全 文 ：乳白香青分泌吲哚乙酸内生细菌
的 16S rDNA鉴定
李　鹏 ,陈秀蓉 ,李振东 ,赵　聪 ,张日俭
(甘肃农业大学 草业学院 ,草业生态系统教育部重点实验室 ,中—美草地畜牧业
可持续发展研究中心 ,甘肃 兰州　730070)
摘要:对乳白香青2株分泌吲哚乙酸(IA A)的内生细菌的 16S rDNA基因片段进行扩增 、测序 ,并与
GenBank 中的 4条相似序列进行比对分析 ,构建系统发育树 。研究结果表明 , 2菌株分泌 IAA的能力均
较强 ,其 IAA的产量分别为 62.03和 36.50μg/mL。形态学鉴定表明 , RA5菌体为杆状 ,大小为(2.22
～ 4.50)μm×(1.00 ～ 1.22)μm ,革兰氏阳性;RC5菌体杆状 ,大小(1.59 ～ 2.98)μm×(0.62 ～ 1.04)μm ,
革兰氏阴性 。系统学分析初步确定 RA5为蜡状芽孢杆菌(Baci llus cereus), RC5为芽孢杆菌属(Baci l-
lus)的成员 。
关键词:吲哚乙酸;内生细菌;16S rDNA
中图分类号:Q 94;S 482.8　　文献标识码:A　　文章编号:1009-5500(2009)02-0006-05
　　乳白香青(Anaphal is lactea)别名大矛香艾 、大白
矛香 ,菊科香青属多年生草本植物 ,高 15 ～ 30 cm ,全
株密被灰白色绒毛 。根茎木质化 , 分枝。茎丛生 , 直
立。生长于山坡 、草地 、灌木丛中。分布于我国西北地
区。全草具有活血散瘀 、平肝潜阳 、祛痰 、外用止血的
功效[ 1] 。
大多数细菌都能产生 3-吲哚乙酸(IAA)或类 3-吲
哚乙酸化合物 ,连翠飞[ 2] ,张霞[ 3] ,徐幼平[ 4] 等报道 ,假
单胞菌 ,芽孢杆菌和阴沟肠杆菌等属的一些种能分泌
吲哚乙酸或赤霉素 ,这些物质均能有效地促进植物的
生长 。Lidija H A [ 5] 和 Thakuria D[ 6] 等的研究发现 ,
植物根际细菌具有分泌 IAA 的能力 ,对植物有促生作
用。Suret te M A 等[ 7] 研究发现 ,胡萝卜中 83%的内
生细菌对植物有促生作用;涂抹有拮抗内生细菌的豌
豆种子要比未涂抹的种子萌发率高 ,将它们同时播种
在含有枯萎病菌或无菌的土壤中 ,前者的根系和芽要
比后者健壮 。Nejad P 等[ 8]的研究也发现 ,利用内生细
收稿日期:2008-12-09;修回日期:2008-11-20
基金项目:甘肃农业大学草业学院草业科学国家重点学科
学术骨干科研项目暨草业生态系统教育部省部
共建重点实验室(CY-GG-2006-01)资助
作者简介:李鹏(1983-), 男 ,河北保定人 , 在读硕士。
陈秀蓉为通讯作者。
菌处理油菜和西红柿的种子能够加快其生长和明显降
低枯萎病发病率 。何红[ 9] 在研究内生枯草芽孢杆菌
BS-1和 BS-2菌株对辣椒和白菜促生作用机制中也发
现 ,用菌株培养液浸种后 , 可使植株体内的生长素
(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZR4)等植物内源激素
含量大幅度提高 ,而脱落酸(ABA)含量却有所下降。
但对在特殊生境下的植物的内生细菌及其作用研究报
道的极少 。因此 ,以生长在高寒草地的乳白香青为研
究对象 ,对 2株具有分泌植物生长素(IAA)的乳白香
青内生细菌进行了分子鉴定 ,旨在为进一步开发和利
用植物内生细菌资源提供依据。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　供试菌株　供试菌种来自于甘肃农业大学草
地微生物多样性实验室保藏的 2 株乳白香青内生细
菌 ,编号为 RC5 、RA5。
1.1.2　培养基　采用牛肉膏蛋白胨培养基 , NB培养
基和 King 培养基 [ 10 , 11] 。
1.1.3　仪器　S2000型分光光度计 、IOC402.XXI.C
型控温振荡器 、M JX 智能霉菌培养箱 、HH 1.5 Plus
