表达量，其表达量较 N
端无融合标签的构建，His-tag 可提高漆酶表达量约为 37 倍，S-tag 约可提高 20 倍，His-tag 与 S-tag 共作用约可提高 28 倍。
关键词 ： 漆酶 ；His-tag ；S-tag ；高效表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.028
Promotion of Soluble Expression of Laccase in Escherichia coli by
Fusion of His-tag or S-tag on the N-terminal of It
YUE Qing-xia1，2 ZHANG Li-jie2，3 TIAN Jian2 WU Ning-feng2 YAO Dong-sheng1
（1. College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632 ；2. Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of
Agricultural Sciences，Beijing 100081. 3. College of Life Sciences，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001）
Abstract: Laccase from Bacillus licheniformis has the advantages of high catalytic efficiency，wide range of substrates，etc.，thus
it owns the broad application prospect in industrial and agricultural fields. However，the expression level of the enzyme in the foreign gene
expression system is low，which greatly limits its application in the agricultural and industrial fields. His-tag or S-tag is the small peptide with
low molecular weight and usually can not affect the characteristics of heterologous fusion protein，and they are beneficial to be applied in the
purification and detection of heterologous proteins. In this study，fusion of His-tag and/or S-tag on the N-terminal of the laccase CotA from B.
licheniformis was constructed into pET-22b vector，and the vector was transferred into Escherichia coli BL（DE3），then we found that the
soluble expression level of laccase significantly increased in E. coli BL（DE3）. Compared with the construction without no fusion of any tags on
N-terminal，the expression level with His-tag was about 37 folds，20 folds with S-tag，and 28 folds with both His-tag and S-tag，respectively.
Key words: laccase ；His-tag ；S-tag ；high expression
2016,32(3) 179岳青霞等：漆酶 N端融合His-tag 或 S-tag 标签促进其在大肠杆菌中可溶性表达
范围广泛，这些优点都是真菌漆酶所无法比拟的。
来源于地衣芽孢杆菌的漆酶 CotA（GenBank 登录号：
AGT45479.1）自 2001 年被首次发现后，逐渐引起人
们的重视。虽然细菌来源的漆酶具有很大的潜在应
用价值，但其在外源基因表达系统中的表达量仍是
亟待解决的关键问题。
大肠杆菌因其具有遗传背景清楚，技术操作
和培养条件简单，大规模发酵经济等优点而倍受关
注，同时大肠杆菌也是目前应用最广泛的表达系
统。但是该系统也存在一定的局限性，外源蛋白在
表达过程中易形成包涵体，且包涵体的复性困难。
因此，通过对靶蛋白的修饰，如对目的基因进行定
点突变［6］，控制培养基成分［7］ 及 Cu2+ 浓度［8-10］，
添加标签等可以提高目的蛋白的可溶性表达。目前
常 用 的 融 合 标 签 包 括 ：SUMO［11］（small ubiquitin-
like modifier）、S-谷 胱 甘 肽 转 移 酶［12］（glutathione
