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件下的含量，相对来说避光更有利于底泥中磷的释放。这可能
是由于光照会使底栖藻类生物作用更加旺盛，因此铁、铝等结
合态磷更容易被藻类吸收同化，从而导致铁、铝等结合态的磷
酸根离子的释放能力相对较弱，进而磷的释放量也随之减少。
3 结论
在试验周期内，煤渣和红土覆盖层均能有效抑制底泥中
的磷向上覆水中释放;红土覆盖对底泥磷释放的控制效果比
煤渣覆盖更好。酸性或碱性条件均有利于底泥中的磷向上覆
水中释放，碱性条件比酸性条件更有利于底泥中磷的释放;在
中性条件下，磷的释放量最小。环境温度对底泥中磷释放的
影响较大，温度升高有利于底泥中磷的释放。扰动强度越大，
在相同的试验时间内底泥中磷向上覆水中的释放量越大;在
释放初期两者差异不大，随着时间的延长，两者差异越来越
大。光照对原位覆盖法控制底泥中磷释放的影响不明显，相
对来说避光更有利于底泥中磷的释放。原位覆盖法可以有效
控制底泥中的磷向上覆水中释放。
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雪胆中抗 MＲSA内生细菌的多样性
康 琳，魏金莉，胡 蝶，刘佳凤，王毅鹏，杨帅丹，龚明福
(乐山师范学院生命科学学院 /峨眉山特色生物资源重点实验室，四川乐山 614004)
摘要:从雪胆多种组织中分离、筛选出抗 MＲSA的菌株，采用总 DNA EＲIC － PCＲ方法和 16S rＲNA基因全序列分
析方法，对抗 MＲSA的雪胆内生细菌进行遗传多样性和系统发育分析。结果表明，雪胆内生细菌非常丰富，分离获得
25 株抗 MＲSA菌株。在遗传距离为 0． 50 时，25 株菌被划分为 4 个 EＲIC群和 1 个独立成群的菌株。
关键词:雪胆;内生细菌;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;多样性
中图分类号:S567． 23 + 9． 01 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2014)02 － 303 － 03
收稿日期:2013 － 06 － 07
基金项目:四川省教育厅科研项目(编号:12ZA240);乐山师范学院
科研项目(编号:Z1160)。
作者简介:康 琳(1990—)，女，本科生，从事微生物资源研究。
E － mail:947531778@ qq． com。
通信作者:龚明福，教授，博士，从事微生物资源及微生物与植物间相
互关系研究。E － mail:gongmingfu98@ 163． com。
雪胆(Hemsleya sinesis Cogn．)为葫芦科雪胆属植物，含
多种活性成分，具有多种药理作用，包括抗肿瘤［1］、改善微循
环、广谱抗菌［2］、抗病毒［3］、保护肝脏［4］、治疗胃肠疾病［5］、降
温［2］、抗炎镇咳［6］等作用，被广泛应用于临床，是一种具有发
展前景的中药［7］。目前，对雪胆的研究取得了一定进展，如
雪胆有效成分的提取工艺、作用机制、检测方法的建立等。耐
甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin － resistant Staphylococ-
cus aureus，MＲSA)为医院内感染的多重耐药性病原菌［8］，只
对万古霉素敏感［9］，目前几乎所有国家都已有 MＲSA 的报
道，我国各大医院 MＲSA 的分离率也很高［10］，近年来在全世
界蔓延的速度比较快。MＲSA 除对甲氧西林耐药外，还对临
床上广泛应用的多种抗生素耐药，导致感染呈散发性或暴发
性流行，成为全世界范围抗细菌感染中的难题，已引起医药界
专家与制药企业高度关注，因此，解决 MＲSA 耐药性问题，即
研发新的抗 MＲSA 药物已经成为当今非常重要的任务。根
据相似性原理，生活在药用植物组织中的内生细菌能产生与
药用植物相似的活性成分。刘佳等筛选到 1 株具有抗 MＲSA
活性的枯草芽孢杆菌，该菌产生的胞外抑菌物质对 MＲSA 具
有较好的抑制效果［11］。雪胆抗菌谱广，其内生细菌具有抗
MＲSA的潜力，因此从雪胆内生细菌中筛选抗 MＲSA 菌株并