型超净工作台 、BIO-RAD icycler PCR 仪 、BIO-RAD
凝胶成像系统 。
6 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2009　　No.2　　(Sum　N o.133)
1.2　方法
1.2.1　分泌 IAA 能力的定性测定　采用 Salkow ski
比色法定性测定内生细菌分泌植物生长素[ 11] 。
1.2.2　分泌 IAA能力的定量测定　标准曲线采用纯
3-IAA 制作 。配制 5 、10 、15 、20 、25 、30 、40 、60 、80 、
120 、140 μg/mL 的 3-IAA溶液 ,分别取上述 3-IAA 溶
液 1 mL 加比色液 ,在黑暗中静置 0.5 h ,取出立即用
分光光度计测定 D530nm值 。制作标准曲线。将在液体
培养基中培养的菌悬浮液 , 在 10 000 r/min 离心 10
min ,取上清液 1 mL 加比色液 ,在黑暗中静置 0.5 h ,
取出立即用分光光度计测定 D530nm值[ 11] 。
1.2.3　形态特征及染色反应　将 RC5 、RA5菌株在
牛肉膏蛋白胨培养基培养 36 h ,观察培养性状 ,并进行
革兰氏染色 、芽孢染色及菌体大小 、运动性等测定 。
1.2.4　细菌基因组 DNA 的提取　细菌基因组 DNA
的提取采用 CTAB 法[ 12] ,略加改进 。将 RA5 、RC5 在
NB培养液中 28 ℃振荡(120 r/min)培养 36 h的目的
菌体在4 ℃, 12 000 r/min离心 5 min ,收集菌体;无菌
水洗涤菌体两次 ,晾干菌体 ,将菌体悬浮于 567 μL TE
中;加入 30 μL 100g/L SDS ,加入 3 μL 蛋白酶 K (20
mg/mL)混匀后 37 ℃保温 1 h;加入等体积苯酚/氯
仿/异戊醇混匀 ,12 000 r/min 离心 10 min ,去除蛋白
沉淀收集上清液于另一离心管中;加入 0.6 体积异丙
醇 ,混合均匀 ,12 000/min离心 10 m in ,弃液相;加入 1
mL 700 mL/L 酒精洗涤 DNA 两次 ,自然晾干无水乙
醇;将 DNA样品溶于 50 μL TE 缓冲液 , -20 ℃下保
存备用。取 5 μL 样品在 10 g/L 琼脂糖凝胶上 80 V
电压下电泳 ,确定样品的纯度和浓度。
1.2.5　引物设计　根据细菌 16S rDNA 两端的保守
序列 ,设计 1对细菌的通用引物 ,用于 PCR扩增 ,引物
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 。引物序
列:5 -AGA G TT TGA TCA TGG CTC AG-3 ,
5 -GG T TAC CTT G T T ACG ACT T -3 。
1.2.6　PCR反应体系　模板 10×buf fer 5 μL , 5 mM
dN TP 1 μL , 引物 (10 μM)各 1 μL , TaqDNA 酶(2
U/μL)0.1μL ,模板 DNA 1μL ,(以加超纯水 1 μL 为
阴性对照)补 ddH 2O至 50μL。
1.2.7　PCR扩增反应条件　94 ℃预变性 5 min;94
℃变性 50 s ,48 ℃退火 50 s ,72 ℃延长 1 min ,32个循
环;72 ℃下延伸 8 min。以上扩增条件 ,根据预实验结
果优化组合而得出。
扩增后 ,取 5μL 的扩增样品在 10 g/ L 的琼脂糖
凝胶上 80 V 电压下进行电泳检测 ,将亮度好 、纯度高
的特异性条带(16S rDNA , 1 500 bp 左右)的 PCR产
物于-20 ℃下保存待测序 。
2　结果与分析
2.1　IAA的定性测定
测定结果显示 , RC5 、RA5菌株在比色反应中均变
为明显红色 ,而对照 CK1在比色液中加 20 μg/mL 的
IAA仅略变粉红色 ,CK2 在空白培养液中加比色液和
仅有培养液的空白对照均无色 ,表明 RC5 、RA5 分泌
