全 文 ：新疆农业科学 2016，53(5):845 － 849
Xinjiang Agricultural Sciences
doi:10． 6048 / j． issn． 1001 － 4330． 2016． 05. 009
不同保存方法对天山樱桃总 DNA提取效果的影响
李春侨1，周 龙1，陆 彪2，齐延巧1，盛 芳1
(1．新疆农业大学林学与园艺学院，乌鲁木齐 830052;2. 特克斯县林业局，新疆特克斯 835500)
摘 要:【目的】寻找天山樱桃叶片样品较适合的保存方法，比较研究不同保存方法对天山樱桃总 DNA 提取
效果的影响。【方法】以天山樱桃幼嫩叶片为试验材料，分别采用液氮保存、冷冻保存、干燥保存和微波不同
时间处理后硅胶干燥保存等保存方法，比较分析各保存方法对所提取样品总 DNA质量的影响。【结果】通过
－70℃冷冻保存、室温保存、硅胶干燥保存、微波干燥 2 min保存的样品所提取总 DNA的纯度较高，液氮保存
的样品所提取总 DNA 的完整性好;干燥保存法保存的样品所提取的总 DNA 扩增效果较好。【结论】考虑到
野外采样受到多方面因素的限制，适合天山樱桃分子生物学研究的保存方法为硅胶干燥保存。
关键词:天山樱桃;保存方法;总 DNA
中图分类号:S662. 5 文献标识码:A 文章编号:1001 － 4330(2016)05 － 0845 － 05
收稿日期(Ｒeceived):2015 － 12 － 30
基金项目:国家自然科学基金项目(31260466);新疆维吾尔自治区果树学重点学科资助项目
作者简介:李春桥(1986 －)，男，河南人，硕士研究生，研究方向为分子生物学，(E － mail)lichunqiao3940@ 126. com
通讯作者(Corresponding author):周龙(1976 －)，男，新疆人，副教授，博士，研究方向为果树种质资源与栽培生理，(E － mail)zhoulong2004
@ 126. com
0 引 言
【研究意义】天山樱桃(Cerasus tianschanica
Pojark)又称野樱桃，哈萨克语称其牙，属于蔷薇
科(Ｒosaceae)樱桃属(Cerasus)矮生樱亚属植物。
目前天山樱桃在我国仅分布在新疆伊犁和塔城地
区［1］。对于天山樱桃的研究主要集中在繁殖生
物学特性、植物学特征、花粉萌发特性、组织培养
中的茎段快速繁殖、花芽形态分化等方面，但还未
涉及到天山樱桃分子生物学方面的研究。近年来
对于分子生物学研究多采用分子标记的方法，尤
其从 20 世纪 90 年代以来，基于 PCＲ 的 ＲFLP、
ＲAPD、SSＲ、AFLP 等新的 DNA 分子标记技术层
出不穷，无论采用哪种分子标记技术，都需要获得
较高纯度和浓度的 DNA样品［2］。而提取 DNA的
纯度和浓度与材料保存方法、新鲜程度和提取方
法都有密切联系，研究天山樱桃分子生物学，必须
研究天山樱桃叶片保存方法。【前人研究进展】
目前对于样品保存方法的研究有很多，徐斌等［3］
发现杜鹃红山茶叶片样品采用液氮保存，所提取
样品总 DNA完整性好，纯度高。黄建安等［4］认为
茶树叶片样品采用硅胶干燥保存，使用 SDS 区室
法可以提取到较高质量的总 DNA。李志真等［5］
发现光皮桦叶片样品采用核酸分离缓冲液保存，
然后再使用改良的 CTAB法可获得较高质量的总
DNA。【本研究切入点】天山樱桃作为新疆特有
的野生果树种质资源，属于矮生樱亚属植物，但是
目前对于其分类学上的研究还不清晰，而现代分
类学与亲缘关系的研究多采用分子标记的方法，
这就涉及到如何获得高质量的天山樱桃总 DNA，
而天山樱桃自然分布于新疆天山野果林，路途遥
远，分布地分散，很难做到及时带回，且天山樱桃
叶片中富含糖与多酚，增加了对其总 DNA的提取
难度。【拟解决的关键问题】提取总 DNA 的质量
与保存方法密切相关，如果叶片样品的保存方法
不当，会严重影响所提取总 DNA的质量。筛选出
适合天山樱桃叶片总 DNA提取的最佳保存方法，
获得高质量的总 DNA。
1 材料与方法
1. 1 材 料
试验材料来源于新疆农业大学试验基地引种
新疆农业科学 53 卷
栽培的 4 a生天山樱桃。
1. 2 方 法
1. 2. 1 试验设计
将采集的天山樱桃叶片在实验室分为 16 份，
处理 1 以新鲜叶片为材料，将新鲜叶片使用锡箔
纸包好后存放在液氮中(处理 2)，冷冻保存法:将
