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雪胆中抗MRSA内生细菌的多样性



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件下的含量,相对来说避光更有利于底泥中磷的释放。这可能
是由于光照会使底栖藻类生物作用更加旺盛,因此铁、铝等结
合态磷更容易被藻类吸收同化,从而导致铁、铝等结合态的磷
酸根离子的释放能力相对较弱,进而磷的释放量也随之减少。
3 结论
在试验周期内,煤渣和红土覆盖层均能有效抑制底泥中
的磷向上覆水中释放;红土覆盖对底泥磷释放的控制效果比
煤渣覆盖更好。酸性或碱性条件均有利于底泥中的磷向上覆
水中释放,碱性条件比酸性条件更有利于底泥中磷的释放;在
中性条件下,磷的释放量最小。环境温度对底泥中磷释放的
影响较大,温度升高有利于底泥中磷的释放。扰动强度越大,
在相同的试验时间内底泥中磷向上覆水中的释放量越大;在
释放初期两者差异不大,随着时间的延长,两者差异越来越
大。光照对原位覆盖法控制底泥中磷释放的影响不明显,相
对来说避光更有利于底泥中磷的释放。原位覆盖法可以有效
控制底泥中的磷向上覆水中释放。
参考文献:
[1]朱广伟,陈英旭,田光明. 水体沉积物的污染控制技术研究进展
[J]. 农业环境保护,2002,21(4):378 - 380.
[2]Liu C H,Jay J A,Ika R,et al. Capping efficiency for metal - contami-
nated marine sediment under conditions of submarine groundwater dis-
charge[J]. Environmental Science and Technology,2001,35(11) :
2334 - 2340.
[3]朱兰保,盛 蒂. 污染底泥原位覆盖控制技术研究进展[J]. 重
庆文理学院学报:自然科学版,2011,30(3):38 - 41,55.
[4]敖 静. 污染底泥释放控制技术的研究进展[J]. 环境保护科
学,2004,30(6):29 - 32,35.
[5]Palermo M R. Design consideration for in - situ capping of contami-
nated sediments[J]. Water Science and Technology,1998,37(6 /
7) :315 - 321.
[6]童昌华,杨肖娥,濮培民. 水生植物控制湖泊底泥营养盐释放的
效果与机理[J]. 农业环境科学学报,2003,22(6):673 - 676.
[7]薛传东,杨 浩,刘 星. 天然矿物材料修复富营养化水体的实
验研究[J]. 岩石矿物学杂志,2003,22(4):381 - 385.
[8]朱兰保,盛 蒂,葛友成. 原位覆盖法控制底泥氮释放的研究
[J]. 蚌埠学院学报,2013,2(3):29 - 31.
[9]HJ 636—2012 水质 总氮的测定 碱性过硫酸钾消解紫外分
光光度法[S]. 北京:中国标准出版社,2012.
[10]李寿泉. 浅析环境因子对城市缓流水体底泥磷释放的影响[J].
江苏环境科技,2007,20(6):13 - 16.
康 琳,魏金莉,胡 蝶,等. 雪胆中抗 MRSA内生细菌的多样性[J]. 江苏农业科学,2014,42(2):303 - 305.
雪胆中抗 MRSA内生细菌的多样性
康 琳,魏金莉,胡 蝶,刘佳凤,王毅鹏,杨帅丹,龚明福
(乐山师范学院生命科学学院 /峨眉山特色生物资源重点实验室,四川乐山 614004)
摘要:从雪胆多种组织中分离、筛选出抗 MRSA的菌株,采用总 DNA ERIC - PCR方法和 16S rRNA基因全序列分
析方法,对抗 MRSA的雪胆内生细菌进行遗传多样性和系统发育分析。结果表明,雪胆内生细菌非常丰富,分离获得
25 株抗 MRSA菌株。在遗传距离为 0. 50 时,25 株菌被划分为 4 个 ERIC群和 1 个独立成群的菌株。
关键词:雪胆;内生细菌;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;多样性
中图分类号:S567. 23 + 9. 01 文献标志码:A 文章编号:1002 - 1302(2014)02 - 303 - 03
收稿日期:2013 - 06 - 07
基金项目:四川省教育厅科研项目(编号:12ZA240);乐山师范学院
科研项目(编号:Z1160)。
作者简介:康 琳(1990—),女,本科生,从事微生物资源研究。
E - mail:947531778@ qq. com。
通信作者:龚明福,教授,博士,从事微生物资源及微生物与植物间相
互关系研究。E - mail:gongmingfu98@ 163. com。