IAA 的量较多 ,故进一步对 2菌株分泌 IAA 能力进行
定量测定 。
图 1　两株菌分泌 IAA定性测定结果
Fig.1　The qualitative analysis result of two
secretory IAA strains
注:CK1 为比色液加 20 μg/m L的 IAA , CK2 为空白
培养液加比色液
2.2　IAA定量测定
图 2 和图 3 为采用纯 3-IAA 制作标准曲线。将
RA5和 RC5菌株在 King 液体培养基中培养 12 d ,测
定 D530nm值 ,并分别带入 PC比色液和 S2比色液标准曲
线(图 2 ,图 3),计算出每菌株分泌 IAA 的量 ,根据 PC
比色液的测定范围(0.3 ～ 20μg/mL)和 S2比色液的测
定范围(5 ～ 200 μg/mL)确定应用哪个标准曲线。实
验结果表明 , RA5在加色氨酸和不加色氨酸的 2种培
养液中培养 ,测得的 D530nm值分别为 1.61和 1.08 ,其
对应的 IAA 分别产量为 60.91和 62.03 μg/mL ;RC5
测得的D 530nm值分别为0.65和0.68 ,其对应的 IAA 产
7草原与草坪　　2009年　　第 2期　　总第 133期
量分别为 34.55 和 36.50 μg/mL。可见 RA5 分泌
IAA 的能力比 RC5强。
图 2　PC标准曲线
Fig.2　Standard curve of PC solution
图 3　S2标准曲线
Fig.3　Standard curve of S2 solution
2.3　菌株鉴定
2.3.1　形态特征及染色反应　RA5 菌体杆状 ,大小
为(2.22 ～ 4.50)μm ×(1.00 ～ 1.22)μm ,革兰氏阳
性 ,芽孢生在菌体中间。菌落平展 ,近圆形 ,灰白色 ,无
光泽 ,不透明 ,边缘不整齐 ,牛肉膏蛋白胨培养基培养
3 d后的直径为 3 ～ 6 mm(图 4)。菌体具运动性 。
图 4　RA5 单菌落 、革兰氏染色 、芽孢染色照片
Fig.4　The photographs of single colony , gram
stain and spore staining of RA5
RC5菌体杆状 ,大小(1.59 ～ 2.98)μm×(0.62 ～
1.04)μm ,革兰氏阴性 ,芽孢生在菌体中间 。菌落近圆
形 ,灰白色 ,有光泽 ,稍突起 ,半透明 ,边缘整齐 ,牛肉膏
蛋白胨培养基培养 3 d 后的直径为 3 ～ 6 mm(图 5)。
菌体具运动性。
图 5　RC5 单菌落 、革兰氏染色 、芽孢染色照片
Fig.5　The photographs of single colony , gram
stain and spore staining of RC5
2.3.2　株菌的分子学鉴定与系统发育学分析　扩增
2菌株的 16S rDNA 基因片段 ,得到 RA5 基因片段长
度 1 461 bp , RC5基因片段为 1 201 bp(图6)。将 2序
列在 GenBank 中用 Blast 软件比对分析 ,结果表明 , 2
种菌均属于芽孢杆菌属(Baci l lus)。其中 RA5与蜡状
芽孢杆菌(Baci l lus cereus)的序列相似性为 99%[ 12] ,
初步确定 RA5 与蜡状芽孢杆菌(Baci l lus cereus);
RC5与已报道的芽孢杆菌属的成员相似性为 99%,初
步确定 RC5为芽孢杆菌属的成员 ,种待定 。目前 2菌
株在 GenBank 中已登录 , 登录号分别为 FJ263370
(RA5)和 FJ263382(RC5)。同时在 GenBank 中选取
了 4个与测定序列相似性最高的基因序列 ,通过 Clau-
stle(1.8)进行多重序列比较 ,再用 Mega4软件中邻接
法绘制细菌的系统发育树(图 7),其中 RC5与登录号
为 AB330414 、AB300599的芽孢杆菌属(Baci l lus sp.)