通过发酵生产抗 MＲSA药物具有重要的意义和发展潜力。
1 材料与方法
1． 1 培养基
NA培养基:牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、琼脂
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18 g、水 1 000 mL，pH 值 7． 2 ～ 7． 4;PDA 培养基:马铃薯
200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 18 g、水 1 000 mL，pH值自然，121 ℃
灭菌 30 min。
1． 2 雪胆内生细菌的分离纯化
从峨眉山采集生长健康的雪胆，从其根茎组织中分离内
生细菌。将待分离的新鲜雪胆根茎组织用自来水冲洗干净，
并称取样品 1 g，先用 75%乙醇浸泡消毒 5 min，再用 2%次氯
酸钠进行表面消毒 5 min，最后用无菌水冲洗 3 ～ 5 次;冲洗干
净之后，每种样品中加入 10 mL 无菌水，放在无菌研钵中研
磨，静置 20 min，取上清液按倍比稀释法系列稀释 1 000 倍
后，取梯度稀释液 0． 1 mL涂布于平板上，每个处理重复 3 次，
于 28 ℃下暗培养 72 h;最后一次冲洗的无菌水涂布在 NA培
养基上，于 28 ℃下暗培养 72 h，观察是否有菌落长出，进行无
菌检验。
等菌落长出后观察菌落形态和菌体形态(包括大小、形
状、颜色、表面光泽、透明度、质地、革兰氏染色反应、有无芽孢
等)，分别挑取不同的菌落，然后在培养基平板上纯化，将纯
化后的内生细菌用相应的培养基斜面及甘油管于 4 ℃冰箱内
保存备用。
1． 3 抗 MＲSA内生细菌的筛选
1． 3． 1 初筛 在平板表面涂布 MＲSA，晾干，取活化的内生
细菌菌液一环点接到 NA 平板上;取无菌水代替内生细菌菌
液点接到涂有指示菌 MＲSA 的 NA 平板上培养，作为空白对
照，每个处理重复 3 次。将平板置于 37 ℃培养箱中培养
24 h，测定抑菌圈直径并记录试验结果。
1． 3． 2 复筛 在平板表面涂布 MＲSA，晾干，然后在平板上
距离平板中心 1． 5 cm 处放入牛津杯，吸取 100 μL 初筛的具
有抑菌作用的内生细菌发酵液，加入到牛津杯中，用万古霉素
代替内生细菌菌液作为阳性对照，每处理重复 3 次。将平板
置于 37 ℃培养箱中培养 24 h，测量抑菌圈直径。
1． 4 拮抗性雪胆内生细菌 EＲIC － PCＲ分析
拮抗性内生细菌基因组总 DNA 的提取方法参见徐琳等
的方法［12］，特异性引物选取 EＲIC1Ｒ(5 － ATGTAAGCTCCCT-
GGGGATTCAC － 3)和 EＲIC2L (5 － AAGTAAGTGACT-
GGGGTGAGCG －3)［13］，由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。反应总体系为 25 μL，其组成为 10 × Buffer
2． 5 μL、25 mmol /μL MgCl2 2． 0 μL、2． 5 mmol /L dNTP
2． 0 μL、20 pmol /μL EＲIC1Ｒ 0． 5 μL、20 pmol /μL EＲIC2L
0． 5 μL、13 μL ddH2O、模板总 DNA(40 ～ 80 ng /μL)4． 0 μL。
EＲIC － PCＲ 反应程序参照马溪平等的方法［13］。反应结束后
取出 PCＲ小管，用 1%琼脂糖凝胶电泳 3． 5 h，利用凝胶成像
系统仪拍照并保存图谱，凝胶图像经电脑扫描处理后，在同一
位置有带的记为“1”，没有的记为“0”。采用 DPS 软件，用遗
传距离按类平均连锁聚类法(UPGMA)进行 0 － 1 系统聚类分
析，得出树状图［14］。
2 结果与分析
2． 1 雪胆内生细菌的分离
将采集到的雪胆进行内生细菌分离，结果发现，在 NA平
板上长出大量菌落，且菌落形态存在明显差异，共得到 30 株
内生细菌，依次编号为 KLXD01 ～ KLXD30，这表明雪胆组织
中存在大量的内生细菌。
2． 2 抗 MＲSA内生细菌的筛选
采用平板对峙法初筛、牛津杯法复筛，从所分离到的 30