雪胆(Hemsleya sinesis Cogn.)为葫芦科雪胆属植物,含
多种活性成分,具有多种药理作用,包括抗肿瘤[1]、改善微循
环、广谱抗菌[2]、抗病毒[3]、保护肝脏[4]、治疗胃肠疾病[5]、降
温[2]、抗炎镇咳[6]等作用,被广泛应用于临床,是一种具有发
展前景的中药[7]。目前,对雪胆的研究取得了一定进展,如
雪胆有效成分的提取工艺、作用机制、检测方法的建立等。耐
甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin - resistant Staphylococ-
cus aureus,MRSA)为医院内感染的多重耐药性病原菌[8],只
对万古霉素敏感[9],目前几乎所有国家都已有 MRSA 的报
道,我国各大医院 MRSA 的分离率也很高[10],近年来在全世
界蔓延的速度比较快。MRSA 除对甲氧西林耐药外,还对临
床上广泛应用的多种抗生素耐药,导致感染呈散发性或暴发
性流行,成为全世界范围抗细菌感染中的难题,已引起医药界
专家与制药企业高度关注,因此,解决 MRSA 耐药性问题,即
研发新的抗 MRSA 药物已经成为当今非常重要的任务。根
据相似性原理,生活在药用植物组织中的内生细菌能产生与
药用植物相似的活性成分。刘佳等筛选到 1 株具有抗 MRSA
活性的枯草芽孢杆菌,该菌产生的胞外抑菌物质对 MRSA 具
有较好的抑制效果[11]。雪胆抗菌谱广,其内生细菌具有抗
MRSA的潜力,因此从雪胆内生细菌中筛选抗 MRSA 菌株并
通过发酵生产抗 MRSA药物具有重要的意义和发展潜力。
1 材料与方法
1. 1 培养基
NA培养基:牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、琼脂
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18 g、水 1 000 mL,pH 值 7. 2 ~ 7. 4;PDA 培养基:马铃薯
200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 18 g、水 1 000 mL,pH值自然,121 ℃
灭菌 30 min。
1. 2 雪胆内生细菌的分离纯化
从峨眉山采集生长健康的雪胆,从其根茎组织中分离内
生细菌。将待分离的新鲜雪胆根茎组织用自来水冲洗干净,
并称取样品 1 g,先用 75%乙醇浸泡消毒 5 min,再用 2%次氯
酸钠进行表面消毒 5 min,最后用无菌水冲洗 3 ~ 5 次;冲洗干
净之后,每种样品中加入 10 mL 无菌水,放在无菌研钵中研
磨,静置 20 min,取上清液按倍比稀释法系列稀释 1 000 倍
后,取梯度稀释液 0. 1 mL涂布于平板上,每个处理重复 3 次,
于 28 ℃下暗培养 72 h;最后一次冲洗的无菌水涂布在 NA培
养基上,于 28 ℃下暗培养 72 h,观察是否有菌落长出,进行无
菌检验。
等菌落长出后观察菌落形态和菌体形态(包括大小、形
状、颜色、表面光泽、透明度、质地、革兰氏染色反应、有无芽孢
等),分别挑取不同的菌落,然后在培养基平板上纯化,将纯
化后的内生细菌用相应的培养基斜面及甘油管于 4 ℃冰箱内
保存备用。
1. 3 抗 MRSA内生细菌的筛选
1. 3. 1 初筛 在平板表面涂布 MRSA,晾干,取活化的内生
细菌菌液一环点接到 NA 平板上;取无菌水代替内生细菌菌
液点接到涂有指示菌 MRSA 的 NA 平板上培养,作为空白对
照,每个处理重复 3 次。将平板置于 37 ℃培养箱中培养
24 h,测定抑菌圈直径并记录试验结果。
1. 3. 2 复筛 在平板表面涂布 MRSA,晾干,然后在平板上
距离平板中心 1. 5 cm 处放入牛津杯,吸取 100 μL 初筛的具
有抑菌作用的内生细菌发酵液,加入到牛津杯中,用万古霉素
代替内生细菌菌液作为阳性对照,每处理重复 3 次。将平板
置于 37 ℃培养箱中培养 24 h,测量抑菌圈直径。
1. 4 拮抗性雪胆内生细菌 ERIC - PCR分析
拮抗性内生细菌基因组总 DNA 的提取方法参见徐琳等
的方法[12],特异性引物选取 ERIC1R(5 - ATGTAAGCTCCCT-
GGGGATTCAC - 3)和 ERIC2L (5 - AAGTAAGTGACT-
GGGGTGAGCG -3)[13],由上海生工生物工程技术服务有限
公司合成。反应总体系为 25 μL,其组成为 10 × Buffer
2. 5 μL、25 mmol /μL MgCl2 2. 0 μL、2. 5 mmol /L dNTP
2. 0 μL、20 pmol /μL ERIC1R 0. 5 μL、20 pmol /μL ERIC2L
0. 5 μL、13 μL ddH2O、模板总 DNA(40 ~ 80 ng /μL)4. 0 μL。
ERIC - PCR 反应程序参照马溪平等的方法[13]。反应结束后