S-transferase，GST）、 多 聚 组 氨 酸［13］（His-tag）、
Flag-tag［14］、 麦 芽 糖 结 合 蛋 白［15］（maltose binding
protein，BMP）、c-myc-tag［16］、eGFP 和 S-tag［17］等。
His 标签是一种非常普遍的用于纯化蛋白的标
签，该标签分子量小，虽然带有 His 标签的蛋白
的衍射图谱与天然蛋白稍有差异［18］，但对目的蛋
白 的 活 性 几 乎 无 影 响。1975 年，Porath 等［19］ 提
出 固 定 化 金 属 亲 和 层 析（Immoilized metal affinity
chromatography，IMAC），它的基本原理是固定在基
质中的过渡金属元素（Co2+、Ni2+、Cu2+ 和 Zn2+）和
特殊氨基酸侧链间的相互作用。S-tag 由 15 个氨基
酸组成，其作用原理是这 15 个氨基酸与 103 个 S-蛋
白发生强烈的相互作用。它包括 4 个带正电，3 个
带负电，3 个极性不带电和 5 个非极性氨基酸组成，
这些氨基酸使得 S-tag 具有可溶性。
本实验将系统的研究漆酶 N 端的 His-tag 或 S-tag
对其在肠杆菌中可溶性表达的影响，旨为其应用及
工业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 与 试 剂 大 肠 杆 菌（Escherichia coli）
BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）
公司，pET22b-CotA-BL 为本实验室保存。ABTS（2，
2- 联氨 - 双（3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸）二胺
盐）购自 Sigma 公司，T4 DNA 连接酶和限制性内切
酶（Nde I、Nco I）购自 New England Biolabs（NEB）
公司，dNTPs、DNA 聚合酶购自天根生化科技（北
京）公司，DNA 纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒购
自 Axygen 公司，其他试剂为国产分析纯，购自北京
化学试剂公司。
1.1.2 培养基 LB 培养基 ：酵母浸取物 5 g/L，蛋
白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L。
1.2 方法
1.2.1 His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag 序列的克
隆 His-tag 和 S-tag 为短序列，参考 pET 系列表达
载体上的序列设计引物，His-tag 引物为 His-tag-F：5-
ATACATATGCATCACCACCACCATCACGGTGGCGC-
CATGGATA-3 和 His-tag-R ：5- TATCCATGGCGCC-
ACCGTGATGGTGGTGGTGATGCATATGTAT-3，引物
两端引入 Nde I 和 Nco I 酶切位点 ；两个 Gly 序列的
引物为 ：2Gly-F ：5-ATACATATGGGTGGCGCCATG-
GATA-3 和 2Gly-R ：5- TATCCATGGCGCCACCCAT-
ATGTAT-3 引物两端同样引入酶切位点 Nde I 和 Nco
I。S-tag 引物为 S-tag-F ：5- ATACATATGAAAGAAA
CCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGAC
AGCGGTGGCCCATGGATA-3 和 S-tag-R ：5- TATCC
ATGGGCTGTCCATGTGCTGGCGTTCGAATTTAGCAGC
AGCGGTTTCTTTCGCCACCATATGTAT-3，引物两端
引入 Nde I 和 Nco I 酶切位点，His-tag-F、His-tag-R
以及 S-tag-F、S-tag-R 用 NEB 3 号 buffer 溶解后各取
5 μL 混匀，两条引物互为模板进行扩增。PCR 条件
为 ：94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，68℃退火 30
s，每个循环退火温度降低 1℃至退火温度为 50℃，
退火温度降为 50℃后循环 11 次。His-tag+S-tag 超过
100 bp，依据 pET-30a（+）设计引物进行扩增，引
物 为 His+S-F ：5-ATACAT-ATGCACCATCATCAT-3
和 His+S-R ：5-ATACCATGGCCTTGTCGTCGT-3，
同样在其产物两端引入 Nde I 和 Nco I 酶切位点。以
pET-30a（+） 为 模 板 进 行 扩 增， 扩 增 体 系 为 ：模
板 1 μL，dNTPs 4 μL，10 mmol/L His+S-F、His+S-R
各 5 μL，Fast Pfu polymerase 1.5 μL，5×Fast Pfu
polymerase buffer 10 μL，H2O 23.5 μL。扩增条件为 ：