叶片存放入 － 70℃(处理 3)、叶片存放入 － 20℃
(处理 4)，干燥保存法:将叶片存放在室温下保存
(处理 5)、叶片使用硫酸纸包裹后存入有硅胶的
密封袋中(处理 6)、叶片在烘箱 50℃干燥(处理
7)，微波不同时间处理:30 s、60 s、1. 5 min、2 min、
2. 5 min、3 min、3. 5 min、4. 5 min、5. 5 min(处理 8、
9、10、11、12、13、14、15、16)，所有样品均保存 26
d。
1. 2. 2 总 DNA提取
叶片总 DNA的提取方法与陈大明等［6］提取
樱桃总 DNA方法相同。
1. 2. 3 DNA质量检测
紫外分光光度计检测总 DNA 纯度和浓度;
1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测总 DNA完整性;2. 0%
琼脂糖凝胶检测总 DNA扩增效果。
2 结果与分析
2. 1 不同保存方法对总 DNA 纯度和浓度的影
响
核酸的嘌呤、嘧啶中都有共轭双键，对紫外光
有强烈的吸收作用，天然双链 DNA 在 260 nm 与
280 nm处的吸收比值为 1. 8 ～ 2. 0 时纯度较好。
不同保存方法对总 DNA 的纯度和浓度的影响可
以看出，处理 3、5、6、11 的样品所提取总 DNA 纯
度较高，处理 2 和处理 13 的样品所提取总 DNA
浓度最高，分别为 0. 8 和 0. 95 μg / μL;而处理 1
所提取总 DNA浓度最低，只有 0. 2 μg /μL。表 1
表 1 不同保存方法总 DNA纯度和浓度变化
Table 1 Effects of preservation methods on purity and concentration of genomic DNA
编号
Coad 1 2 3 4 5 6 7 8
OD260 /OD280 1. 33 2 1. 8 1. 4 1. 89 1. 83 1. 63 3
DNA浓度
DNA concentration(μg /μL) 0. 2 0. 8 0. 45 0. 35 0. 5 0. 55 0. 65 0. 3
编号
Coad 9 10 11 12 13 14 15 16
OD260 /OD280 2. 67 2. 33 1. 83 1. 55 1. 36 1 2 2. 5
DNA浓度
DNA concentration(μg /μL) 0. 4 0. 35 0. 55 0. 7 0. 95 0. 5 0. 7 0. 5
注:1:新鲜叶片、2:液氮保存、3:－ 70℃冷冻保存、4:－ 20℃冷冻保存、5:室温保存、6:硅胶干燥保存、7:烘箱干燥、8:微波 30 s、9:1
min、10:1. 5 min、11:2 min、12:2. 5 min、13:3 min、14:3. 5 min、15:4. 5 min、16:5. 5 min
Note:1:Fresh Leaf、2:Preservation in Liquid Nitrogen、3:Preservation at － 70℃、4:Preservation at － 20℃、5:Ｒoom Temperature、6:Dried
with Silica、7:Dried with Oven、8:Microwave Treatment within 30 s、9:1 min、10:1. 5 min、11:2 min、12:2. 5 min、13:3 min、14:3. 5 min、15:4. 5
min、16:5. 5 min
2. 2 不同保存方法对总 DNA完整性的影响
DNA是主要的遗传物质，要探究物种的遗传
多样性，如果 DNA 不完整，就会对物种遗传多样
性研究造成严重的影响。不同保存方法对总
DNA完整性的影响可以看出:处理 1 和处理 2 的
样品所提取总 DNA 条带整齐，无降解现象，且点
样孔无残留;而处理 8、9、10、11、12、13、14、15、16
的样品所提取总 DNA检测不出清晰条带。图 1
648
5 期 李春侨等:不同保存方法对天山樱桃总 DNA提取效果的影响
注:1:新鲜叶片、2:液氮保存、3:－ 70℃冷冻保存、4:－ 20℃冷冻保存、5:室温保存、6:硅胶干燥保存、7:烘箱干燥、8:微波 30 s、9:1
min、10:1. 5 min、11:2 min、12:2. 5 min、13:3 min、14:3. 5 min、15:4. 5 min、16:5. 5 min，下同