取出 PCR小管,用 1%琼脂糖凝胶电泳 3. 5 h,利用凝胶成像
系统仪拍照并保存图谱,凝胶图像经电脑扫描处理后,在同一
位置有带的记为“1”,没有的记为“0”。采用 DPS 软件,用遗
传距离按类平均连锁聚类法(UPGMA)进行 0 - 1 系统聚类分
析,得出树状图[14]。
2 结果与分析
2. 1 雪胆内生细菌的分离
将采集到的雪胆进行内生细菌分离,结果发现,在 NA平
板上长出大量菌落,且菌落形态存在明显差异,共得到 30 株
内生细菌,依次编号为 KLXD01 ~ KLXD30,这表明雪胆组织
中存在大量的内生细菌。
2. 2 抗 MRSA内生细菌的筛选
采用平板对峙法初筛、牛津杯法复筛,从所分离到的 30
株内生细菌中共筛选出 25 株对 MRSA 具有抑制效果的菌株
(表 1),不同细菌菌株的抑菌效果存在明显差异,KLXD06、
KLXD17、KLXD21、KLXD24 等 4 株菌抗 MRSA 的效果较好,
其中 KLXD06 抗 MRSA最大,抑菌圈直径达 19. 3 mm。
表 1 雪胆内生细菌对MRSA的抑菌效果
菌株 抑菌圈直径(mm)
KLXD01 11. 667 ± 0. 577 4b
KLXD02 8. 000 ± 0. 000 0a
KLXD03 6. 333 ± 0. 288 0a
KLXD04 6. 333 ± 0. 288 7a
KLXD05 8. 000 ± 0. 000 0a
KLXD06 19. 300 ± 0. 251 7c
KLXD07 7. 667 ± 0. 057 7a
KLXD08 7. 333 ± 0. 057 7a
KLXD09 8. 000 ± 0. 000 0a
KLXD10 9. 667 ± 0. 493 3a
KLXD11 14. 000 ± 1. 652 3b
KLXD12 8. 000 ± 0. 000 0a
KLXD14 11. 667 ± 1. 258 3b
KLXD15 11. 667 ± 0. 577 4b
KLXD16 8. 333 ± 0. 288 7a
KLXD17 17. 333 ± 0. 251 7c
KLXD18 7. 507 ± 0. 178 6a
KLXD19 8. 333 ± 0. 763 8a
KLXD20 11. 507 ± 0. 253 3b
KLXD21 18. 507 ± 0. 178 6c
KLXD22 12. 667 ± 0. 357 3b
KLXD23 6. 333 ± 0. 208 2a
KLXD24 17. 333 ± 0. 251 7c
KLXD25 7. 333 ± 0. 057 7a
注:同列数据后不同小写字母间表示差异显著(P < 0. 05)。
2. 3 拮抗性雪胆内生细菌 ERIC - PCR分析
对 25 株拮抗性雪胆内生细菌进行 ERIC - PCR 扩增,结
果表明,供试菌株 ERIC - PCR图谱多呈现 3 ~ 5 条条带,其分
布各不相同,其大小范围 100 ~ 1 500 bp(图 1),说明不同菌
株在分子水平上存在差异。
用 DPS软件系统采用类平均连锁法(UPGMA)对这些菌
株的 ERIC - PCR结果进行聚类分析,得到树状图(图 2)。从
图 2 可以看出,在遗传距离为 0. 71 时,所有供试菌株聚在一
起;在遗传距离为 0. 50 时,供试菌株进一步被划分为 4 个
ERIC群和 1 个独立成群的菌株,4 个 ERIC群分别命名为Ⅰ、
Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ,每个群的菌株数依次为 6、8、5、5 株,中心菌株分别
为 KLXD01、KLXD08、KLXD12、KLXD10。
3 结论与讨论
雪胆植物内生细菌非常丰富,笔者从雪胆中分离到 30株内
生细菌。ERIC -PCR结果显示,具有抗 MRSA活性的 25株菌株
在遗传距离为 0. 50时被分为 4个 ERIC群和 1个独立成群。
目前,我国以采用体外抑菌法从中草药及其提取物中筛
—403— 江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 2 期
选抗 MRSA 的物质为主,其中黄岑、黄连等表现出较好的抑
菌效果[15 - 17],但中草药成分复杂,分析其抑菌机制比较困难。
多株已筛选出的放线菌对 MRSA 具有较好的抑制效
果[11,18 - 19]。张守村等从苦豆子内生细菌中筛选到 1 株抗
MRSA活性较强的菌株[20]。从其他药用植物内生细菌中筛
选抗 MRSA菌株还鲜见报道。雪胆抗菌谱广,其内生细菌抗
MRSA活性强,笔者从雪胆中分离到 30 株内生细菌,有 25 株
菌株具有较强的抗 MRSA 活性,其中雪胆内生细菌 KLXD06
的抗 MRSA 活性最强,有生产抗 MRSA 活性药物的潜力,但
该菌株的系统发育地位还需要进一步确定。
参考文献:
[1]陶朝阳,易杨华,林厚文,等. 雪胆根抗肿瘤活性成分研究[J].
