全 文 ：华北农学报·2012，27(6) :38 -42
收稿日期:2012 － 08 － 21
基金项目:吉林大学农学部博士启动基金项目(430505010203) ;长春市科技局国际合作计划项目(2D5070046202)
作者简介:于文全(1973 －) ，辽宁丹东人，副研究员，硕士，主要从事科研管理及植物保护学研究。
通讯作者:杨晓华(1972 －) ，山东单县人 高级农艺师，主要从事核果育种及相关研究。
草原樱桃 PGIP基因的克隆及生物信息学分析
于文全1，刘海荣1，杨晓华1，赵恒田2
(1．黑龙江省农业科学院 牡丹江分院，黑龙江 牡丹江 157041;
2．中国科学院 东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081)
摘要:为了克隆草原樱桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因，并进行生物信息学分析。以草原樱桃叶片基因组为
模板，PGIP基因保守序列设计引物，通过 PCR扩增获得约 1 kb的 DNA片段。序列分析表明，该基因全长 1 193 bp，包
含有 1 个完整的开放阅读框，由 2 个外显子和 1 个内含子构成，外显子总长 990 bp，编码 330 个氨基酸，其编码的氨基
酸序列中含有一段典型的亮氨酸重复序列，GenBank登录号为 GU068977;该基因与中国李、杏、桃、马哈利樱桃、梅等
李属植物的 PGIP基因序列一致度达 95% ～ 99%。系统进化分析显示，属内亲缘关系较近、属间亲缘关系较远的特
点。克隆了草原樱桃 PGIP基因，为樱桃抗病育种提供一条新的基因资源。
关键词:草原樱桃;PGIP基因;基因克隆;生物信息学
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2012)06 － 0038 － 05
Cloning and Bioinformatic Analysis of PGIP Gene from Prunus caoyuan
YU Wen-quan1，LIU Hai-rong1，YANG Xiao-hua1，ZHAO Heng-tian2
(1． Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agriculture Science，Mudanjiang 157041，
China;2． Northeast Institute of Geography and Agricutural Ecology，Chinese Academy of Sciences，
Harbin 150081，China)
Abstract:Disease resistance mechanism was studied by methods of cloning of the PGIP gene in Prunus ca-
oyuan． A DNA fragment about 1 kb was amplified from the genomic DNA of Prunus caoyuan leaves by PCR with a
pair of specific primers based on the conserved sequences of the PGIP genes of genus Prunus． Sequence analysis
showed that the fragment contains a full coding region of 1 193 bp(GenBank accession:GU068977)． This sequence
had a full open reading frame encoding the PGIP，and eontained two exons interrupted by one intron． The total exons
were comprised by 990 bp of deoxynucleotide encoding 330 amino acid． A conserved leucine-rich fragmenthad exis-
ted in the derived protein sequence． Sequencing analysis showed that it was 95% to 99% identical with the se-
quences of Prunus PGIP genes including P． salicina，P． armeniaca，P． persica，P． mahaleb，P． mume． Phylogenic tree
showed that genetic relationship within the genus was closer and between the genera was farther． A PGIP gene of
Prunus caoyuan was cloned． As a result，a gene resource was provided for molecular breeding of plants．
Key words:Prunus caoyuan;PGIP gene;Gene cloning;Bioinformatic
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(Polygalacturonase-