株内生细菌中共筛选出 25 株对 MＲSA 具有抑制效果的菌株
(表 1)，不同细菌菌株的抑菌效果存在明显差异，KLXD06、
KLXD17、KLXD21、KLXD24 等 4 株菌抗 MＲSA 的效果较好，
其中 KLXD06 抗 MＲSA最大，抑菌圈直径达 19． 3 mm。
表 1 雪胆内生细菌对MＲSA的抑菌效果
菌株 抑菌圈直径(mm)
KLXD01 11． 667 ± 0． 577 4b
KLXD02 8． 000 ± 0． 000 0a
KLXD03 6． 333 ± 0． 288 0a
KLXD04 6． 333 ± 0． 288 7a
KLXD05 8． 000 ± 0． 000 0a
KLXD06 19． 300 ± 0． 251 7c
KLXD07 7． 667 ± 0． 057 7a
KLXD08 7． 333 ± 0． 057 7a
KLXD09 8． 000 ± 0． 000 0a
KLXD10 9． 667 ± 0． 493 3a
KLXD11 14． 000 ± 1． 652 3b
KLXD12 8． 000 ± 0． 000 0a
KLXD14 11． 667 ± 1． 258 3b
KLXD15 11． 667 ± 0． 577 4b
KLXD16 8． 333 ± 0． 288 7a
KLXD17 17． 333 ± 0． 251 7c
KLXD18 7． 507 ± 0． 178 6a
KLXD19 8． 333 ± 0． 763 8a
KLXD20 11． 507 ± 0． 253 3b
KLXD21 18． 507 ± 0． 178 6c
KLXD22 12． 667 ± 0． 357 3b
KLXD23 6． 333 ± 0． 208 2a
KLXD24 17． 333 ± 0． 251 7c
KLXD25 7． 333 ± 0． 057 7a
注:同列数据后不同小写字母间表示差异显著(P ＜ 0． 05)。
2． 3 拮抗性雪胆内生细菌 EＲIC － PCＲ分析
对 25 株拮抗性雪胆内生细菌进行 EＲIC － PCＲ 扩增，结
果表明，供试菌株 EＲIC － PCＲ图谱多呈现 3 ～ 5 条条带，其分
布各不相同，其大小范围 100 ～ 1 500 bp(图 1)，说明不同菌
株在分子水平上存在差异。
用 DPS软件系统采用类平均连锁法(UPGMA)对这些菌
株的 EＲIC － PCＲ结果进行聚类分析，得到树状图(图 2)。从
图 2 可以看出，在遗传距离为 0． 71 时，所有供试菌株聚在一
起;在遗传距离为 0． 50 时，供试菌株进一步被划分为 4 个
EＲIC群和 1 个独立成群的菌株，4 个 EＲIC群分别命名为Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ，每个群的菌株数依次为 6、8、5、5 株，中心菌株分别
为 KLXD01、KLXD08、KLXD12、KLXD10。
3 结论与讨论
雪胆植物内生细菌非常丰富，笔者从雪胆中分离到 30株内
生细菌。EＲIC －PCＲ结果显示，具有抗 MＲSA活性的 25株菌株
在遗传距离为 0． 50时被分为 4个 EＲIC群和 1个独立成群。
目前，我国以采用体外抑菌法从中草药及其提取物中筛
—403— 江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 2 期
选抗 MＲSA 的物质为主，其中黄岑、黄连等表现出较好的抑
菌效果［15 － 17］，但中草药成分复杂，分析其抑菌机制比较困难。
多株已筛选出的放线菌对 MＲSA 具有较好的抑制效
果［11，18 － 19］。张守村等从苦豆子内生细菌中筛选到 1 株抗
MＲSA活性较强的菌株［20］。从其他药用植物内生细菌中筛
选抗 MＲSA菌株还鲜见报道。雪胆抗菌谱广，其内生细菌抗
MＲSA活性强，笔者从雪胆中分离到 30 株内生细菌，有 25 株
菌株具有较强的抗 MＲSA 活性，其中雪胆内生细菌 KLXD06
的抗 MＲSA 活性最强，有生产抗 MＲSA 活性药物的潜力，但
该菌株的系统发育地位还需要进一步确定。
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