第二军医大学学报,1999,20(5):337 - 338.
[2]李 亮,朱 玲,刘 蓉,等. 雪胆素的药效学试验[J]. 四川生
理科学杂志,2005,27(3):135.
[3]田仁荣,陈剑超,张高红,等. 雪胆素 A和 B 的体外抗 HIV - 1 活
性:英文[J]. 中国天然药物,2008,6(3):214 - 218.
[4]施亚琴,杨培全,台云梅,等. 反相高效液相色谱法测定不同采收
期长果雪胆中雪胆甲素的含量[J]. 中国中药杂志,1996
(5):20 - 21.
[5]刘艳丽,李笑然,范金胤,等. 雪胆胃肠丸对胃溃疡的作用实验研
究[J]. 时珍国医国药,2010,21(2):301 - 302.
[6]陈夏静,伍怡颖,匡文娟,等. 雪胆素片抗炎镇咳作用的实验研究
[J]. 四川生理科学杂志,2009,31(4):153 - 154.
[7]杨群芳,王贤英. 中药雪胆及其制剂的研究进展[J]. 中国药业,
2003,12(9):76 - 77.
[8]Hiramatsu K,Katayama Y,Yuzawa H,et al. Molecular genetics of
methicillin - resistant Staphylococcus aureus[J]. International Journal
of Medical Microbiology,2002,292(2) :67 - 74.
[9]Liares J. The VISA /GISA problem:therapeutic implications[J].
Clin Microbiol Infect,2001,7(Suppl) :8 - 15.
[10]张小青,易 婷,林春婵,等. 医院感染现患率调查与分析[J].
中华医院感染学杂志,2005,15(12):1352 - 1354.
[11]刘 佳,谢秀丽,牛天贵. 一株抑耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
(MRSA)芽孢杆菌的筛选与鉴定[J]. 中国农业大学学报,
2007,12(6):20 - 23.
[12]徐 琳,徐佳洁,刘巧莉,等. 西北部分地区苦马豆根瘤菌的遗
传多样性[J]. 生物多样性,2009,17(1):69 - 75.
[13]马溪平,邱 媛,徐成斌,等. 制药废水处理系统微生物群落动
态变化的 ERIC - PCR指纹图谱分析[J]. 辽宁大学学报:自然
科学版,2008,35(2):158 - 161.
[14]唐启义,冯明光. DPS 数据处理系统:实验设计、统计分析及数
据挖掘[M]. 北京:科学出版社,2007.
[15]汪雅萍,陈同钧. 十一种中草药对细菌的体外抑菌作用分析
[J]. 上海医学检验杂志,1999,14(4):206 - 207.
[16]杨明炜,陆付耳,徐丽君,等. 20 种清热解毒中药对耐甲氧西林
金黄色葡萄球菌体外抑菌的初步观察[J]. 中国药师,2006,9
(2):141 - 142.
[17]左国营,王根春,徐贵丽,等. 30 种中草药提取物体外抗 MRSA
的筛选研究[J]. 中国现代应用药学,2006,23(4):293 - 295.
[18]黄惠琴,吕家森,张开山,等. 一株抗耐甲氧西林金黄色葡萄球
菌(MRSA)的海洋放线菌的鉴定及系统发育分析[J]. 中国海
洋药物,2004,23(6):23 - 26.
[19]高正航. 霸王岭土壤抗 MRSA 活性放线菌的筛选及菌株
Gda031、Gda0305 发酵工艺的优化[D]. 儋州:华南热带农业大
学,2006.
[20]张守村,韩 松,黄晓艳,等. 一株抗 MRSA 内生细菌的鉴定及
其活性物质的初步研究[J]. 微生物学通报,2011,38(6):860 -
864.
—503—江苏农业科学 2014 年第 42 卷第 2 期