inhibiting protein，PGIP)是一种富含亮氨酸 LRR 的
蛋白质家族成员之一，能够非竞争性地抑制多种植
物病理性真菌的内聚半乳糖醛酸酶(Polygalactur-
onase，PGs)的酶活性，促进寡半乳糖醛酸酶的增加，
抑制植物细胞壁果胶的溶解，增加植物的抗毒素，激
活植物的防御系统［1 － 2］。因而，PGIP 基因受到国内
外研究者的高度重视并成为抗病虫害基因工程和果
实耐贮藏基因工程研究的重点。
国内外已从大豆［3］、苹果［4］、梨［5］、树莓［6］、
梅［7］、中国李［8］等多种植物基因组中克隆到该蛋
白质的完整基因或部分片段。草原樱桃是东北农
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业大学从前苏联西伯利亚哈巴洛夫斯沙文科园艺
研究所引进，它抗寒、耐旱、抗病能力和适应性都
很强，果实鲜红色，艳丽而富有光泽，果肉橙黄色，
细软多汁，风味甜酸，品质优良，是我国北方寒冷
地区很有栽培前途的樱桃新品种。但由于果实采
后软化迅速，给贮运和加工带来很大的困难，尤其
是交通不便的山区，果实采收后因果实的软化，在
加工前出现品质下降，甚至大量腐烂，给生产带来
很大的经济损失。因此，选育出抗软化和抗病虫
害的草原樱桃品种是急需解决的问题。
本研究以草原樱桃嫩叶为材料，对其 PGIP 基
因进行克隆和测序，旨在为构建植物表达载体，培
育抗病、耐贮樱桃新品种提供基因资源。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
试验于 2008 年 8 月在吉林大学植物科学学院
园艺植物研究室进行。草原樱桃植株的嫩叶采集于
吉林大学植物科学学院实验教学基地。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 草原樱桃基因组 DNA提取 取草原樱桃嫩
叶用 CTAB法提取基因组 DNA，经核酸测定仪和琼
脂糖电泳确认质量和产量后，于 － 20℃保存备用。
1． 2． 2 PCR扩增 根据 GenBank中已发表的 PGIP
基因序列，分析其保守序列后，设计出 1 对引物，5
端引物序列为 5-CGTTCACCCGCAATCACATTTCTT
ATCC-3，3端引物序列为 5-TGGCCGTGGGAATT
ATTTGCAGCTTG-3，引物由上海生工生物工程有限
公司合成。以基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，
反应程序为:94℃预变性 2 min;94℃变性 1 min，
61℃退火 2 min，72℃延伸 2 min，35 次循环;72℃延
伸 10 min，4℃保存。
1． 2． 3 PCR 扩增产物的克隆 PCR 扩增产物经
1%琼脂糖电泳检测扩增结果，用上海华舜试剂盒回
收。回收产物与 pGEM-T Easy 载体连接，连接产物
转化 DH5α感受态细胞，随机挑取抗性克隆，碱裂解
法小批量提取质粒 DNA。然后将酶切以及 PCR 鉴
定后的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司
测序。
1． 2． 4 生物信息学分析 对测定得到的核酸序列
和推导的氨基酸序列分别用 BLASTn 和 BLASTp 进
行相似性搜索，用 DNAMAN 4． 0 绘制序列聚类图。
用 BioEdit软件分析蛋白质疏水性和亲水性;将所测
的 PGIP 序列在 ESyPred3DWeb Server1． 0(http:/ /
www． fundp． ac． be /sciences /biologie /urbm /bioinfo /
esypred /)进行 3 级结构预测，预测结果用 DeepView
(Swiss-Pdb Viewer)v3． 7 SP5 以及 VectorNTISuite
7． 1 软件包中的 3D-Mol进行观察。
2 结果与分析
2． 1 草原樱桃 PGIP基因的克隆
通过 PCR 扩增，从草原樱桃基因组 DNA 中得
到了 1 条目的条带。该片段长度大小约为 1 kb，无
其他杂带(图 1)。
M．分子量标准;CK．空白对照;S． PGIP基因。
M． DNA Marker;CK． DNA blank control;S． PCR amplified fragment．
图 1 PGIP基因 PCR扩增电泳检测结果
Fig． 1 PCR amplification of PGIP gene from Prunus caoyun
2． 2 草原樱桃 PGIP基因测序
将目的片段进行回收纯化后连接到 pGEM-T
easy载体上，转化大肠杆菌 DH5α。挑 5 个白斑菌落
进行 PCR扩增鉴定，依据鉴定结果挑选其中 2 个克
隆进行测序。结果表明，克隆全长为 1 193 bp(图 2)。
2． 3 草原樱桃 PGIP基因的序列分析
核苷酸序列分析表明，该基因序列的实际长度
为 1 193 bp，含有 2 个外显子(41 ～ 578，725 ～ 1 033
bp)和 1 个内含子(578 ～ 725 bp) ，编码 330 个氨
基酸。
利用 BLASTn 将克隆的 PGIP 基因与 GenBank
中登录的序列进行比对，结果表明，草原樱桃 PGIP
基因与马哈利樱桃、桃、杏、梅的 PGIP 基因序列长
度相同，一致度达 96% ～97%，E值均为 0。
利用 DNAMAN软件对获得的基因片段翻译后，
通过 BLASTp对 NCBI的蛋白质数据搜索，结果表明，
该基因的蛋白质序列与梅、桃的一致度达 96% ～
97%，E值分别为 0，表现出极高的一致性。