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3180
94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，
72℃延伸 30 s，共 30 个循环，72℃延伸 10 min。
1.2.2 His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag 分 别 与
pET22b-CotA-BL 重 组 载 体 的 构 建 将 扩 增 的 His-
tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag 及 pET22b-CotA-BL 用
Nde I 和 Nco I 双酶切，其中酶切后的 His-tag、2Gly、
S-tag、His-tag+S-tag 用乙醇沉淀加以回收，酶切后的
pET22b-CotA-BL 经 1% 的凝胶电泳，切胶回收。经
过双酶切后的 His-tag、2Gly、S-tag、His-tag+S-tag 分
别与双酶切后的 pET22b-CotA-BL 连接，转化 BL21
（DE3）感受态细胞，涂布含 100 μg/mL 氨苄青霉素
平板。菌液 PCR 验证阳性克隆子后送测序，测序正
确后进行诱导表达。
1.2.3 重组漆酶的表达 将含有重组质粒的菌株于
平板上划线活化，挑取单克隆至含有 100 μg/mL 氨
苄青霉素的 LB 培养基中，37℃，200 r/min 振荡培养，
将该培养液以 1∶100 的比例转接至 50 mL 含 100
μg/mL 氨苄青霉素的液体培养基中，30℃，120 r/min
培养至 OD600=0.6-0.8 后，加入终浓度为 0.25 mmol/L
的 Cu2+ 和终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，25℃，120 r/min
振荡培养 4 h 后静置诱导 20 h［20］。
诱导后的菌液在 4℃，8 000 r/min 离心 10 min
后，弃上清收集菌体。菌体用 50 mmol/L Tris-HCl
（pH8.0）重悬，冰上超声破碎。破碎后的粗酶液经 4℃，
12 000 r/min 离心后小心地取出上清，进行酶活性的
测定，同时取出少量样品进行 SDS-PAGE 分析。
1.2.4 漆酶酶活的测定 漆酶活性的测定是以 ABTS
（ε420 nm=36 000 L/mol·cm） 为 底 物， 取 750 μL
0.1 mol/L 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液（pH4.5）和
200 μL 5 mmol/L ABTS，二者于 37℃预热 2 min 后加
入 50 μL 重组漆酶粗酶液反应 3 min 后，混合液于
冰水混合物中终止 1 min 后，在 ε420 nm 条件下读
数。漆酶一个酶活力单位（U）定义为：最适条件下，
每分钟催化 1 μmol 底物氧化所需要的酶量。
2 结果
2.1 标签的克隆和重组表达载体的构建
为了研究 His-tag 或 S-tag 对漆酶基因表达的影
响，首先将来源于地衣芽孢杆菌的漆酶通过酶切位
点（BamH I-Xho I）连入载体 pET22b 上。然后分别
将 His-tag、S-tag 及 His-tag+S-tag 通过漆酶上游的酶
切位点（Nde I 和 Nco I）连在表达载体上，为了使
His-tag 或 S-tag 不影响漆酶的功能，在标签的下游引
入两个柔性的甘氨酸。同时也在 Nde I 和 Nco I 之间
构建了一个只有两个甘氨酸的载体，该载体和仅在
pET22b 上连有漆酶的构建一起用来作为阴性对照。
构建过程，见图 1。
2.2 重组漆酶酶活的测定
以 ABTS 为底物，在 pH4.5，37℃条件下测定重
组漆酶的酶活性，结果（图 2）显示，在将 pET-22b
载体上的信号肽替换为 2 个甘氨酸时，两者的酶活
基本相同，但将 His 标签连接于 pET-22b 与漆酶基
因共同表达时，其酶活提高至 2 U/mL，约是没连标
签的 37 倍。此外，当漆酶基因与 S-tag 和 His-tag 与
S-tag 共表达时其可溶性蛋白的量也分别是没连标签
的 20 倍和 28 倍。
2.3 重组漆酶SDS-PAGE分析
从蛋白电泳的结果（图 3）可以看出，融合蛋
白 的 分 子 量 约 为 70 kD，His-tag 与 S-tag 大 小 相 差
不大，融合蛋白的分子量也基本相同，连接有 His-
tag+S-tag 的重组漆酶在基因序列上比连接有 S-tag 的
重组漆酶多出一个 His-tag 序列外还增加了多个限制
性酶切位点以及凝血酶和肠激酶等额外序列，因此
其蛋白的分子量要大于连接有 S-tag 的重组漆酶。相
比于野生型，His-tag、S-tag、His-tag+S-tag 对与漆酶
的可溶性表达均有所提高。
3 讨论
漆酶在大肠杆菌中表达时常因铜离子的耗损导
致其表达量或者酶活降低，Koschorreck 等［21］通过
向培养基中添加铜离子可以部分提高漆酶的酶活，
但是铜离子浓度大于 2 mmol/L 时对菌体的生长产生
抑制作用。细胞内的铜离子的积累不一定能使得漆
酶的铜离子含量增加，进而影响漆酶的表达，因为