Note:1:Fresh Leaf、2:Preservation in Liquid Nitrogen、3:Preservation at － 70℃、4:Preservation at － 20℃、5:Ｒoom Temperature、6:Dried
with Silica、7:Dried with Oven、8:Microwave Treatment within 30 s、9:1 min、10:1. 5 min、11:2 min、12:2. 5 min、13:3 min、14:3. 5 min、15:4. 5
min、16:5. 5 min，the same as below
图 1 不同保存方法总 DNA的完整性
Fig. 1 Effects of preservation methods on completeness of genomic DNA
2. 3 不同保存方法对总 DNA扩增效果的影响
DNA作为 PCＲ扩增的模板，由引物扩增出特
定的片段，如果 DNA 质量不高，很可能会造成扩
增不完整和扩增错误，所以高质量的 DNA对 PCＲ
扩增来说是不可缺少的。不同保存方法对总
DNA扩增效果的影响可以看出:处理 5、6、7 样品
所提取的总 DNA可以扩增出较多的基因位点，主
条带清晰一致，而处理 16、17、18 的样品所提取的
总 DNA扩增不出主条带，且条带少，弥散现象严
重。图 2
图 2 不同保存方法 DNA的 PCＲ效果
Fig. 2 Effects of preservation methods on PCＲ effect of DNA
3 讨 论
3. 1 不同保存方法对提取总 DNA 纯度和浓度
的影响
影响 DNA纯度和浓度的因素有很多，主要集
中在提取 DNA时多糖与酚类物质没有去除干净，
样品保存时间过长，样品保存方法不合适等方面。
研究发现不同保存方法对所提取天山樱桃叶片总
DNA的纯度和浓度影响较大，其中处理 3、5、6、11
(－ 70℃冷冻保存、室温保存、硅胶干燥保存、微
波处理 2 min)的样品所提取总 DNA的纯度较高，
这与李莉等［7］在枣叶片，王经源等［8］在刺桫椤叶
片上的结论一致。而对于不同保存方法对 DNA
提取浓度的影响，研究发现处理 6(硅胶干燥保
存)所提取的 DNA 纯度较好，且浓度也高于均
值;处理 1(新鲜叶片)样品所提取总 DNA的浓度
最低，只有 0. 2 μg /μL，这与胡学林等［9］在提取新
鲜核桃叶片总 DNA 的浓度 1. 5 μg /μL 相比有较
大差异，造成这种差异的主要原因可能是提取
DNA的试剂和加样量不同，所以今后可以尝试适
当增加样品量来提高天山樱桃总 DNA的浓度。
3. 2 不同保存方法对提取总 DNA 完整性的影
响
关于不同保存方法对 DNA 完整性的影响研
748
新疆农业科学 53 卷
究有许多，朱田田等［10］提取使用液氮保存的中麻
黄叶片总 DNA，靖相密等［11］提取新鲜腊梅叶片
总 DNA，均可以获得较为完整的总 DNA，这与研
究中处理 1、处理 2 和处理 6(液氮保存的叶片、新
鲜叶片，硅胶干燥保存)中获得完整的总 DNA 结
果一致。同时研究中还发现，采用微波处理的所
有天山樱桃样品所提取的总 DNA无条带，推测可
能是微波处理时损坏了天山樱桃叶片总 DNA，造
成 DNA降解，因此认为天山樱桃叶片不适合使用
微波干燥的保存方式。
3. 3 不同保存方法对总 DNA扩增效果的影响
PCＲ扩增的效果直接关系到分子标记的成
功与否，也是进行基因连锁标记、遗传图谱的构建
等研究的关键［12］。研究发现处理 5、6、7(室温保
存，硅胶干燥保存，烘箱干燥)的样品所提取的总
DNA通过 PCＲ扩增效果好，条带清晰且基因位点
较多，这与刘春英等［13］在杨树叶片上，张海燕
等［14］在胡杨叶片采取硅胶保存方法获得了较好
的 PCＲ扩增效果结论一致，但研究中硅胶干燥保
存方法与刘春英和张海燕使用的硅胶保存方法不
同，研究先使用硫酸纸包裹住样品后再装入有硅
胶的密封袋中，干燥效果更好。
4 结 论
研究针对天山樱桃叶片采用液氮保存，冷冻
保存，干燥保存和微波处理四种不同的保存方法，
通过检测总 DNA 的质量研究发现不同的保存方
法对天山樱桃叶片总 DNA 的质量影响不同。当
采取 － 70℃冷冻保存、室温保存、硅胶干燥保存和