蛋白质序列分析发现，该蛋白质具有 1 段由 24
个氨基酸残基组成的亮氨酸重复序列(LXXLXX-
LXXLXLXXNXLXGXIPXX) (176 ～ 199 aa 图 2 阴影
部分所示) ，这是多数植物 PGIP 基因编码蛋白特有
的保守序列，也是 PGIP基因与病原真菌 endo-PG相
互发生作用的功能区。
40 华 北 农 学 报 27 卷
核酸序列中的阴影部分为内含子区，氨基酸序列中的阴影部分为亮氨酸重复序列，ATG为起始密码子，TAA为终止密码子。
The intron in the shaded nucleic acid sequence and the leucine-repeated sequence in the
shaded amino acid sequence，ATG indicates the start codon，TAA indicates the stop codon．
图 2 草原樱桃 PGIP基因全长序列和由此推测的氨基酸序列
Fig． 2 Nucleic acid sequence of PGIP gene(upper)and the deduced amino acid sequence(listed below)in Prunus caoyuan
图 3 草原樱桃氨基酸序列的疏水性(A)和亲水性(B)分析
Fig． 3 Analysis of PGIP amino acid sequence hydrophobicity(A)and hydrophilicity(B)from Prunus caoyuan
2． 4 草原樱桃 PGIP基因编码蛋白的功能分析
对草原樱桃 PGIP基因编码的蛋白进行分析发
现，该蛋白含有 330 个氨基酸，包含参与生物组成的
所有氨基酸，相对分子质量为 36 647． 7，等电点为
8． 27。非极氨基酸 136 个占 41． 2%，极性氨基酸占
58． 8%。蛋白质疏水性和亲水性分析结果表明，该
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疏水区域位于蛋白质 N 端，由 27 个氨基酸残基组
成，使草原樱桃 PGIP靶向内膜系统，输出到胞外空
间(图 3)。
2． 5 草原樱桃 PGIP三维结构分析
EsyPred3D预测草原樱桃 PGIP 三级结构结果
发现 13 段 α-螺旋和 24 段 β-折叠，39 个 β-转角，中
心 LRR 结构域由 10 个串联的 LRR 基序组成(图
4) ，与菜豆 PGIP具有类似的结构。
图 4 草原樱桃 PGIP三维结构预测
Fig． 4 Predicted PGIP three dimensional model
from Prunus caoyuan
2． 6 PGIP基因聚类分析
利用 DNAStar软件对草原樱桃 PGIP 基因序列
和 GenBank中收录的含有完整编码区的 6 种果树
的 PGIP 基因核酸序列进行系统进化分析，绘制无
根进化树(图 5)。结果表明，28 条 PGIP 基因序列
大致分为 6 组，来自同一属的聚在一起。第 1 组由
核果类的李属植物构成，草原樱桃首先和梅聚在一
起，之后依次同桃、马哈利樱桃、杏、美洲李和中国李
聚在一起。第 2 组由仁果类的梨属和苹果属植物构
成，第 3 组由草莓属植物构成。这 3 个组都是由蔷
薇科植物构成，首先聚在一起，组成一个大组。第 4
组由芸香科的柑橘属构成。第 5 组由葡萄科的葡萄
属构成，第 6 组由杜鹃花科的越橘属构成。基本表
现出近缘属内亲缘关系较近、远缘属间亲缘关系较
远的特点。草原樱桃虽然属于樱属，但与同属于同
一属的马哈利樱桃距离较远，还有待进一步研究。
图 5 PGIP 基因核苷酸序列聚类结果
Fig． 5 Homology tree of nucleic acid sequence of PGIP gene
3 讨论
本试验克隆到 1 条长 1 193 bp，包含完整阅读
框的核酸序列。该序列的蛋白功能结构分析显示其
具 PGIP基因典型的 LRR 结构域［9］，且同马哈利樱
桃、桃、杏、梅的 PGIP 基因序列长度相同，一致度分
别达 96% ～97%，E值均为 0，因此初步确定为一条
新的 PGIP 基因，并在 GenBank 中登录，登陆号为
GU068977。对苹果［10］、栗子［11］等的研究显示，同一
物种的不同品种 PGIP 在表达量上存在差异，且这
种差异与品种间的抗性强弱密切相关。
在果实采后的成熟和衰老过程中，果实软化是
最为明显的变化。果实软化是影响果实采后贮藏期
长短的主要因素之一。PGIP 是一种特异性结合和
抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)活性的
细胞壁结合蛋白［12 － 13］，促进植物体内寡聚半乳糖醛
酸积累，有效阻断真菌侵染过程和抑制相应病害的
发生［14］。通过过量表达，可以有效地抑制果实软化
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和抵抗真菌侵染。但不同来源的 PGIP，其抑菌效果
存在差异。过量表达梨 PGIP 基因的番茄对抵抗灰
霉病侵染的能力明显增强［15］，而同样过量表达大豆
PGIP基因的抑菌效果却不明显［16］。推测不同来源
的 PGIP对真菌分泌的内切多聚半乳糖醛酸酶的识
别能力存在差异。因此，下一步我们需要进行基因
的功能鉴定，进一步验证此基因是否可以提高果实
耐贮性。
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