的成员聚在一起 , 而 RA5 与登录号为 Z84590 和
Z84579的蜡状芽孢杆菌(Baci llus cereus)聚在一起 ,
表明它们之间的同源性很高 。
图 6 　2 株内生细菌 PCR产物电泳图
Fig.6　PCR amplification of two endophytic bacteria strains
3　讨论
(1)细菌分泌 IAA 的量差异较大 ,如姚拓[ 13] ,席琳
乔[ 14] ,李法峰[ 15] ,吴瑛[ 16] 等报道的细菌分泌 IAA 的量
为2.16 ～ 36.1μg/mL 。实验中来自于乳白香青的2
8 Grassland and Turf　　(Bimonthly)　　2009　　No.2　　(Sum　N o.133)
图 7　RA5、RC5系统进化树
Fig.7　Phylogenetic tree of RA5 and RC5
株内生功菌均能分泌产生 IAA ,其 IAA 产量分别为
36.50μg/mL(RC5)和 62.03μg/mL(RA5),均高于文
献报道 ,最高可高出十几倍。因此 ,这 2株内生细菌具
有良好的开发前景 ,有待进一步开发利用。
(2)实验中的 2株内生细菌 ,在培养 36 h 时进行
革兰氏染色 ,其中 RA5 为阳性 ,而 RC5为阴性 ,这与
《伯杰氏细菌鉴定手册》[ 17] 中描述芽孢杆菌幼龄菌在
革兰氏染色时有阴性或阳性 2种可能相一致 。另外 ,
根据 2 菌株 16S rDNA 基因测序对比结果表明 , RA5
与 Baci l lus cereus 、Bacil lus weihenstephanensis 、Ba-
ci l lus mycoides 和Baci llus thuringiensis 4 个种的相
似性系数均为 99%,但根据报道[ 18] ,4个种中只有Ba-
ci l lus cereus具有分泌 IA A 的能力 ,因此将 RA5 鉴定
为 Baci l lus cereus 。RC5为 Baci l lus sp.的成员 ,需进
一步确定种。
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(下转 13 页)
9草原与草坪　　2009年　　第 2期　　总第 133期
A preliminary study on mutagenic effect of 60Co-γ
ray irradiation in Roegneria
WANG Jian-li1 , ZHANG Yue-xue1 ,SHEN Zhong-bao1 ,
TANG Feng-lan1 , LI Dao-ming1 ,ZHANG Rui-bo1 ,
PAN Duo-feng1 , ZHONG Peng2
(1.Grass and Science I nst itute , Heilongj iang Academy o f Agricultural S ciences , Harbin 150086 ,China;
2.Soybean R esearch Insti tute of Hei long j iang Acadecy o f Agricultural S ciences , Harbin 150086 ,China)
Abstract:Suitable induced mutation doses and biology proper ty v ariat ion were studied by using dry seeds of
tw o genotypes of Roegneria gmelini i and Roegneria kamoj i i rradiated by
60
Co-γray wi th di fferent do ses of 10 ,
20 , 30 ,40 and 50 Gy.The results show ed that 60Co-γray have promo ted germination rate of Roegneria kamoj i ,
The best mutation dose is 40 Gy in seed germinating of tw o genotype.Tiller number of tw o genotypes w ere
higher t reated w ith 10 , 20 ,30 ,40 Gy than control.The radiat ion dose of 50 Gy has restrained tiller number of
Roegneria kamoj i.Plant height of Roegneria gmelini i was higher than control t reated wi th 60Co-γray Irradia-
tion than control w hile the plant height of Roegneria kamoj i was low er than contro l.The radiation t reatment
rest rained the ratio of heading of Roegneria gmelini i.The panicle leng th and the average number o f panicle of
tw o genotype s have a high co rrelation w ith radiation do ses , they w ould be enhanced w ith increase of radiat ion
do ses.The experiment also show s that appropriate dose to biological characters w as 30 ,40 Gy.
Key words:60Co-γray;Roegneria sp.;biological cha racter;mutagenic ef fect
(上接 9 页)
Identification of two endophytic bacteria strains
isolated from Anaphalis lactea with
IAA secretion by 16S rDNA
LI Peng ,CHEN Xiu-rong , LI Zhen-dong , ZHAO Cong ,ZHANG Ri-jian
(P ratacultural College ,Gansu Agricultural Universi ty ,K ey Laboratory o f Grassland E cosystem Ministry
o f E ducat ion ,S ino-U .S.Centers for Grazing land Ecosy stem S ustainabi l ity , Lanz hou ,730073 ,China)
Abstract:Identification of tw o entophy tic bacteria st rains iso lated f rom Anaphal is lacteal with IAA secre-
tion by 16S rDNA were carried out.The result show ed that IAA secretion amount o f tw o st rains , RA5 and
RC5 , is 62.03 μg/mL and 36.50 μg/mL respectively .RA5 strain is rod-shaped w ith a size of(2.22 ～ 4.50)μm
×(1.00 ～ 1.22)μm and G ram-posit ive , while RC5 show s rod-shaped w ith a size of(1.59 ～ 2.98)μm ×(0.62 ～
1.04)μm and Gram-negat ive.RA5 can be identified as Baci llus cereus and RC5 belonged to Baci l lus sp.initial-
ly by 16S rDNA method.
Key words:IAA;endophy tic bacteria;16S rDNA
13草原与草坪　　2009年　　第 2期　　总第 133期