微波处理 2 min时叶片总 DNA纯度较好;液氮保
存和微波处理 2 min有利于总 DNA 浓度的提高;
使用液氮保存叶片样品时，总 DNA 的完整性最
好;当采用硅胶干燥、室温干燥和烘箱干燥的保存
方法保存叶片样品时，所提取的 DNA可以获得条
带完整、清晰可见的 PCＲ扩增图谱。比较三种叶
片总 DNA提取质量的检测结果，结合天山樱桃的
生境复杂性，认为硅胶干燥是天山樱桃叶片较为
适合的保存方法。
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Effects of Different Preservation Methods on Genomic DNA
Extraction of Cerasus tianschanica
LI Chun － qiao1，ZHOU Long1，LU Biao2，QI Yan － qiao1，SHENG Fang1
(1． College of Forestry and Horticulture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;2．
Forestry Bureau of Tekesi County，Tekesi Xinjiang 835500，China)
Abstract:【Objective】In order to find a suitable method for preserving leaf samples of Cerasus tians-
chanica，the influence of genomic DNA extraction effect of different preservation methods was compared．
【Method】Using young leaves of Cerasus tianschanica as test material，the influence of genomic DNA extrac-
tion quality was compared through different preserving methods，such as liquid nitrogen，cryopreservation，dr-
ying，microwave treatment and etc．【Ｒesult】The result showed that the high pure genomic DNA could be ex-
tracted by － 70℃ cryopreservation，room temperature preservation，silica gel dry preservation，microwave
treatment within 2 min preservation method． The integrity of genomic DNA could be extracted from the leaf
samples stored with liquid nitrogen preservation method． The better amplification effect could be achieved with
drying preservation method．【Conclusion】Many factors of restriction on wild sample were taken into consider-
ation，and we think the silica preservation method is the suitable way to do molecular biology research on
Cerasus tianschanica．
Key words:Cerasus tianschanica;preservation methods;genomic DNA
Fund project:Supported by NSFC (31260466)and key discipline fund of pomology of Xinjiang Uygur Autonomous Ｒegion．
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