细胞内的铜离子并不是以自由离子的形式存在，而
是结合于金属蛋白或者是铜离子伴侣进而将铜离子
传递给目标蛋白［22］。Gunne 等［23］将来源于地衣芽
孢杆菌的漆酶 CotA 与铜离子伴侣 CopZ 在大肠杆菌
BL（DE3）中共表达后，铜离子含量增加了 20%，
酶活相较于野生型提高了 26%。
2016,32(3) 181岳青霞等：漆酶 N端融合His-tag 或 S-tag 标签促进其在大肠杆菌中可溶性表达
由于 His-tag 和 S-tag 的序列中包含有大量的带
电荷的氨基酸，可以非特异的螯合铜离子。而在漆
酶的结构中至少需要 4 个铜离子，因此，在漆酶的
N 端融合表达 His-tag 或 S-tag 可以帮助漆酶在结构
形成之前募集更多的铜离子，而 His-tag 和 S-tag 与
铜离子的结合并不紧密，这些铜离子整合进漆酶的
结构中，并形成正确的结构。因此，在漆酶的 N 端
融合表达 His-tag 或 S-tag 有可能会提高漆酶的可溶
性表达量。
CotA-BL
Nco I
BamH I
Xho If1 orgin
Histag+StagStag 2Gly2Gly2Gly
2Gly
HistagNde I Nco INde I Nco I
Nde I Nco I
Nde I Nco I
Amp
Rcombinant vector
lac I
Nde I
CotA-BL
Nco I
BamH I
Xho If1 orgin
Amp
lac I
pET22bCotABL
6998 bp Nde I
pET22bCotABLHistag+Stag
pET22bCotABLHistag
pET22bCotABLStagpET22bCotABL2Gly
图 1 重组载体的构建
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
La
cc
as
e
ac
tiv
ity
/U·mL-1 
1 2 3 4 5
1 ：CotA-BL（His-tag）；2 ：CotA-BL（2Gly）；3 ：CotA-BL（S-tag）；4 ：CotA-
BL（His-tag+S-tag）；5 ：CotA-BL
图 2 重组漆酶的酶活
100
kD
70
55
40
35
M 1 2 3 4 5 6
M：蛋白质分子质量标准；1：6His-tag 与漆酶 CotA-BL 共表达时破碎上清；2：
2Gly 与漆酶 CotA-BL 共表达时破碎上清 ；3 ：S-tag 与漆酶 CotA-BL 共表达时
破碎上清 ；4 ：His-tag+S-tag 与漆酶 CotA-BL 共表达时破碎上清 ；5 ：CotA-
BL 破碎上清 ；6 ：BL21（DE3）破碎上清
图 3 重组漆酶表达的 SDS-PAGE 分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3182
His-tag 作为蛋白融合标签，在蛋白的纯化中最
为常见，且其分子量小，对于蛋白的活性一般无影响，
有研究称多聚组氨酸的数目及融合部位对融合蛋白
的表达水平及其溶解性有显著影响，当标签长度由
6 个增加到 10 个时反而降低了目的蛋白的表达量［24］。
本研究中多聚组氨酸提高了漆酶的表达量，其可能
的原因是 ：（1）组氨酸作为过渡元素，能够螯合环
境中的铜离子，铜离子作为漆酶的反应中心，在传
递电子和氧化还原作用中发挥重要作用，此外，铜
离子对于漆酶的形成也有影响。组氨酸标签在与漆
酶共表达的过程中可充当铜离子库，为漆酶提供铜
离子，无论是在参与氧化还原反应还是在漆酶的形
成过程中都有重要作用。（2）有研究表明，新生肽
链的聚集速率超过蛋白正确折叠的速率就容易形成
包涵体，连续的 6 个组氨酸降低了新生肽链合成的
速率，使得蛋白能够正确的折叠，减少了肽链的聚集，
从而使可溶性蛋白的量提高。（3）组氨酸自身带正
电荷，使得重组蛋白所带的电荷有所改变，蛋白多
带电荷与所处的溶剂环境相互作用，使重组蛋白可
以稳定存在，防止蛋白的聚集。（4）多聚组氨酸标
签改变了起始部分 mRNA 的二级结构，使核糖体能
够高效结合，从而提高了重组蛋白的表达量。
同样 S-tag 常用于蛋白的检测及纯化，其氨基酸
组成使得自身高度可溶。S-tag 对漆酶可溶性有所帮
助，可能的原因是可溶性标签使得与之融合的可溶
性蛋白的量增加。本研究中，将两者标签联合使用
对漆酶的表达量的提高没有单独使用 His-tag 时效果
好，可能是因为两个标签之间相互作用，影响了可
溶性蛋白的表达。
本研究为金属依赖性酶的可溶性表达提供了新
思路，通过增加能够螯合金属离子的标签的螯合作
用，为蛋白的正确折叠提供金属离子库，同时 N 端
的标签也可以使得重组蛋白的 mRNA 的结构有所改
变，降低折叠速率，降低重组蛋白的降解率等，进
而提高了可溶性蛋白的表达量。但是并不是所有的
蛋白都适合此规律，我们应根据重组蛋白的性质慎
重选择标签，以期达到提高蛋白表达量的目的。
4 结论
通过在地衣芽孢杆菌来源的漆酶 N 端添加 His-
tag、S-tag 以及 His-tag+S-tag，将可溶性漆酶的酶活
分别提高至未融合标签蛋白的 37 倍，20 倍和 28 倍。
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（责任编辑 李楠）